內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)CHOP在SAH后細胞凋亡中的作用及機制

郝璞珩，王 輝，衛(wèi) 萍，金 林，陳 斌

(1. 西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710077；2. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 康復(fù)科，陜西西安 710061；3. 西安醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710021)

自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)的發(fā)病率為1/100萬，占腦血管病的15%。SAH患者的預(yù)后主要取決于腦血管痙攣(cerebral vasospasm, CVS)和早期腦損傷(early brain injury, EBI)。既往在CVS方面做了大量的研究，但相應(yīng)的治療卻沒有明顯改善患者的預(yù)后[1]。EBI與SAH患者的預(yù)后密切相關(guān)。EBI是指SAH后72 h內(nèi)腦組織發(fā)生的一系列病理生理改變，主要包括腦水腫、血腦屏障通透性障礙、細胞炎性反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡等[2]，其確切機制目前尚不清楚。有學(xué)者認(rèn)為細胞凋亡在其中發(fā)揮著重要作用[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)對于細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成和修飾非常重要，當(dāng)ER功能發(fā)生障礙時，被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)。在許多病理生理狀態(tài)下，ERS可導(dǎo)致細胞凋亡[4-5]，但是，其發(fā)病機制復(fù)雜，而有關(guān)ERS在自發(fā)性SAH后EBI中的作用國內(nèi)外文獻均鮮有報道。本研究通過檢測大鼠ER相關(guān)CHOP的表達及神經(jīng)元凋亡變化，初步探討ERS在SAH后神經(jīng)元凋亡中的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組成年健康雄性SD大鼠114只(購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心)，體質(zhì)量(300±50)g。根據(jù)隨機數(shù)字表法隨機分為空白組、SAH組、SAH+sh-con組和SAH+sh-RNAi組，后3組再隨機分為6個亞組，分別為建模后l、6、12、24、48、72 h亞組(n=6)。

1.2SAH模型制作按BEDERSON等[6]的方法改良后制作大鼠SAH模型，具體驟如下：大鼠術(shù)前禁食禁水6 h，麻醉后仰臥位固定，消毒鋪巾，取頸部正中切口，分離右側(cè)頸總、頸外和頸內(nèi)動脈，動脈夾臨時阻斷頸總及頸內(nèi)動脈后將頸外動脈結(jié)扎并切斷，拉直使其與頸內(nèi)動脈成一直線，將直徑0.265 mm漁線從右側(cè)頸外動脈殘端置入頸內(nèi)動脈，插入深度為21～22 mm，刺破血管，維持15 s后將漁線抽出，關(guān)閉縫合。SAH組僅造模，而SAH+sh-con組和SAH+sh-RNAi組大鼠在腦室注射(具體見1.3)慢病毒質(zhì)粒(購于上海吉凱公司)48 h后，用上述血管內(nèi)穿刺法制作大鼠SAH模型。

1.3腦室內(nèi)注射給藥750 mL/L乙醇消毒后，沿中線切開大鼠顱頂部皮膚，長約2.5 cm，暴露顱骨。在顱骨上標(biāo)出入針點坐標(biāo)(前囟后1 mm，旁開1.5 mm，深3.5 mm)，然后在標(biāo)記點處鉆孔。鉆孔后小針刺穿硬腦膜，將套管置經(jīng)鉆孔處緩慢進入。進入左側(cè)側(cè)腦室后，經(jīng)微型注射泵向?qū)φ战M左腦室中注射PBS，SAH+sh-con組注射入LV-CMV-control(10 μL，109 TU/mL)，SAH+sh-RNAi組注射入LV-CMV-CHOP sh-RNAi(10 μL，109 TU/mL)?？瞻捉M及SAH組不做腦室內(nèi)給藥。

1.4神經(jīng)行為學(xué)評分及處理參照Garcia神經(jīng)功能評分法[7]對各組大鼠進行功能評分。評分中包含6個項目，最高分為18分，最低分為5分。分別計算出實驗各組評分的平均值。評分后開顱取腦，迅速分離出大鼠兩側(cè)海馬，切除標(biāo)本。一部分標(biāo)本置于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于Western blot和Real-time PCR檢測；另一部分標(biāo)本置入40 g/L多聚甲醛中固定，制作石蠟切片用于TUNEL檢測。

