藻酸鹽寡糖制備工藝及生物活性研究進(jìn)展

蔣 越，姚子昂，陳豐嘉，彭宇鑫，吳海歌*

（大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧省海洋藥物開發(fā)工程技術(shù)研究中心，大連海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116622）

藻酸鹽是細(xì)菌細(xì)胞壁及海帶等褐藻類植物細(xì)胞壁的主要成分之一[1]，由β-D-甘露糖醛酸（mannuronic acid，M）和α-L-古洛糖醛酸（glucuronic acid，G）兩種單體組成[2]。這些單體以3種不同的方式通過α-1,4糖苷鍵鏈接，從而形成一種無支鏈的線性嵌段共聚物[3]，分為聚β-D-甘露糖醛酸（polyM），聚α-L-古洛糖醛酸（polyG）和雜聚物（polyMG）[4]。其分子結(jié)構(gòu)式如下：

其降解產(chǎn)物藻酸鹽寡糖較藻酸鹽相比具有分子質(zhì)量低、水溶性好、易吸收等優(yōu)點(diǎn)，其表現(xiàn)出多種生物活性而引起廣泛關(guān)注，如抗腫瘤活性、抗凝血活性、降血壓功能、免疫調(diào)節(jié)活性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)等[5-10]。本文主要對(duì)近幾年藻酸鹽寡糖制備工藝及其生物活性進(jìn)行概述，因此對(duì)其生物活性的研究對(duì)未來新藥的開發(fā)和臨床治療奠定理論基礎(chǔ)，且對(duì)不同領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。

1 藻酸鹽寡糖的制備

1.1 化學(xué)降解法

化學(xué)降解法是藻酸鹽寡糖早期發(fā)現(xiàn)的傳統(tǒng)的制備方法。其中酸降解法主要使用的有機(jī)酸有甲酸、草酸、無機(jī)酸、鹽酸、硫酸。1966年，HAUG A等[11]在100℃條件下用濃度為1 mol/L草酸水解藻酸鹽，約有1/3的藻酸鹽溶解。通過調(diào)節(jié)pH（2.85）分離得到可溶和不可溶的兩種組分，經(jīng)過鑒定得知可溶組分80%～90%為甘露糖醛酸片段；不可溶組分80%～90%為古羅糖醛酸片段。LI H B等[12]還研究了氧化降解法作為藻酸鹽寡糖的制備工藝，以H2O2為氧化劑，濃度為6%，調(diào)節(jié)pH為酸性環(huán)境，反應(yīng)溫度為60℃，反應(yīng)時(shí)間為8 h，降解效率最高；在藻酸鹽制備過程中，以正丁醇/甲酸/水（4∶6∶1，V/V）為洗脫液分離低聚糖，樣品采用硅膠柱進(jìn)行二次分離，質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，聚合度為1 000～8 000 Da的寡糖基本得到分離。該方法較傳統(tǒng)的酸降解法有污染排放少的優(yōu)勢(shì)。雖然化學(xué)降解法的成本低，技術(shù)也比較成熟，但存在的問題也十分明顯，如反應(yīng)劇烈，設(shè)備維護(hù)成本較高，特別是對(duì)環(huán)境的污染較為嚴(yán)重，且產(chǎn)量較低，致使化學(xué)降解法如今并不常用。

1.2 物理降解法

物理降解法主要是通過高溫、輻射等方法降解藻酸鹽，NAGASAWA N等[13]將藻酸鹽固體和藻酸鹽水溶液利用60Coγ射線處理，于20～500 kGy劑量范圍內(nèi)研究了γ射線對(duì)褐藻膠的影響。結(jié)果表明，藻酸鹽水溶液降解程度明顯高于直接處理固體藻酸鹽。高度降解的藻酸鹽伴隨著顏色發(fā)生變化，該現(xiàn)象表明降解過程中在吡喃糖環(huán)中形成了雙鍵。AIDA T M等[14]在2010年對(duì)藻酸鹽進(jìn)行水熱處理（180～240℃）。結(jié)果表明，藻酸鹽在高溫條件下降解，藻酸鹽被降解為藻酸鹽寡糖、單糖、最終還產(chǎn)生了甲酸、乙酸、乳酸和羥基乙酸等有機(jī)羧酸。HU T等[15]將從藻酸鹽水解產(chǎn)物中分餾的聚古羅糖醛酸溶解在稀氨水中，然后在微波輻射（1 600 W）條件下在130℃水解15 min以產(chǎn)生古羅糖醛酸寡糖混合物。通過Bio-Gel P6柱分離寡糖混合物，得到聚合度為1～10的古洛糖醛酸寡糖。之后通過電噴霧電離質(zhì)譜、核磁共振氫譜（Hnuclearmagnetic resonance，H-NMR、核磁共振碳譜（C-NMR）和二維核磁共振譜（D-NMR）光譜技術(shù)進(jìn)一步分析每個(gè)組分。結(jié)果表明微波降解法獲得的寡糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)與酸水解法得到的寡糖化學(xué)結(jié)構(gòu)相同，這種微波降解方法不僅方便，耗時(shí)少，環(huán)境友好，而且與常規(guī)酸水解法相比，還可以高產(chǎn)率（71%）制備古羅糖醛酸寡糖。物理法降解褐藻膠制備褐藻膠寡糖具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)迅速、無環(huán)境污染等優(yōu)勢(shì)，相比于化學(xué)法制備藻酸鹽寡糖有非常明顯的優(yōu)勢(shì)。

