高粱重組自交系耐鹽性相關(guān)性狀遺傳分析

呂建澎，李金旺，段霞飛，李延玲，李歐靜，裴忠有

(天津農(nóng)學(xué)院 農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國各類鹽堿地的總面積已經(jīng)達(dá)到9 913.3萬hm2，且有逐年增加的趨勢，如何利用和改良這些鹽堿化土壤，對我國農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展及生態(tài)環(huán)境的治理具有十分重要的意義[1]。在改良和利用鹽堿化土壤的諸多方法中，種植耐鹽堿植物是一種十分有效的措施。

高粱(Sorghumbicolor(L.)Moench)是世界上重要的糧食、飼料和能源作物，作為C4植物具有抗旱、耐貧瘠、耐鹽堿等特性。我國高粱種植面積近70萬hm2，種質(zhì)資源十分豐富[2]。耐鹽性是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過程，在黃瓜的耐鹽性遺傳研究上，黃瓜耐鹽性為多基因控制的遺傳模式，表現(xiàn)為加性-顯性(A-D)遺傳模型，耐鹽親本呈正加性效應(yīng)[3]；小白菜的耐鹽性遺傳為加性-顯性遺傳模型，主要表現(xiàn)為顯性，控制耐鹽性表現(xiàn)顯性的基因組數(shù)較少[4]；高粱耐鹽性為加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性-上位性多基因模型，屬于數(shù)量性狀，存在主基因效應(yīng)且遺傳率較高[5]。對高粱種質(zhì)資源進(jìn)行耐鹽性評價(jià)，并從中選出耐鹽品種，對擴(kuò)大高粱的種植面積、有效利用和開發(fā)我國鹽堿地資源具有十分重要的意義，同時(shí)這也是改良和利用鹽堿化土壤、維持我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要策略。有研究表明，高粱苗期的耐鹽性與成株期的耐鹽性一致[6]，故對其苗期進(jìn)行耐鹽性鑒定，用于高粱材料耐鹽性的初步評價(jià)，可實(shí)現(xiàn)在較短時(shí)間內(nèi)鑒定大量的品種。

本課題針對2個(gè)耐鹽性差異較大的親本，對兩親本以及二者雜交后的482份F5重組自交系群體的高粱苗期進(jìn)行耐鹽鑒定，采用單世代聯(lián)合分析方法[7]，對高粱耐鹽性狀進(jìn)行遺傳分析，以期為高粱耐鹽性育種、高粱的分子標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

該試驗(yàn)在天津農(nóng)學(xué)院作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，試驗(yàn)材料為：三尺三(耐鹽材料)、Tx622B(鹽敏感材料)以及三尺三×Tx622B雜交后的482份F5重組自交系群體，均由本實(shí)驗(yàn)室提供。試驗(yàn)時(shí)間為2016年3-12月。

1. 2 試驗(yàn)方法

在前期研究基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)以1 g/L NaCl +0 g/L Na2CO3為對照組，記為①，以9 g/L NaCl + 1 g/L Na2CO3為處理組，其中處理組設(shè)置2個(gè)重復(fù)，分別記為②和③。

1.2.1 Hoagland營養(yǎng)液配制 大量元素：均配制成1 mol/L的母液(KNO3、KH2PO4、Ca(NO3)2、MgSO4·7H2O)；微量元素：分別稱取NaMoO40.025 g，H3BO32.86 g，ZnSO4·7H2O 0.222 g，MnSO4·4H2O211 g，CuSO4·5H2O 0.079 g，共同溶于蒸餾水中，加水定容至1 000 mL；乙二胺四乙酸鐵鈉鹽(EDTA-Fe)的配制：溶解2.68 g乙二胺四乙酸二鈉Na2C10Hl4O3N2在1 000 mL蒸餾水中并加熱，趁熱加入1.980 gFeSO4·7H2O，并攪拌均勻；完全培養(yǎng)液配制：取約800 mL蒸餾水，按表1分別加貯備液(mL)配成完全營養(yǎng)液，并用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH調(diào)pH值為5.6～6.0后，定容到1 L。

表1 1 L完全營養(yǎng)液的配比表Tab.1 1 L the proportion of complete nutrient solution

注：以上為南開大學(xué)植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)所用的配方。其中EDTA-Fe易出現(xiàn)沉淀，一定要進(jìn)行加熱。

Note：The above formula was from the plant physiology experiment of Nankai University. EDTA-Fe is prone to precipitate and must be heated.