1.5Real-timePCR檢測Bcl-2、Bim、Caspase-3mRNA表達將各組海馬組織塊剪切成小塊后放入預(yù)冷平皿中的鋼網(wǎng)上，加入DEPC處理的PBS或生理鹽水(約1 mL/30 mg組織)，用研磨棒將組織研磨擠壓過鋼網(wǎng)，收集過網(wǎng)懸液，取200 μL放入eppendorf管中，采用TaKaRa公司的RNA提取試劑盒抽提組織RNA并鑒定純度，Prime Script?RT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并進行Real-time PCR反應(yīng)，25 μL反應(yīng)體系：12.5 μL SYBR GREEN、10 μL DDH2O、0.25 μL上游引物、0.25 μL下游引物和2 μL cDNA。反應(yīng)條件如下：50 ℃ 2 min， 95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。在NCBI GenBank中查SD大鼠Bcl-2、Bim、Caspase-3的基因序列，用Primer 7.0軟件設(shè)計引物：Bcl-2上游引物5′-GGATGCCTTTGTGGAACTGT-3′，下游引物5′-GGTGCTTGGCAATTAGTGGT-3′；Bim上游引物5′-ATCTCAGAGCAATGGCTTCC-3′，下游引物5′-ATTCGTGGGTGGTCTTCG-3′；Caspase-3上游引物5′-GAGACAGACAGTGGAACTGACGA-TG-3′，下游引物5′-GGCGCAAAGTGACTGGAT-GA-3′；內(nèi)參β-actin上游引物5′-ACGGTCAGGTC-ATCACTATCG-3′，下游引物5′-GGCATAGAGG-TCTTTACGGATG-3′，由TaKaRa公司合成并檢查引物的特異性和擴增能力。PCR結(jié)果采用Ct值相對定量法進行比較。

1.6Westernblot檢測CHOP蛋白的表達各組均稱取30 mg海馬組織，分別放入無酶EP管中，各加入150 μL裂解液，超聲粉碎組織，4 ℃ 13 000 r/min離心15 min(離心半徑10 cm)，取上清液。將提取總蛋白調(diào)至10 μg/mL，加樣量總蛋白不超過200 μg。轉(zhuǎn)膜后加入一抗(CHOP 1∶500)及β-actin 1∶1 000)，常規(guī)室溫?fù)u床孵育并洗膜、曝光、顯影。蛋白條帶用Quantity One軟件分析，計算各時間點CHOP/β-actin的比值。

1.7TUNEL法檢測細胞凋亡海馬組織常規(guī)制作石蠟切片，脫蠟、水化，胰蛋白酶K消化15 min，加入30 μL TUNEL反應(yīng)液(酶溶液∶標(biāo)記液=1∶9)，其余實驗步驟按照TUNEL試劑盒說明書操作，在光學(xué)顯微鏡下觀察凋亡細胞并計數(shù)。細胞內(nèi)有棕黃色顆粒為陽性細胞，陽性細胞染色質(zhì)邊緣化、濃縮，核膜破裂，晚期可出現(xiàn)凋亡小體。每張切片隨機取3個視野(×400)，統(tǒng)計每個視野的陽性細胞數(shù)，計算出陽性細胞的平均值。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)；進行相關(guān)性分析時，方差齊時用Pearson檢驗，方差不齊時用Spearman檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1神經(jīng)行為學(xué)評分空白組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分平均值為15.22±0.76，建模后1 h SAH組、SAH+sh-con組和SAH+sh-RNAi組大鼠與空白組比較，出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能障礙，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；SAH組、SAH+sh-con組和SAH+sh-RNAi組大鼠在建模6、12、24、48 h后與空白組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，SAH+sh-RNAi組與SAH組、SAH+sh-con組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1各組不同時間段神經(jīng)功能評分

與空白組比較，*P<0.05；與SAH組比較，#P<0.05；與SAH+sh-con組比較，△P<0.05。

2.2Bim、Caspase-3、Bcl-2mRNA表達情況Caspase-3、Bim mRNA在SAH組、SAH+sh-con組的表達較空白組明顯增多(P<0.05)，在SAH組不同時間點亞組中，隨時間延長而逐漸增多，至24 h組增多最明顯，其后逐漸下降，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SAH+sh-RNAi組表達較空白組增多(P<0.05)，但是較SAH組、SAH+sh-con組減弱(P<0.05，圖1)。

SAH組、SAH+sh-con組Bcl-2 mRNA與空白組比較明顯減少(P<0.05)。在SAH組不同時間點中，隨時間增長而表達逐漸減少，至24 h組減少最明顯，其后逐漸升高，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SAH+sh-RNAi組表達較空白組降低(P<0.05)，但是較SAH組、SAH+sh-con組升高(P<0.05，圖1)。

2.3CHOP蛋白的表達結(jié)果空白組CHOP蛋白表達微弱，SAH組、SAH+sh-con組與空白組比較明顯增多(P<0.05)，但兩組在不同時間點比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。SAH+sh-RNAi組CHOP蛋白表達與空白組比較增多(P<0.05)，但是較SAH組、SAH+sh-con組下降(P<0.05，圖2)。

2.4神經(jīng)元凋亡及與CHOP蛋白表達的相關(guān)性分析顯微鏡下觀察TUNEL檢測結(jié)果顯示，空白組凋亡細胞較少；SAH組、SAH+sh-con亞組中，1 h出現(xiàn)少量凋亡細胞，6 h凋亡細胞數(shù)進行性增多，12 h凋亡細胞明顯增多，24 h凋亡細胞達到峰值，細胞著色也較深，48 h凋亡細胞逐漸下降，72 h凋亡細胞數(shù)目明顯減少。SAH組和SAH+sh-con組內(nèi)不同時間點，與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SAH-sh-RNAi組凋亡細胞較空白組增多(P<0.05)，但較SAH組、SAH-sh-con組減少(P<0.05)。相關(guān)性分析顯示CHOP表達與神經(jīng)元凋亡有顯著的相關(guān)性(r=0.832，P<0.05，圖3)。