1.3 酶解法

藻酸鹽裂解酶已從包括海洋藻類，海洋軟體動(dòng)物，以及多種微生物中發(fā)現(xiàn)，主要是以β消去機(jī)制裂解藻酸鹽，在非還原末段形成雙鍵，并在波長(zhǎng)235 nm處有強(qiáng)烈的紫外吸收。根據(jù)裂解酶對(duì)底物的專一性來分可以分為Poly M酶、Poly G酶、Poly MG酶三種。ZHU B等[16]從新分離的海洋細(xì)菌粘質(zhì)沙雷氏菌NJ-07中純化出具有高比活性和pH穩(wěn)定性的新型polyM特異性藻酸鹽裂解酶AlgNJ-07。分子質(zhì)量為25 kDa，并且在40℃、pH9.0條件下對(duì)海藻酸鈉顯示出2 742.5 U/mg的最大活性。此外，AlgNJ-07在8.0～10.0的pH范圍內(nèi)可保留95%以上的活性，表明其具有優(yōu)異的pH穩(wěn)定性，它還顯示出對(duì)polyM嵌段的高活性和親和力，并且對(duì)polyG嵌段沒有活性，這表明它是嚴(yán)格的polyM特異性藻酸鹽裂解酶。ZHU B等[17]在另一項(xiàng)研究中又從新分離的海洋菌株Cellulophagasp.中純化出一種具有高活性（24 038 U/mg）的新藻酸鹽裂解酶NJ-1。該酶在50℃和pH8.0下最具活性，并且在寬pH范圍（6.0～10.0）和低于40℃的溫度條件下保持穩(wěn)定。它對(duì)海藻酸鈉，雜聚MG嵌段（polyMG），均聚M嵌段（polyM）和均聚G嵌段（polyG）具有廣泛的底物特異性，并且對(duì)polyG以及polyMG具有比polyM更高的親和力和。降解產(chǎn)物的TLC和MS光譜分析表明它將藻酸鈉完全水解成低聚合度（degree of polymerization，DP）的低聚糖。與化學(xué)降解法和物理降解法相比酶解法的反應(yīng)條件更加溫和，而且無論在產(chǎn)量還是環(huán)境友好方面都具有非常大優(yōu)勢(shì)，因此酶解法是如今降解藻酸鹽的最常用且有效的方法。

2 藻酸鹽寡糖生物活性

2.1 抗炎活性

ZHOU R等[18]研究了藻酸鹽寡糖對(duì)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）/β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬Aβ作用的影響。發(fā)現(xiàn)了在LPS/Aβ刺激之前用藻酸鹽寡糖對(duì)Bv2小膠質(zhì)細(xì)胞預(yù)處理后，可以顯著抑制神經(jīng)炎癥的發(fā)生；并且除了對(duì)神經(jīng)炎癥的抑制作用外，研究還發(fā)現(xiàn)藻酸鹽寡糖可通過與小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4的相互作用促進(jìn)對(duì)Aβ的吞噬作用。KIM M J等[19]利用酶解制備的藻酸鹽寡糖對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞的抗炎作用進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，藻酸鹽寡糖以劑量依賴的方式降低了一氧化氮的合成和促炎細(xì)胞因子的分泌，如腫瘤壞死因子，白細(xì)胞介素IL等產(chǎn)生。此外，在小鼠實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)寡糖處理樣品減少了小鼠耳水腫的形成。這些結(jié)果表明，褐藻膠寡糖具有優(yōu)良的抗炎效果。