1.2.2 試驗(yàn)步驟 將篩過的河砂用清水洗凈，用烘箱烘干，烘箱溫度為50 ℃，時(shí)間為2 d；將發(fā)芽盒進(jìn)行消毒，每盒取河砂500 g，均勻噴灑Hoagland營養(yǎng)液100 mL，隨后封口使溶液均勻擴(kuò)散(室溫20 ℃左右，大約時(shí)間為2 h)；將上述操作后的發(fā)芽盒放入烘箱烘干，烘箱溫度為50 ℃，大約時(shí)間為16 h，烘干后將砂盒搖勻；將上述搖勻的砂盒均勻噴灑100 mL鹽溶液，隨后封口使溶液充分滲透(室溫下20 ℃左右，2 h)，等待播種；進(jìn)行播種，播種深度為1 cm，每盒40穴，每穴1粒，共播40粒；在溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，溫室溫度設(shè)置為白天25 ℃，夜間20 ℃左右，濕度設(shè)置為70%，白天光照12 h，暗處理12 h，每日稱質(zhì)量后澆水，用自來水補(bǔ)足重量(總質(zhì)量665 g)；第8天開始記錄種子發(fā)芽數(shù)，依據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)-GB/T3543.4-1995 農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程發(fā)芽試驗(yàn)，以胚根大于種子長，胚芽大于二分之一種子長為標(biāo)準(zhǔn) ；第15天，每盒取長勢中間的5株進(jìn)行測量，測量其苗高、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量，其中干質(zhì)量測量是將所取的測完苗高和鮮質(zhì)量的5株幼苗放在鋁盒中，在80 ℃烘箱中烘至恒質(zhì)量，稱得其干質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及遺傳分析

本試驗(yàn)采用相對苗高、相對干質(zhì)量、相對鮮質(zhì)量、相對發(fā)芽率來計(jì)算高粱苗期的耐鹽強(qiáng)度[8]。公式如下：相對值=2次重復(fù)處理平均值/對照。

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對測定的高粱幼苗各項(xiàng)性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并根據(jù)單世代聯(lián)合的數(shù)量性狀分離分析方法來分析處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高粱苗期耐鹽性狀分析

2.1.1 高粱重組自交系F5部分群體鹽脅迫下的生長情況 本試驗(yàn)以耐鹽親本三尺三、鹽敏感親本Tx622B及F5群體部分材料來進(jìn)行耐鹽篩選(圖1)。從圖1中可以看出，耐鹽材料三尺三經(jīng)過鹽溶液處理后發(fā)芽及長勢雖比對照差，但整體生長比鹽敏感材料Tx622B經(jīng)過鹽溶液處理后發(fā)芽及長勢好；而它們的后代高粱重組自交系F5群體經(jīng)過鹽處理后發(fā)芽及長勢介于親本三尺三和Tx622B之間；同時(shí)也有部分材料經(jīng)過鹽處理后表現(xiàn)不如親本或出現(xiàn)超親類型。

圖1 親本及高粱重組自交系F5部分群體的生長情況Fig.1 Growth status of parent and sorghum recombinant F5 generation group

2.1.2 高粱親本及重組自交系F5群體材料耐鹽性狀分析 通過對高粱親本及重組自交系F5群體進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)(表2)?？梢园l(fā)現(xiàn)鹽處理下的父本耐鹽材料三尺三(P1)相對發(fā)芽率、相對苗高、相對苗鮮質(zhì)量、相對苗干質(zhì)量在性狀表現(xiàn)上均明顯高于母本鹽敏感材料Tx622B(P2)，各指標(biāo)之間差距均在20%以上，說明兩親本之間差異較大；而后代相關(guān)性狀平均值介于2個(gè)親本之間，與親本間也存在不同程度的變化，說明雜交后代存在不同程度的耐鹽性變異。

2.1.3 高粱重組自交系F5群體耐鹽性狀的相關(guān)性分析 對高粱重組自交系F5群體進(jìn)行相關(guān)分析，從表3可以發(fā)現(xiàn)，高粱重組自交系F5群體的發(fā)芽率、苗高、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量4個(gè)性狀之間均存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系，其中鮮質(zhì)量和苗高、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到了0.889和0.897。綜上所述，4個(gè)性狀的綜合評價(jià)可以基本說明材料的耐鹽性特征以及性狀間存在極顯著的正相關(guān)作用。

表2 高粱親本及重組自交系F5群體材料各耐鹽性狀平均值Tab.2 The average value of salt tolerance traits of sorghum parents and recombinant inbred F5 group materials

表3 高粱重組自交系F5群體耐鹽性的相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis of salinity tolerance of the F5 generation of sorghum recombinant inbred lines

注：**表示0.01水平上顯著相關(guān)。

Note：**indicates a significant correlation at 0.01 level.

