miR-134-3p通過(guò)靶向調(diào)節(jié)ADAM9/EGFR/AKT 抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的活性和遷移

付立芳，孫 杰

(1. 臨沂市中醫(yī)醫(yī)院，山東臨沂 276000；2. 山東醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校中醫(yī)學(xué)教研室，山東臨沂 276000)

結(jié)腸癌是一種常見(jiàn)的嚴(yán)重威脅全人類健康的消化道腫瘤。在我國(guó)，結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率分別位居癌癥的第五位和第三位，且呈逐年上升的趨勢(shì)。金屬蛋白酶解離素9(a disintegrin and metalloprotease 9, ADAM9)是一類膜錨定的金屬蛋白酶家族成員，廣泛參與了細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。有研究發(fā)現(xiàn)，ADAM9通過(guò)活化表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)/蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)通路而極大地促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活[1]。在結(jié)腸癌相關(guān)的研究中，ADAM9過(guò)表達(dá)不僅能促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲，也能增加其耐藥性[2-3]，由此看來(lái)，ADAM9很可能是治療結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的一個(gè)潛在靶基因。

miRNAs是一類內(nèi)源性的非編碼小RNA，能通過(guò)抑制某些特定靶基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控癌癥的發(fā)生發(fā)展，例如，miR-126 通過(guò)靶向調(diào)控ADAM9抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[4]。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，由miR-134前體3′臂剪切產(chǎn)生的miR-134-3p具有抑制卵巢癌干細(xì)胞增殖分化的功能[5]。全基因組篩選鑒定發(fā)現(xiàn)miR-134 通過(guò)靶向整合素β1(integrin β1)抑制肝癌細(xì)胞的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[6]。盡管已知miR-134的表達(dá)在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中明顯下調(diào)[7]，并與腫瘤的轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)相關(guān)，但其具體作用機(jī)制尚不明確。本文通過(guò)檢測(cè)miR-134-3p對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞存活和遷移的作用，進(jìn)一步調(diào)查miR-134-3p和ADAM9之間的靶向關(guān)系，以期為結(jié)腸癌的治療提供潛在藥物靶點(diǎn)和相關(guān)理論支持。

1 材料與方法

1.1材料結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480由第四軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞工程中心提供；結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、RKO和正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460購(gòu)自上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；青/鏈霉素購(gòu)自沃爾森生物有限公司；小鼠抗人ADAM9抗體購(gòu)自美國(guó)RD公司；兔抗人EGFR和p-EGFR抗體購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司；人抗兔AKT和p-AKT(Ser 473)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；兔抗小鼠β-actin抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德公司；CCK-8增殖檢測(cè)試劑盒和熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Sigma公司；實(shí)時(shí)定量RT-PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；PCR引物由廣州銳博生物有限公司設(shè)計(jì)并合成；蛋白質(zhì)提取試劑盒和ECL發(fā)光液等購(gòu)自Millipore公司；脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 取出凍存的SW480、HCT116、RKO和NCM460細(xì)胞，復(fù)蘇后培養(yǎng)于含100 mL/L胎牛血清、青霉素和鏈霉素(各100 μg/L)的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在50 mL/L CO2、37 ℃、飽和濕度下經(jīng)2.5 g/L胰酶?jìng)鞔囵B(yǎng)，每2～3 d傳代1次。待細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于分子生物學(xué)檢測(cè)或細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.2.2實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)基因mRNA的表達(dá) Trizol裂解細(xì)胞后提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，經(jīng)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermontas)將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，最后采用SYBR熒光定量試劑盒在熒光定量PCR儀上擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)各基因mRNA的表達(dá)情況。反應(yīng)條件為：90 ℃預(yù)變性10 min，按照95 ℃變性25 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s的循環(huán)擴(kuò)增40次。以GAPDH為內(nèi)參。