2.2 抗腫瘤活性

HU X K等[20]將藻酸鹽裂解酶制備分子質(zhì)量不同的藻酸鹽寡糖，利用藻酸鹽寡糖及其硫酸化的衍生物對(duì)tsFT210細(xì)胞作用，結(jié)果表明，兩類物質(zhì)對(duì)tsFT210細(xì)胞都不具有毒性作用；之后該實(shí)驗(yàn)使用了不同分子質(zhì)量的藻酸鹽寡糖及藻酸鹽寡糖的衍生物直接作用于昆明小鼠，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量3 798 kDa且硫酸化程度為1.3的藻酸鹽寡糖具有良好的抗腫瘤活性，且50 mg/kg藻酸鹽寡糖對(duì)S180細(xì)胞的抑制效率為66.0%，100 mg/kg的和藻酸鹽寡糖對(duì)S180細(xì)胞的抑制效率為70.4%。故通過該實(shí)驗(yàn)可判斷藻酸鹽寡糖及藻酸鹽硫酸化衍生物可以通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)從而間接的達(dá)到了抗腫瘤的目的。CHEN J等[21]使用藻酸鹽裂解酶制備的藻酸鹽寡糖，通過尺寸排阻色譜將寡糖進(jìn)行分級(jí)，得到4種不同聚合度的寡糖命名為DP2、DP3、DP4和DP5，其中DP5對(duì)骨肉瘤細(xì)胞表現(xiàn)出抗腫瘤的功能。可以看出藻酸鹽寡糖具有良好的抗腫瘤活性，在未來可以作為腫瘤治療的潛在性藥物，具有可觀的發(fā)展前景。

2.3 抗菌活性

HOU W等[22]采用完全隨機(jī)的方法，將863例細(xì)菌性陰道病患者分為甲硝唑治療組，藻酸鹽寡糖抗菌凝膠治療組以及聯(lián)合治療組三組。從有效率、和不良反應(yīng)發(fā)生率兩方面評(píng)價(jià)，藻酸鹽寡糖以高效率和低不良反應(yīng)發(fā)生率表現(xiàn)出良好的抗菌作用。WU G F等[23]使用氧化降解的藻酸鹽寡糖不同制備濃度加入MRS培養(yǎng)基中，并測(cè)試短乳桿菌49的抑菌作用以確定藻酸鹽寡糖的抗氧化活性，結(jié)果表明，藻酸鹽70℃，5%（V/V）H2O2和1.5 mg/100 mL作用制備的寡糖，具有最佳的抗菌效果，將不同濃度的低聚糖加入混合啤酒菌株的啤酒中，其中0.25 mg/100 mL的藻酸鹽寡糖可以完全抑制啤酒細(xì)菌并防止啤酒的渾濁。T?NDERVIK A等[24]使用一系列致病真菌菌株評(píng)價(jià)藻酸鹽寡糖干擾真菌生長(zhǎng)和增強(qiáng)傳統(tǒng)抗真菌藥物的能力，包括念珠菌和曲霉菌，經(jīng)光密度測(cè)定（OD600nm）藻酸鹽寡糖培養(yǎng)的菌株細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性（P＜0.005%），在生殖管測(cè)定中也顯示出明顯的抑制菌絲生長(zhǎng)的效果。掃描電子顯微鏡和原子力顯微鏡結(jié)果均表明，藻酸鹽寡糖（2%）顯著破壞真菌生物膜形成，單獨(dú)聯(lián)合氟康唑。聯(lián)合治療組細(xì)胞表面粗糙度明顯增加（P＜0.001）。高通量篩選表明藻酸鹽寡糖具有對(duì)制霉菌素、兩性霉素B、氟康唑、咪康唑、伏立康唑或特比萘芬的增效作用。ZHANG S等[25]發(fā)現(xiàn)藻酸鹽寡糖浸泡后的種子種植后可以抗稻瘟病菌，藻酸鹽寡糖可以誘導(dǎo)水稻植物細(xì)胞中苯丙氨酸解氨酶，過氧化物酶和過氧化氫酶的酶活性升高，保護(hù)植物免受入侵病原體的侵害。利用褐藻寡糖處理，稻瘟病菌引起的病害指數(shù)由17.74%降至10.81%，保護(hù)效力為39.06%。這些發(fā)現(xiàn)表明，藻膠寡糖可以作為生物制劑來控制稻瘟病。可見藻酸鹽寡糖具有優(yōu)良的抗菌活性，未來可作為抗菌藥物，具有廣闊的發(fā)展前景。