2.1.4 高粱重組自交系F5群體各性狀的頻率分布圖 本試驗(yàn)為了了解各耐鹽性狀遺傳規(guī)律，對高粱重組自交系F5群體4個(gè)性狀進(jìn)行頻率分布作圖，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，高粱重組自交系F5群體4個(gè)性狀的頻率分布基本呈現(xiàn)為正態(tài)分布，說明該高粱群體的耐鹽性狀基本屬于數(shù)量性狀。

圖2 高粱重組自交系F5群體的耐鹽性性狀頻率分布統(tǒng)計(jì)Fig.2 Distribution statistics of salt tolerance of the F5 generation group of sorghum recombination

2.2 高粱耐鹽性相關(guān)性狀模型的選擇與檢驗(yàn)

高粱耐鹽性相關(guān)性狀遺傳分析運(yùn)用極大似然值、AIC值等數(shù)據(jù)，根據(jù)均勻性檢驗(yàn)(U12、U22、U32)、Smirnov檢驗(yàn)(nW2)和Kolmogorov檢驗(yàn)(Dn)對備選的遺傳模型進(jìn)行適合性檢驗(yàn)，將統(tǒng)計(jì)量個(gè)數(shù)達(dá)到顯著水平最少的模型確定為最優(yōu)模型。然后對所選定遺傳模型中的平均值、方差、分布權(quán)重的遺傳參數(shù)進(jìn)行估計(jì)。數(shù)據(jù)分析采用南京農(nóng)業(yè)大學(xué)章元明教授的單世代分離分析模型軟件。

2.2.1 不同遺傳模型下的極大似然函數(shù)值和AIC值 以單世代群體的耐鹽性相關(guān)性狀測量值為數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，應(yīng)用單世代分離分析軟件計(jì)算11個(gè)遺傳模型的極大似然函數(shù)值和AIC值(表4)。選取最小AIC值的遺傳模型作為待選的最適模型。

由表4可以看出，高粱重組自交系F5群體單個(gè)分離世代群體4個(gè)性狀的平均值在不同遺傳模型下的AIC值較小的4個(gè)遺傳模型是A-1、B-1、B-5和B-6模型。

表4 單個(gè)分離世代在不同遺傳模型下的極大似然函數(shù)值和AIC值Tab.4 Maximum likelihood function values and AIC values of a single isolated generation under different genetic models

2.2.2 發(fā)芽率、苗高、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量的適合性檢驗(yàn)結(jié)果 從中選出各性狀極大似然值、AIC值達(dá)到顯著差異數(shù)量最少的模型即可作為最優(yōu)模型。對這些模型進(jìn)行適應(yīng)性檢驗(yàn)(表5-8)。發(fā)芽率性狀數(shù)據(jù)(表5)中A-1、B-6模型均有統(tǒng)計(jì)量達(dá)到顯著，而B-1和B-5均無統(tǒng)計(jì)量達(dá)到顯著水平，因此，根據(jù)AIC值較小的確定B-5是最適合發(fā)芽率的遺傳模型。在苗高性狀數(shù)據(jù)中(表6)，除B-1遺傳模型外其他模型均有檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量達(dá)到顯著水平，因此，B-1是最適合苗高的遺傳模型。若顯著性差異數(shù)量相同，則AIC值最小的為最優(yōu)模型。在鮮質(zhì)量和干質(zhì)量性狀數(shù)據(jù)中(表7，8)，所有模型均無統(tǒng)計(jì)量達(dá)到顯著水平，因此根據(jù)AIC值較小的確定B-5是最適合鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的遺傳模型。4個(gè)性狀間具有極顯著的相關(guān)性，所得結(jié)論應(yīng)該相同，但苗高性狀與其他3個(gè)性狀遺傳模型結(jié)論不符，可能由于環(huán)境因素影響或試驗(yàn)誤差導(dǎo)致。

