HPLC法同時(shí)測(cè)定清香類酒醅中主要酸和酯類物質(zhì)

魏志陽(yáng)，李秋志，邢 爽，郭凱凱，諶柄旭，王孟祺，郭學(xué)武，肖冬光*

（1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.河北山莊老酒股份有限公司，河北 承德 067500；3.天津釀源生物科技發(fā)展有限公司，天津 300457）

中國(guó)白酒是世界六大蒸餾酒之一，其多種天然微生物混合固態(tài)發(fā)酵及固態(tài)甑桶蒸餾的獨(dú)特生產(chǎn)工藝，形成以低級(jí)脂肪酸和乙酸酯為主體香味成分的風(fēng)格特點(diǎn)[1-2]。白酒中風(fēng)味成分可分為酸、酯、醇、醛和其他五大類[3]，其中酸酯含量占總風(fēng)味物質(zhì)的60%～80%，是白酒中最主要的呈香呈味物質(zhì)[4-5]。

清香類型白酒包括大曲清香型、小曲清香型、麩曲清香型、老白干香型、米香型、鳳香型等，其主要有機(jī)酸為乳酸和乙酸，主要酯為乙酸乙酯和乳酸乙酯[6-7]。清香類白酒具有清香純正，醇甜柔和，自然協(xié)調(diào)，余味爽凈的風(fēng)格[8]，深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者喜愛(ài)，且具有發(fā)酵周期短、原料出酒率高等特點(diǎn)[9]，其產(chǎn)量占中國(guó)白酒總量的25%左右。

目前，清香類白酒酒醅中主要酸、酯的檢測(cè)是對(duì)發(fā)酵酒醅液態(tài)蒸餾后酒樣進(jìn)行分析[10-11]，其中乳酸乙酯、乙酸乙酯和乙酸主要采用氣相色譜（gaschromatography，GC）法[12-13]，乳酸和乙酸采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[14-18]，主要存在兩方面的問(wèn)題：一是在蒸餾過(guò)程中，由于乳酸乙酯揮發(fā)性差、沸點(diǎn)較高，使得酒醅中乳酸乙酯不能完全蒸餾到酒樣中，因此氣相色譜數(shù)據(jù)不能準(zhǔn)確反映發(fā)酵酒醅中乳酸乙酯的含量；二是在對(duì)清香類白酒酒醅中四種主要物質(zhì)進(jìn)行分析時(shí)，需同時(shí)利用氣相色譜和液相色譜，存在操作繁瑣、分析時(shí)間較長(zhǎng)等缺點(diǎn)[19]。迄今為止，白酒中酯類物質(zhì)的檢測(cè)方法還有高效液相色譜法[20-21]，洪薇等[22]采用氣相色譜法測(cè)定白酒中的乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、丙酸乙酯和甲醇、正丙醇、β-苯乙醇8種物質(zhì)，而用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定酒醅中酸類、酯類的方法仍鮮見(jiàn)報(bào)道[23]。本研究通過(guò)對(duì)高效液相色譜條件和酒醅中酸、酯提取條件的優(yōu)化，建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定清香類白酒酒醅中乳酸、乙酸、乳酸乙酯和乙酸乙酯的方法，旨在提高酒醅檢測(cè)中乳酸乙酯的準(zhǔn)確性，為清香類白酒發(fā)酵酒醅的分析與檢測(cè)提供可靠方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒醅：分別取自清香型、老白干香型和米香型白酒廠；乳酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸、乙酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞99.9%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；高效液相色譜檢測(cè)所用試劑均為色譜純，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1260-HPLC-UV高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司；FA2204B電子天平：上海精密儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)混合液配制

分別準(zhǔn)確量取0.1 mL 4種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品，用體積分?jǐn)?shù)為20%乙醇色譜溶解并定容于100 mL容量瓶中，即得一定濃度混合母液。分別量取0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL標(biāo)準(zhǔn)混合母液用去離子水稀釋、定容于10mL容量瓶，得到8.0～650.0mg/L之間不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液，備用。

1.3.2 流動(dòng)相的配制

準(zhǔn)確稱取6.80 g磷酸二氫鉀用去離子水溶解、定容于1000mL容量瓶，并用H3PO4調(diào)節(jié)pH至2.5，再經(jīng)0.45μm水相濾膜過(guò)濾、超聲脫氣30 min后使用；色譜級(jí)乙腈經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾、超聲脫氣30 min后使用。

1.3.3 高效液相色譜分析條件

COSMOSIL-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.05 mol/L KH2PO4（8∶92，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

1.3.4 酒醅處理

準(zhǔn)確稱取50.00g發(fā)酵酒醅于500mL燒杯中，加入300mL體積分?jǐn)?shù)為10%乙醇攪勻。在室溫下浸泡30 min（此期間每隔10 min攪拌一次），過(guò)濾；濾渣再用體積分?jǐn)?shù)為10%乙醇溶液經(jīng)反復(fù)清洗后，過(guò)濾、定容于500 mL容量瓶得到液相檢測(cè)樣品，備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜法檢測(cè)方法的建立