1.2.3Western免疫印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) RIPA裂解液(美國(guó)Thermo公司)裂解細(xì)胞后提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，吸取40 μg蛋白樣品測(cè)定蛋白濃度，然后用12% SDS-PAGE按分子質(zhì)量大小分離蛋白質(zhì)。切膠，將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用含50 g/L脫脂奶粉的TBST室溫下封閉目的蛋白1.5 h，再用ADAM9、EGFR、p-EGFR、AKT或p-AKT抗體于4 ℃下過(guò)夜孵育。用HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG室溫孵育目的蛋白1 h。加ECL發(fā)光液顯影后分析蛋白條帶的灰度值。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 對(duì)數(shù)期的細(xì)胞以1×105密度接種于6孔板，待細(xì)胞達(dá)80%以上融合后，采用脂質(zhì)體3000孵育細(xì)胞48 h將50 nmol/L miR-134-3p mimic或miR-134-3p inhibitor轉(zhuǎn)染到SW480細(xì)胞。細(xì)胞分組為：Control、mimic NC、miR-134-3p mimic、Inhibitor NC、miR-134-3p inhibitor。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 離心收集轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，PBS清洗。按試劑盒說(shuō)明于2～8 ℃避光條件下加入5 μL Annexin V-FITC，孵育15 min后，于相同條件下加入10 μL PI孵育5 min。最后，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。

1.2.6CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 在miR-134-3p mimic或miR-134-3p inhibitor轉(zhuǎn)染細(xì)胞0、24、48、72、96 h后，每組分別加入10 μL CCK-8試劑于37 ℃、50 mL/L CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h。隨后測(cè)定各組細(xì)胞在450 nm處的A值，進(jìn)而繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.7Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以2×104密度接種于Transwell小室表面，上層小室含Matrigel基質(zhì)膠。細(xì)胞于37 ℃下孵育48 h，取出上層小室，將穿過(guò)膜的細(xì)胞收集于10 mL/L的多聚甲醛溶液，用2 mL/L的結(jié)晶紫溶液染色15 min。顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.8熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) PCR擴(kuò)增ADAM9-3′UTR-WT和ADAM9-3′UTR-MUT序列，將擴(kuò)增后的序列分別轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒psicheck-2中；構(gòu)建好的重組質(zhì)粒分別與miR-134-3p mimic或miR-134-3p inhibitor共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，72 h后收集細(xì)胞，嚴(yán)格按照Luciferase Reporter Gene Assay Kit說(shuō)明書操作實(shí)驗(yàn)。最后通過(guò)發(fā)光化學(xué)儀檢測(cè)螢火蟲(chóng)和海腎熒光比值。

2 結(jié) 果

2.1miR-134-3p在人結(jié)腸癌細(xì)胞系中低表達(dá)，而ADAM9高表達(dá)收集人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480、HCT116、RKO和正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了各細(xì)胞內(nèi)miR-134-3p的表達(dá)。單因素方差分析顯示：miR-134-3p的表達(dá)在不同細(xì)胞系之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.241，P=0.002)。與NCM460細(xì)胞相比，miR-134-3p在SW480、HCT116和RKO癌細(xì)胞中表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P<0.05)，且在SW480細(xì)胞中下調(diào)最為明顯(圖1A，表1)。Western免疫印跡發(fā)現(xiàn)ADAM9、EGFR和AKT的蛋白表達(dá)在不同細(xì)胞系之間存在顯著差異，與正常NCM460細(xì)胞相比，3種蛋白在結(jié)腸癌細(xì)胞系中均明顯上調(diào)(P<0.05，圖1B、C、表2)。這些結(jié)果表明miR-134-3p和ADAM9/EGFR/AKT可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制。

圖1miR-134-3p和ADAM9/EGFR/AKT在人結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)

Fig.1 Expressions of miR-134-3p and ADAM9/EGFR/AKT in the colon cancer cell lines

A：miR-134-3p在人結(jié)腸癌細(xì)胞系中低表達(dá)；B～C：ADAM9/EGFR/AKT在人結(jié)腸癌細(xì)胞系中高表達(dá)。與NCM460組相比，*P<0.05。