表5 組合模型耐鹽性狀-發(fā)芽率的適合性檢驗(yàn)Tab.5 Suitability test of salt tolerance of combined model-germination rate

注：U12、U22、U32.均勻性檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量；nW2.Smimov檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量；Dn.Kolmogorov檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量。*.0.05水平上差異顯著；**.0.01水平上差異顯著。表6-8同。

Note：U12，U22 and U32 are uniform test statistics；nW2 is the test statistic of Smimov；Dn is Kolmogorov test statistic. * indicates significant difference
at 0.05 level；** indicates significant difference at 0.01 level. The same as Tab. 6-8.

表6 組合模型耐鹽性狀-苗高的適合性檢驗(yàn)Tab.6 The suitability test of salt-toleranttraits of the combined model

表7 組合模型耐鹽性狀-鮮質(zhì)量的適合性檢驗(yàn)Tab.7 Salt tolerance of combined model-fresh weight suitability test

表8 組合模型耐鹽性狀-干質(zhì)量的適合性檢驗(yàn)Tab.8 Salt tolerance properties of combined model- dry weight suitability test

2.2.3 最優(yōu)遺傳模型的遺傳參數(shù)估計(jì) 由高粱重組自交系F5群體單個(gè)分離世代的最大似然值和AIC值確定了4個(gè)待選遺傳模型，然后對4個(gè)模型進(jìn)行了適應(yīng)性檢驗(yàn)。由上述對4個(gè)待定模型進(jìn)行的適應(yīng)性檢驗(yàn)可知B-5為最優(yōu)遺傳模型。表9-12為B-5遺傳模型的均值(Mean值)、方差(Sigma值)、權(quán)重的參數(shù)分布[9]。從下表中可以看出，基因成分分布比例基本為9∶3∶3∶1，與理論分布比例一致?？梢源_定B-5是適合高粱耐鹽性狀遺傳的遺傳模式。在B-5模型中，兩主基因的顯性效應(yīng)與其加性效應(yīng)相等，因此被稱作完全顯性主基因模型。

在B-5模型中，兩主基因的顯性效應(yīng)與其加性效應(yīng)相等，即ha=da和hb=db，為完全顯性主基因模型。表13是高粱耐鹽性狀遺傳B-5模型的一階遺傳參數(shù)和二階遺傳參數(shù)?？梢钥闯隹刂聘吡荒望}性狀，發(fā)芽率性狀遺傳的2對主基因(ha、hb)顯性效應(yīng)在B-5模型中分別為0.246 2和0.415 6；苗高性狀遺傳的2對主基因(ha、hb)顯性效應(yīng)在B-5模型中分別為10.175 0和28.539 6；鮮質(zhì)量性狀遺傳的2對主基因(ha、hb)顯性效應(yīng)在B-5模型中分別為0.103 6和0.261 7；干質(zhì)量性狀遺傳的2對主基因(ha、hb)顯性效應(yīng)在B-5模型中分別為0.003 8和0.003 8，均表現(xiàn)為正向效應(yīng)。ha和hb存在時(shí)具有使耐鹽性發(fā)芽率偏向耐鹽父本的作用，2對主基因呈完全顯性。在B-5模型中，發(fā)芽率主基因遺傳率(h2)在高粱重組自交系F5世代中為40.94%；苗高主基因遺傳率(h2)在高粱重組自交系F5世代中為31.22%；鮮質(zhì)量主基因遺傳率(h2)在高粱重組自交系F5世代中為39.19%；干質(zhì)量主基因遺傳率(h2)在高粱重組自交系F5世代中為63.98%。

表9 發(fā)芽率B-5遺傳模型的參數(shù)分布Tab.9 Parameter distribution of germination rate b-5 genetic model

注：成分分布1.AABB、AABb、AaBB、AaBb；成分分布2.aaBB、aaBb；成分分布3.AAbb、Aabb；成分分布4.aabb。
Note：Component distribution 1.AABB，AABb，AaBB，AaBb；Component distribution 2.aaBB，aaBb；Component distribution 3.AAbb，Aabb；Component distribution 4.aabb.