2.1.1 高效流動(dòng)相及流速的選擇

采用乙腈-水、乙腈-0.05mol/LKH2PO4等不同流動(dòng)相組合進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)利用乙腈∶水（20∶80，V/V）作流動(dòng)相時(shí)，各組分之間不能得到很好的分離，且峰型較差，高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。而用乙腈-0.05 mol/LKH2PO4（8∶92，V/V）（pH=3.9）作為流動(dòng)相時(shí)，乳酸乙酯和乙酸乙酯的峰型較好，但乳酸和乙酸的分離效果不太理想，高效液相色譜圖見(jiàn)圖2。這往往和緩沖溶液的pH有關(guān)，因?yàn)楫?dāng)有機(jī)酸（乳酸、乙酸）存在于pH大于其解離平衡常數(shù)（pKa）的水相溶液中時(shí)，容易發(fā)生解離，不能以單一的一種形式存在，故出現(xiàn)色譜峰重疊、分離效果差等現(xiàn)象。通過(guò)利用H3PO4調(diào)節(jié)緩沖液pH值后，發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH=2.5時(shí)四種物質(zhì)都有著很好的分離效果且峰型較好，且滿足一般C18色譜柱流動(dòng)相pH值在2～9之間的要求，高效液相色譜圖見(jiàn)圖3。而在不同流速（1.2 mL/min、1.0 mL/min、0.8 mL/min）下分離4種物質(zhì)效果的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)隨著流速的增加，保留時(shí)間大幅縮短，但是分離度降低。綜合考慮，最終確定最佳流動(dòng)相配比為乙腈-0.05 mol/L KH2PO4（8∶92，V/V）（pH=2.5），流速為1.0 mL/min。

圖1 乙腈∶水(80∶20)為流動(dòng)相標(biāo)準(zhǔn)溶液高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard solution using acetonitrile∶water(80∶20)as the mobile phase

圖2 乙腈∶0.05 mol/L KH2PO4(8∶92,pH 3.9)為流動(dòng)相標(biāo)準(zhǔn)溶液高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of standard solution using acetonitrile∶0.05 mol/L KH2PO4(8∶92,pH 3.9)as mobile phase

圖3 乙腈∶0.05 mol/L KH2PO4(8∶92,pH 2.5)為流動(dòng)相標(biāo)準(zhǔn)溶液高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of standard solution using acetonitrile∶0.05 mol/L KH2PO4(8∶92,pH 2.5)as mobile phase

2.1.2 線性回歸分析

取方法1.3.1中配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述1.3.3色譜條件下進(jìn)樣，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，化合物質(zhì)量濃度（X，mg/L）為橫坐標(biāo)，繪制4種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到4種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、保留時(shí)間、線性范圍和檢出限，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，其中4種物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)R2均＞0.999，表明二者有著良好的線性關(guān)系。4種物質(zhì)的檢出限在5.632～10.656 mg/L之間，可滿足分析檢測(cè)要求。

表1 4種標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間、回歸方程和檢出限Table 1 Retention time,regression equation and detection limit of the four standard substances

2.1.3 方法回收率試驗(yàn)

取方法1.3.1配制的已知濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品，向其中添加一定量不同濃度的乳酸、乙酸、乳酸乙酯和乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液后混勻，進(jìn)樣分別測(cè)定其中各物質(zhì)濃度，考察方法的回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，4種物質(zhì)的平均回收率都在96.1%～103.6%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standaral deviation，RSD）值均≤2.01%，說(shuō)明該檢測(cè)方法準(zhǔn)確性好。

表2 4種物質(zhì)的回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table 2 Results of recovery rate tests of the four substances(n=3)

2.1.4 方法精密度試驗(yàn)

將方法1.3.1配制的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品，按上述1.3.3色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次檢測(cè)4種物質(zhì)含量，6次平行試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，4種物質(zhì)含量檢測(cè)結(jié)果的RSD值均在0.43%～2.42%之間，符合定量檢測(cè)要求，說(shuō)明該方法測(cè)定結(jié)果精密度良好。

表3 四種物質(zhì)測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Relative standard deviation of the four substances(n=6)mg/L

2.2 酒醅處理方法的確定

2.2.1 不同濃度乙醇對(duì)酒醅中四種物質(zhì)提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取4份酒醅各50.00 g，分別用蒸餾水、體積分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%乙醇作為溶劑，按照1.3.4所述方法處理得到酒醅浸提液。經(jīng)0.22 μm濾膜后按方法1.3.3進(jìn)樣色譜分析，分別測(cè)定水及不同乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下4種物質(zhì)含量，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同乙醇濃度下4種物質(zhì)的含量測(cè)定結(jié)果Fig.4 Determination results of the four substances contents in different ethanol concentrations