2.4 抗氧化活性

氧自由基在腫瘤、血栓的形成，以及肝炎、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生機(jī)理中都起到了重要的參與作用，因此使體內(nèi)的過氧化狀態(tài)降低對(duì)疾病的預(yù)防和治療都具有重要的意義。FALKEBORG M等[26]用藻酸鹽裂解酶制備藻酸鹽寡糖的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究其抗氧化活性，結(jié)果表明，藻酸鹽寡糖具有清除羥基和超氧化物自由基的活性。藻酸鹽寡糖能夠完全抑制（抑制率100%）乳濁液中脂質(zhì)的氧化，其效果優(yōu)于抗壞血酸（抑制率89%）。采用大腸桿菌法化和學(xué)發(fā)光法研究藻酸鹽寡糖對(duì)3種自由基（O2-·、·OH和ABTS·+）的消除作用，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量小于1 000 kDa的藻酸鹽寡糖對(duì)3種自由基都有較好的消除作用，消除效果與藻酸鹽寡糖濃度成正比，而且寡糖的分子質(zhì)量大小是影響自由基消除效果的重要因素。ZHANG M J等[27]開發(fā)了一種優(yōu)化酶水解技術(shù)，分離得到4種組分，分別進(jìn)行體外抗氧化研究，結(jié)果顯示分子質(zhì)量為0.84 kDa的寡糖組分有顯著的抗氧化活性，并且羥自由基清除能力與維生素C清除能力相似。WAN J等[28]研究了藻酸鹽寡糖對(duì)斷奶仔豬的抗氧化活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藻酸鹽寡糖可通過提高血清過氧化氫酶活性和谷胱甘肽含量來有效提高抗氧化防御特性。藻酸鹽寡糖無毒無害又可作為抗氧化劑，未來在食品工業(yè)、醫(yī)藥、保健、化妝品等方面有一定的前景。

2.5 抗旱和促進(jìn)生長(zhǎng)作用

ZHANG Y等[29]采用河南省三個(gè)優(yōu)質(zhì)小麥品種（鄭麥101，129和3596）作為實(shí)驗(yàn)材料，研究了在含有15%聚乙二醇（PEG）6000的水源條件下，藻酸鹽寡糖對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)和耐旱性的影響，用以提供新型植物抗旱劑在農(nóng)業(yè)中應(yīng)用的理論參考。結(jié)果表明，噴灑藻酸鹽寡糖可以緩解由干旱引起的三個(gè)小麥品種的生長(zhǎng)抑制程度，反映出幼苗長(zhǎng)度、根長(zhǎng)和生物量顯著增加，丙二醛和脯氨酸含量顯著降低，葉綠素含量（鄭麥101除外）和部分抗氧化酶活性升高。UENO M等[30]研究發(fā)現(xiàn)藻酸鹽寡糖能促進(jìn)作為魚類、貝類和一些甲殼類幼苗食物的兩種藻類微綠球藻（Nannochloropsisoculata）和纖細(xì)角毛藻（Chaetoceros gracilis）的生長(zhǎng)。研究還發(fā)現(xiàn)藻酸鹽寡糖可以抑制有害鞭尾藻（Kareniamikimotoi）的生長(zhǎng)。IWASAKIKI等[31]研究利用棒狀桿菌（Corynebacteriumsp）分泌的裂解酶降解海藻酸鈉，通過超濾膜進(jìn)行純化，將未降解的藻酸鹽多糖完全去除，得到藻酸鹽二聚糖與八聚糖混合物，以200～3 000 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)對(duì)萵苣根的伸長(zhǎng)具有促進(jìn)作用（約為對(duì)照組的2倍）?？梢钥闯鲈逅猁}寡糖在農(nóng)業(yè)方面具有很好的抗旱和促進(jìn)生長(zhǎng)作用，并且可以改善水中藻類的平衡，且藻酸鹽寡糖本身無毒無害，因此可以作為一種新型肥料應(yīng)用于農(nóng)業(yè)方面，也可作為水質(zhì)改善劑用于水中藻類的控制。

2.6 提高低密度脂蛋白的攝取

在脂蛋白代謝中起關(guān)鍵作用的肝低密度脂蛋白受體（low densitylipoprotein receptor，LDLR）通過降低血漿低密度脂蛋白膽固醇（lowdensitylipoproteincholesterol，LDL-C）濃度來降低心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。YANG J H等[32]的研究發(fā)現(xiàn)藻酸鹽寡糖以劑量和時(shí)間依賴的方式增加肝細(xì)胞LDLR的表達(dá)和低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）的細(xì)胞內(nèi)攝取。藻酸鹽寡糖可以增強(qiáng)SREBP-2核轉(zhuǎn)錄（調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-2，是LDLR基因表達(dá)必需的轉(zhuǎn)錄因子），進(jìn)而促進(jìn)LDLR表達(dá)，提高清除LDL-C的能力。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)，藻酸鹽寡糖可以下調(diào)前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/溶菌素9（protein convertase subtilisin/lysin 9，PCSK9）的表達(dá)，從而降低PCSK9介導(dǎo)的LDLR降解?？梢?，藻酸鹽可在對(duì)LDL-C偏高所引起的冠心病、腦卒中和外周動(dòng)脈病等疾病的預(yù)防中發(fā)揮重大作用。