表10 苗高B-5遺傳模型的參數(shù)分布Tab.10 Parameters distribution of seedling height B-5 genetic model

表11 鮮質(zhì)量B-5遺傳模型的參數(shù)分布Tab.11 Parameter distribution of fresh weight B-5geneticmodel

表12 干質(zhì)量B-5遺傳模型的參數(shù)分布Tab.12 Parameters distribution of dry weight B-5genetic model

表13 單世代聯(lián)合分析性狀的遺傳參數(shù)估計(jì)Tab.13 Genetic parameter estimation of single generation joint analysis traits

注：m.耐鹽堿性狀指標(biāo)的相對平均值；ha.第1主基因顯性效應(yīng)；hb.第2主基因的顯性效應(yīng)；σp2.表型方差；σmg2.主基因方差；h2.基因遺傳率。
Note：m.Relative average value of saline-alkali resistance indexes；ha.Primary gene dominance effect；hb.The dominant effect of the main gene；σp2.phenotypic variance；σmg2.Main gene variance；h2.Genetic rate.

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)采用人工溫室砂培方法對高粱重組自交系F5群體材料進(jìn)行苗期耐鹽篩選，主要目的是將自然環(huán)境的不確定因素盡量控制在可控的范圍內(nèi)，減少環(huán)境對基因表達(dá)的互作影響。鹽堿地土壤中主要含有的是Na+、K+、Mg2+3種陽離子和CO32-、HCO3-、Cl-、SO42-4種陰離子的復(fù)合鹽堿地，鹽分比較復(fù)雜。在鹽堿化合物中，NaCl是主要的中性鹽，而Na2CO3是重要的堿性鹽[10]，因此，本試驗(yàn)鹽處理中加入了Na2CO3。本研究中設(shè)置對照組鹽濃度為1 g/L NaCl是由于環(huán)境中任何土壤中均有一定的NaCl存在。此2種方式均是為了更好模擬田間環(huán)境，與鹽堿地的實(shí)際情況更為接近所設(shè)置[11]。

高粱為中度耐鹽堿植物，不同高粱品種對鹽脅迫的響應(yīng)及其有效評價(jià)指標(biāo)也是有待探討的問題[12]。對于農(nóng)作物各個(gè)生育階段的耐鹽性評價(jià)有多種方法，其中，萌發(fā)期耐鹽性鑒定可在較短時(shí)間內(nèi)對大量的品種進(jìn)行鑒定[13]，具有可操作性強(qiáng)、周期短、效率高等特點(diǎn)，可用于大批量高粱品種的耐鹽性初步評價(jià)。由于供試材料的不同，植物耐鹽性的選擇也不盡相同[14]。張國偉等[15]、戴海芳等[16]研究認(rèn)為，地上部干質(zhì)量、株高、根系干質(zhì)量等指標(biāo)可作為棉花苗期耐鹽的鑒定指標(biāo)；根長、葉質(zhì)量可作為高梁萌發(fā)期耐鹽的鑒定指標(biāo)[17]。田伯紅等[18]在高粱和粟類等作物上已得到證實(shí)，萌發(fā)期的耐鹽性與植株生長后期的耐鹽性是一致的。從篩選結(jié)果來看，不同高粱品種的耐鹽性存在顯著差別，試驗(yàn)結(jié)果也可以對高粱萌發(fā)期的耐鹽性做出有效評價(jià)。

本試驗(yàn)采用了單世代聯(lián)合分析方法對高粱耐鹽性狀進(jìn)行遺傳分析。最終得出高粱重組自交系F5群體耐鹽性狀遺傳符合2對主基因完全顯性基因遺傳模型。確定發(fā)芽率、苗高、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量4個(gè)性狀均屬于數(shù)量性狀結(jié)果與唐朝臣等[19]、韓蕓等[20]結(jié)果一致，其中關(guān)于此四性狀均受2對主基因影響的結(jié)果與韓蕓等[20]結(jié)果一致。但耐鹽性狀的主基因表現(xiàn)方式與遺傳率并不完全相同[21]。造成這個(gè)結(jié)果可能是由于所用的材料世代與遺傳背景不同[22-23]。高粱不同品種間的基因不盡相同，對于高粱耐鹽性的遺傳分析還有待進(jìn)一步研究。這些研究將為下一步開展耐鹽性基因的QTL定位提供參考。