由圖4可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)乳酸、乙酸的含量變化沒(méi)有太大的影響，主要是由于二者均能與水、乙醇互溶；而乳酸乙酯和乙酸乙酯都較易溶于乙醇，所以隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加兩者含量也逐漸增加，但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在10%以上時(shí)其含量變化幅度較小。綜合考慮4種物質(zhì)含量可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，4種物質(zhì)的含量基本達(dá)到最大值，故選取體積分?jǐn)?shù)為10%乙醇溶液進(jìn)行樣品酒醅的處理。

2.2.2 不同處理時(shí)間對(duì)酒醅中四種物質(zhì)提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取5份酒醅各50.00 g，按照方法1.3.4對(duì)酒醅分別處理10 min、20 min、30 min、40 min、50 min制得待測(cè)樣品。按方法1.3.3進(jìn)樣色譜分析，觀察不同處理時(shí)間下4種物質(zhì)含量的變化，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同處理時(shí)間下4種物質(zhì)的含量測(cè)定結(jié)果Fig.5 Determination results of four kinds of substances contents in different treatment time

由圖5可知，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，4種物質(zhì)的含量都隨之增加，但提升幅度逐漸減小，且在30 min時(shí)均達(dá)到最大含量，說(shuō)明此時(shí)酒醅中4種物質(zhì)均已基本完全溶出，故選擇室溫下浸泡酒醅30 min。

2.2.3 酒醅樣品檢測(cè)及加標(biāo)試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱量50.00 g清香型酒醅，按方法1.3.4處理后得到待測(cè)樣品，依1.3.3色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，樣品色譜圖如圖6所示；再準(zhǔn)確稱取兩份相同的酒醅，其中一份添加與酒醅中初始含量大致相等的4種物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，另一份添加大約相當(dāng)于酒醅中初始含量一半的4種物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，按1.3.4方法處理后進(jìn)樣測(cè)定4種物質(zhì)含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

圖6 清香型酒醅樣品高效液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of the fermented grains of light-flavor Baijiu

由表4可知，該方法測(cè)定清香型酒醅中4種物質(zhì)的回收率均在93.2%～104.9%之間，RSD均低于2.27%，具有一定的可靠性。且其分析時(shí)間得到大大縮短，極大提高工作效率，適用于清香類酒醅中乳酸、乙酸、乳酸乙酯和乙酸乙酯的定量檢測(cè)。

表4 清香型酒醅樣品測(cè)定及加標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Determination results of the light-flavor fermented grains and adding standard recoveries

2.2.4 不同清香類酒醅中四種物質(zhì)的測(cè)定

對(duì)傳統(tǒng)清香型、老白干香型和米香型酒醅中4種物質(zhì)進(jìn)行定量分析，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，傳統(tǒng)清香型和老白干香型酒醅中乳酸、乙酸的含量差別較小，乳酸乙酯和乙酸乙酯含量差別較大，其中老白干香型酒醅中乳酸乙酯含量約為傳統(tǒng)清香型酒醅中的2.6倍，而傳統(tǒng)清香型酒醅中乙酸乙酯含量約為老白干香型酒醅中的1.6倍；與其他兩種香型相比，米香型酒醅中4種物質(zhì)含量均為最低（乳酸898.80mg/100g、乙酸143.62mg/100g、乳酸乙酯30.97mg/100g、乙酸乙酯15.16 mg/100 g）。

表5 不同清香類白灑酒醅中四種物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果Table 5 Determination results of four substances contents in different fermented grains of light-flavorBaijiu mg/100 g

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定清香類酒醅中乳酸、乙酸、乳酸乙酯和乙酸乙酯含量的方法，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜2.5%，加標(biāo)回收率為96.1%～103.6%，說(shuō)明該方法具有較高的精密度和準(zhǔn)確性，可用于清香類白酒生產(chǎn)及發(fā)酵過(guò)程的監(jiān)測(cè)。

通常利用氣相色譜法對(duì)發(fā)酵酒醅蒸餾后酒樣進(jìn)行乳酸乙酯檢測(cè)的方法，由于乳酸乙酯沸點(diǎn)高（154℃）、水溶性較強(qiáng)的特點(diǎn)以及酒醅酸度和酒度對(duì)其餾出率的影響，使酒樣中乳酸乙酯的測(cè)定結(jié)果只有酒醅原含量的65%～75%，存在較大的誤差。而本研究利用體積分?jǐn)?shù)10%乙醇對(duì)酒醅中四種物質(zhì)進(jìn)行提取并經(jīng)高效液相色譜進(jìn)樣分析后，可準(zhǔn)確測(cè)定酒醅中乳酸乙酯含量，大大縮小測(cè)量誤差。

對(duì)3種不同清香類酒醅中的4種物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明不同香型酒醅中4種物質(zhì)含量存在一定差距，其中米香型酒醅中4種物質(zhì)含量均最低，老白干香型的乳酸、乙酸和乳酸乙酯含量最高，傳統(tǒng)清香型的乙酸乙酯含量最高。