2.7 其他活性

阿霉素（doxorubicin，DOX）是一種高效的化學(xué)治療劑，但其使用劑量受到其心臟毒性的限制。DOX誘導(dǎo)的心臟毒性能使氧化應(yīng)激反應(yīng)升高，并導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。GUO J J等[33]研究表明通過藻酸鹽寡糖預(yù)處理可以防止急性DOX心臟毒性，其機(jī)理主要是抑制DOX引起的氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，因此藻酸鹽寡糖是預(yù)防急性DOX心臟毒性有效的化合物。ZHANG Y等[34]研究了藻酸鹽寡糖增效尿素對(duì)水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，結(jié)果表明，藻酸鹽寡糖增效尿素比普通尿素相比，每穗粒數(shù)增加，產(chǎn)量顯著提高，精米率，整精米率和蛋白質(zhì)含量均高于不施氮肥處理（對(duì)照）和普通尿素處理，其中較普通尿素處理分別增加1.82%、10.83%、7.59%。此外，稻米透明度、膠稠度、堿消值、最高黏度和崩解值也高于對(duì)照和普通尿素處理，堊白粒率和堊白度低于對(duì)照和普通尿素處理，且與對(duì)照相比差異均達(dá)顯著水平。綜上，藻酸鹽寡糖增效尿素可促進(jìn)水稻增產(chǎn)，對(duì)水稻品質(zhì)也有一定的改善作用。海藻酸鈉寡糖在去皮的南美白對(duì)蝦的商業(yè)化保藏中也發(fā)揮這重要的作用，MA L K等[35]通過監(jiān)測(cè)凍融損失、顏色、質(zhì)地、肌原纖維蛋白含量、Ca2+-腺苷三磷酸酶（adenosine triphosphatase，ATPase）活性、顯微結(jié)構(gòu)等分析，結(jié)果表明藻酸鹽寡糖對(duì)脫皮蝦（Litopenaeus vannamei）的解凍損失和質(zhì)地變量（彈性和咀嚼性）有顯著的抑制作用（P＜0.05），化學(xué)分析表明海藻酸鈉寡糖處理有效地提高了冷凍蝦肌原纖維蛋白含量和Ca2+-ATPase活性發(fā)揮了重要的作用。

3 前景與展望

藻酸鹽寡糖是褐藻膠的寡聚物，可以通過酸降解法、物理降解法、酶降解法和氧化降解法等方法[36-37]制備，其中化學(xué)制備法有生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)基礎(chǔ)成熟等優(yōu)點(diǎn)，但缺點(diǎn)也較為明顯如產(chǎn)生三廢、反應(yīng)劇烈、易腐蝕設(shè)備等。物理講解法具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)迅速、無污染等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是設(shè)備成本高如微波輻射等，對(duì)操作人員的危害也較大。所以如今生物法制備藻酸鹽寡糖成為主流，其具有無污染、反應(yīng)溫和、條件可控，特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。

該綜述對(duì)藻酸鹽寡糖的的生物活性作用做了詳細(xì)和更新的描述，介紹了藻酸鹽寡糖對(duì)各種疾病及其對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，食品和藥物的有益應(yīng)用發(fā)展。很顯然，藻酸鹽寡糖不僅可用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，在食品工業(yè)中，特別是在醫(yī)療應(yīng)用中都具有廣闊的前景，因此它將是未來極有價(jià)值的生物材料，并將為海洋資源添加新的和更高的價(jià)值給下一代可持續(xù)發(fā)展。此外，第四次工業(yè)革命正在創(chuàng)造一個(gè)新的機(jī)會(huì)根據(jù)下一代測(cè)序和多元組學(xué)的原理找出行動(dòng)機(jī)制接近這樣的代謝組學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)等。雖然有幾項(xiàng)研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了藻酸鹽寡在不同途徑中的生物學(xué)活性，藻酸鹽寡應(yīng)用于人類重大疾病臨床治療的相關(guān)研究大多數(shù)局限于中國(guó)。因此未來應(yīng)進(jìn)行更多的臨床研究來評(píng)估藻酸鹽寡在這個(gè)領(lǐng)域的影響。