表1miR-134-3p在各細(xì)胞系中的表達(dá)

細(xì)胞系相對(duì)表達(dá)NCM4601.00±0.04SW4800.43±0.05*HCT1160.55±0.06*RKO0.64±0.04*F4.241P0.002

與NCM460細(xì)胞相比，*P<0.05。

表2ADAM9/EGFR/AKT在各細(xì)胞系中的表達(dá)

細(xì)胞系A(chǔ)DAM9EGFRAKTNCM4601.00±0.181.00±0.241.00±0.35SW4803.62±0.31*3.02±0.28*2.54±0.24*HCT1162.75±0.26*2.63±0.31*2.81±0.19*RKO3.10±0.30*3.31±0.22*2.23±0.20*F5.0074.6583.571P0.0010.0060.034

與NCM460細(xì)胞相比，*P<0.05。

2.2miR-134-3p抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的存活由于miR-134-3p和ADAM9在SW480細(xì)胞中的變化最為顯著，接下來(lái)的探究實(shí)驗(yàn)在SW480細(xì)胞中進(jìn)行。用miR-134-3p mimic或miR-134-3p inhibitor轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞以上調(diào)或抑制miR-134-3p的水平。各組細(xì)胞凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.123，P=0.001)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(9.0±1.7)%，miR-134-3p mimic轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率升高至(15.0±1.1)%，而miR-134-3p inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率為(5.9±1.2)%，與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2A、B，表3)。另外，我們用CCK-8試劑盒檢測(cè)了各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)(24、48、72、96 h)的增殖情況，重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示：①不同時(shí)點(diǎn)間的細(xì)胞增殖率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.261，P=0.005)；②不同組間細(xì)胞增殖能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.562，P=0.014)；③不同轉(zhuǎn)染組和觀察時(shí)間之間存在交互作用(F=3.508，P=0.009，圖2C，表4)。由此可見(jiàn)，miR-134-3p能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的存活。

圖2miR-134-3p抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的存活

Fig.2 miR-134-3p inhibited cell survival

A：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；B：miR-134-3p抑制了凋亡細(xì)胞的百分比；C：CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖。與對(duì)照組相比，*P<0.05。

表3miR-134-3p表達(dá)水平對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響

組別相對(duì)表達(dá)Control9.0±1.7Mimic NC9.8±2.0miR-134-3p mimic15.0±1.1*Inhibitor NC10.2±1.2miR-134-3p inhibitor5.9±1.2*F6.123P0.001

與對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.3miR-134-3p抑制了SW480細(xì)胞的遷移Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-134-3p mimic或miR-134-3p inhibitor轉(zhuǎn)染了SW480細(xì)胞48 h后，miR-134-3p mimic組的穿膜細(xì)胞數(shù)最少，而miR-134-3p inhibitor組的穿膜細(xì)胞數(shù)最多，這一結(jié)果表明miR-134-3p能抑制SW480細(xì)胞的遷移(圖3)。

2.4miR-134-3p抑制了ADAM9/EGFR/AKT通路的活化為了探討miR-134-3p是否通過(guò)抑制ADAM9/EGFR/AKT通路的活化從而進(jìn)一步抑制癌細(xì)胞的存活和遷移，miR-134-3p mimic或miR-134-3p inhibitor轉(zhuǎn)染了細(xì)胞后，我們檢測(cè)了各組細(xì)胞內(nèi)miR-134-3p和ADAM9的表達(dá)以及p-EGFR/EGFR和p-AKT/AKT水平。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)到miR-134-3p表達(dá)在miR-134-3p mimic組顯著上調(diào)，而在miR-134-3p inhibitor組顯著下調(diào)，這一結(jié)果表明miR-134-3p mimic與miR-134-3p inhibitor在SW480細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)染(表5)。Western免疫印跡結(jié)果顯示，不同轉(zhuǎn)染組之間ADAM9、p-EGFR/EGFR和p-AKT/AKT的水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.756，P=0.033；F=4.578，P=0.015；F=3.269，P=0.045)。與對(duì)照組相比，miR-134-3p mimic轉(zhuǎn)染后ADAM9、p-EGFR/EGFR和p-AKT/AKT的水平降低，而轉(zhuǎn)染miR-134-3p inhibitor之后，3種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05，圖4、表6)。因此，miR-134-3p通過(guò)抑制ADAM9/EGFR/AKT通路的活化抑制了癌細(xì)胞的存活和遷移。