3 討 論

以往對于自發(fā)性SAH的研究多集中在CVS方面。近些年發(fā)現(xiàn)，EBI可能是導(dǎo)致SAH患者死亡和決定預(yù)后的重要因素[8]，也可能成為今后的研究熱點[9]。細胞凋亡是在基因調(diào)控下的程序性死亡，成年個體多在病理情況下可見神經(jīng)元凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元凋亡是SAH后EBI的重要表現(xiàn)形式[10-11]，是決定SAH最終預(yù)后的關(guān)鍵因素之一。引起細胞凋亡的途徑主要有死亡受體介導(dǎo)的細胞凋亡途徑、線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡途徑[12]。本研究重點討論內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡途徑在SAH后的作用機制。

研究發(fā)現(xiàn)，在諸多病理生理狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能損害可導(dǎo)致細胞凋亡。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能發(fā)生障礙時，大量錯誤折疊的蛋白集聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)被破壞，A、C、E：各組Caspase-3、Bim、Bcl-2 mRNA表達變化；B、D、F：不同時間點各亞組Caspase-3、Bim、Bcl-2 mRNA表達變化。與空白組比較，*P<0.05；與SAH組、SAH+sh-con組比較，#P<0.05。

圖1各組Caspase-3、Bim、Bcl-2mRNA表達的比較

Fig.1 The mRNA expressions of Caspase-3, Bim, and Bcl-2 in the experimental groups

圖2不同時間點各亞組CHOP蛋白表達的變化

Fig.2 The expressions of CHOP protein in the experimental groups at different internals

與空白組比較，*P<0.05；與SAH組、SAH+sh-con組比較，#P<0.05。

從而誘發(fā)ERS。當(dāng)發(fā)生缺血缺氧、同型半胱氨酸血癥、病毒感染等可啟動ERS[13]，持久的ERS造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷，并引起細胞凋亡[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在SAH后1 h到24 h的過程中，CHOP的表達呈上升趨勢，在24 h時達到高峰，與空白組對比有明顯差異。

圖3神經(jīng)元凋亡的變化及其與CHOP蛋白表達的相關(guān)性分析

Fig.3 Changes of neuronal apoptosis and its correlation with CHOP protein expression

A：不同時間點各亞組神經(jīng)元的凋亡變化；B：CHOP蛋白表達與神經(jīng)元凋亡的相關(guān)性分析。與空白組比較，*P<0.05；與SAH組、SAH+sh-con組比較，#P<0.05。

這一結(jié)果提示在SAH后早期有ERS的出現(xiàn)。并且TUNEL檢測結(jié)果顯示在SAH后24 h時神經(jīng)元凋亡最顯著，明顯高于空白組，且在24 h時神經(jīng)行為學(xué)評分最低。這3個指標(biāo)在同一時間點變化一致，說明在SAH后早期發(fā)生ESR，出現(xiàn)CHOP大量表達，引起神經(jīng)元凋亡。

研究表明，在腦缺血中ERS上調(diào)可抑制神經(jīng)元的凋亡。ERS誘發(fā)的凋亡有3種途徑：CHOP/GADD153通路、Caspase通路、JNK通路[15]。IRE-1通路的長時間激活可引起細胞凋亡，活化的IRE-1可隨后激活JNK誘導(dǎo)細胞凋亡，還可以激活p38絲裂原活化蛋白激酶誘導(dǎo)CHOP的表達以及直接或間接激活Caspase-12，從而誘導(dǎo)細胞凋亡[16]。CHOP通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細胞凋亡的3個通路之一[17]，CHOP主要位于細胞核，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[18]。CHOP主要通過增加細胞對氧化應(yīng)激的敏感性、上調(diào)凋亡基因Bax和下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2來介導(dǎo)細胞凋亡[19]，通過調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白家族成員的表達水平，促進Bim轉(zhuǎn)錄而抑制Bcl-2表達，活化Bax/Bak，促使細胞凋亡[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)SAH組CHOP蛋白表達比空白組明顯增多，說明SAH后CHOP蛋白表達明顯增高。應(yīng)用siRNA干擾后CHOP蛋白下降，相關(guān)性分析證實了SAH后細胞凋亡與CHOP有關(guān)，說明ERS參與了SAH后神經(jīng)元損傷。

本研究結(jié)果表明，CHOP siRNA可以為蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠模型提供神經(jīng)保護作用。通過抑制凋亡相關(guān)基因的表達，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達顯著上調(diào)，進而達到減輕凋亡、改善大鼠神經(jīng)功能的目的。這將為今后深入研究SAH后EBI的發(fā)生機制及尋找針對性的治療策略提供理論依據(jù)。