表4miR-134-3p表達(dá)水平對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響

時(shí)間(h)ControlMimic NCmiR-134-2pmimicInhibitor NCmiR-134-3pinhibitor00.48±0.110.46±0.090.45±0.120.50±0.060.49±0.08240.98±0.120.90±0.090.63±0.100.80±0.091.27±0.11481.48±0.111.30±0.100.79±0.141.15±0.101.87±0.15721.81±0.091.60±0.100.88±0.131.47±0.102.50±0.16962.15±0.112.00±0.081.02±0.171.80±0.122.83±0.17

圖3miR-134-3p抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移

Fig.3 miR-134-3p inhibited cell migration

圖4miR-134-3p抑制了ADAM9/EGFR/AKT通路的活化

Fig.4 miR-134-3p inhibited activation of ADAM9/EGFR/AKT pathway

A：實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-134-3p mRNA的表達(dá)；B：Western免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞中ADAM9/EGFR/AKT通路的蛋白表達(dá)；C：ADAM9蛋白的相對(duì)表達(dá)量；D：p-EGFR/EGFR的相對(duì)表達(dá)量；E：p-AKT/AKT的相對(duì)表達(dá)量。與對(duì)照組相比，*P<0.05。

表5miR-134-3pmimic和inhibitor轉(zhuǎn)染后其表達(dá)水平的變化

組別相對(duì)表達(dá)水平Control1.00±0.19Mimic NC0.92±0.28miR-134-3p mimic4.10±0.34*Inhibitor NC1.17±0.22miR-134-3p inhibitor0.34±0.37*F7.001P0.005

與對(duì)照組相比，*P<0.05。

表6miR-134-3p表達(dá)水平對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞ADAM9/EGFR/AKT通路活化的影響

組別ADAM9p-EGFR/EGFRp-AKT/AKTcontrol1.00±0.191.00±0.161.00±0.19Mimic NC0.87±0.170.92±0.111.07±0.24miR-134-3p mimic0.54±0.14*0.44±0.10*0.66±0.20*Inhibitor NC0.93±0.200.96±0.130.98±0.22miR-134-3p inhibitor3.20±0.12*3.30±0.20*2.80±0.13*F3.7564.5873.269P0.0330.0150.045

與對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.5ADAM9是miR-134-3p的靶基因TargetScan靶基因預(yù)測(cè)軟件結(jié)果顯示，ADAM9 mRNA的3′UTR區(qū)域能與miR-134-3p的種子序列靶向結(jié)合，我們進(jìn)一步合成了ADAM9 mRNA的3′UTR序列和其突變的序列(圖5A、表7)，并將其分別克隆到熒光素酶報(bào)告基因后轉(zhuǎn)染到SW480細(xì)胞。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)入miR-134-3p mimic后，含野生型3′UTR序列組的熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，而突變后3′UTR組的熒光素酶活性與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯差異(圖5B)。另外，細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-134-3p后，ADAM9 mRNA的表達(dá)水平下降(P<0.05)，而抑制miR-134-3p后，ADAM9 mRNA的表達(dá)水平上升(P<0.05，圖5C、表8)。

圖5ADAM9是miR-134-3p的靶基因

Fig.5 ADAM9 is a target gene of miR-134-3p

A：突變型和野生型ADAM9 mRNA的3′UTR區(qū)域與miR-134-3p的靶向結(jié)合位點(diǎn)；B：熒光素酶報(bào)告顯示的各組細(xì)胞熒光素酶活性強(qiáng)度；C：ADAM9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。與對(duì)照組相比，*P<0.05。

表7熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-134-3p與ADAM9基因的靶向關(guān)系

分組ControlmiR-134-3p mimicWT-UTR1.00±0.110.48±0.12*MUT-UTR1.00±0.090.87±0.08

與對(duì)照組相比，*P<0.05。

表8miR-134-3p表達(dá)水平對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞ADAM9mRNA水平的影響

組別相對(duì)表達(dá)水平Control1.00±0.13Mimic NC0.87±0.15miR-134-3p mimic0.54±0.11Inhibitor NC0.93±0.16miR-134-3p inhibitor3.20±0.19F5.278P0.021

與對(duì)照組相比，*P<0.05。

3 討 論

盡管結(jié)腸癌的診斷和治療技術(shù)逐漸走向成熟，但由于腫瘤的局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，患者的5年生存率依然很低。因此，結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制仍是近年來(lái)的研究重點(diǎn)。目前，已有不少研究發(fā)現(xiàn)ADAM9在多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)，包括非小細(xì)胞肺癌、胃癌、胰腺癌等。ADAM9甚至被認(rèn)為是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后的候選標(biāo)志基因之一[8-10]。一項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，ADAM9能促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)病和血管生成[11]。在體外，ADAM9能通過(guò)激活EGFR增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的耐藥性[3]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADAM9/EGFR/AKT通路在結(jié)腸癌細(xì)胞中被顯著激活，當(dāng)ADAM9表達(dá)被抑制后，癌細(xì)胞的增殖和遷移能力降低，細(xì)胞凋亡增加，進(jìn)一步表明ADAM9參與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。

近年來(lái)，miR-134-3p的抑癌功能和作用機(jī)制不斷被證實(shí)。在非小細(xì)胞肺癌中，miR-134也能通過(guò)靶向抑制細(xì)胞周期素D1(cyclin D1, CCND1)的表達(dá)來(lái)抑制癌細(xì)胞的存活[12]。在三陰性乳腺癌細(xì)胞中，胞外膜泡高表達(dá)的miR-134不僅抑制了癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而且增強(qiáng)了對(duì)anti-Hsp90藥物的敏感性，這一研究結(jié)果表明，miR-134可作為治療乳腺癌的潛在生物靶標(biāo)[13]。另外，miR-134被發(fā)現(xiàn)在人骨肉瘤組織和細(xì)胞中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)的miR-134不僅抑制體外骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和存活，也能抑制活體小鼠腫瘤的發(fā)生[14]。在之前與結(jié)腸癌相關(guān)的研究中，miR-134低表達(dá)被證實(shí)與腫瘤的大小以及不良預(yù)后相關(guān)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-134-3p能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、存活和遷移，與這些研究結(jié)果一致，這也進(jìn)一步證實(shí)miR-134-3p能抑制結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。

有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-134-3p可通過(guò)靶向調(diào)控EGFR、程序性細(xì)胞死亡7(programmed cell death 7, PDCD7)等基因的表達(dá)調(diào)控細(xì)胞增殖和存活[15-16]，但是miR-134-3p是否能夠通過(guò)靶向ADAM9抑制癌細(xì)胞的存活仍不明確。我們通過(guò)生物信息學(xué)工具TargetScan對(duì)miR-134-3p和ADAM9之間的靶向結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)ADAM9 mRNA的3′UTR區(qū)域能與miR-134-3p的種子序列靶向結(jié)合。熒光素酶報(bào)告分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-134-3p引起野生型3′UTR序列組細(xì)胞的熒光素酶活性和ADAM9表達(dá)明顯降低，而對(duì)突變型3′UTR組沒(méi)有明顯影響，這些結(jié)果證實(shí)了ADAM9是miR-134-3p的靶基因，miR-134-3p正是通過(guò)靶向抑制ADAM9/EGFR/AKT通路的活化抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞的存活和遷移。本研究不僅為結(jié)腸癌的治療提供了新的藥物靶點(diǎn)，同時(shí)也提示miR-134-3p具有較大的潛在研究和藥用價(jià)值。