豬圓環(huán)病毒2型SYBRGreen Real-time qPCR檢測(cè)方法的建立

馮 華，劉運(yùn)超，陳玉梅，魏 薔，張改平，2

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；3.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)院，河南 鄭州 450001)

豬圓環(huán)病毒(Porcinecircovirustype，PCV)屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)、圓環(huán)病屬(Circovirusgenus)[1]。1974年由德國(guó)人Tischer在豬腎細(xì)胞(Porcine kidney cell)中發(fā)現(xiàn)，1982年被命名為豬圓環(huán)病毒，是迄今為止動(dòng)物病毒中最小的DNA病毒[2-3]。PCV病毒呈20面體對(duì)稱，無囊膜，直徑為17～22 nm。病毒基因組是一條共價(jià)單股環(huán)狀DNA病毒，全長(zhǎng)1 766～1 768 bp[4]，包含2個(gè)重要的開放閱讀框：ORF1全長(zhǎng)904 bp，主要編碼與病毒復(fù)制有關(guān)的蛋白R(shí)ep和Rep′蛋白；ORF2全長(zhǎng)702 bp或705 bp是區(qū)分不同PCV2亞型的主要區(qū)域，編碼結(jié)構(gòu)蛋白cap，該蛋白是主要的免疫原蛋白。根據(jù)病毒的基因組成和抗原性的不同，病毒主要分為豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)。PCV2型主要侵染動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，降低動(dòng)物免疫應(yīng)答能力，造成免疫功能障礙，機(jī)體抵抗力下降，是能夠引起豬類多種臨床疾病的主要病原體，如斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)、豬呼吸道疾病綜合征(Porcine respiratory disease complex，PRDC)、豬皮炎腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)和新生仔豬先天性震顫(Congenital tremors，CT)等[5-6]。近年來，PCV2在國(guó)內(nèi)和國(guó)外迅速傳播，并且流行范圍不斷擴(kuò)大，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[7]。

目前，PCV2的診斷和預(yù)防也成為近年來PCV研究的熱點(diǎn)。臨床上用來檢測(cè)PCV2的主要診斷方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、單層過氧化物酶試驗(yàn)(IPMA)和常規(guī)PCR等。其中，ELISA、IFA和IPMA主要用于PCV2血清的檢測(cè)[8-10]，但是檢測(cè)過程復(fù)雜，消耗時(shí)間過長(zhǎng)；雖然常規(guī)PCR檢測(cè)PCV2的方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床樣品的檢測(cè)[11]，但是該方法不能實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒量的精確分析，且靈敏度相對(duì)較低，易出現(xiàn)假陽(yáng)性，無法檢測(cè)豬場(chǎng)的隱性感染。相比上述方法，熒光定量PCR檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠檢測(cè)到較低拷貝數(shù)的PCV2病毒，針對(duì)豬場(chǎng)的隱性感染能有效檢測(cè)，適合用于PCV2臨床樣品的檢測(cè)。許多學(xué)者建立了成熟的基于熒光定量PCR的PCV2臨床檢測(cè)方法。李鵬等[12]根據(jù)PCV2ORF1設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物建立了SYBR Green Real-time PCR檢測(cè)PCV2的方法，該檢測(cè)方法的靈敏度比常規(guī)PCR檢測(cè)方法高10倍，最低檢出量為10～100個(gè)拷貝/mL，與PRRSV、PRV、CSFV、PPV沒有交叉反應(yīng)，特異性比較高。于靜等[13]建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法靈敏度比較高，可以達(dá)到10個(gè)拷貝/mL，在檢測(cè)的34份陽(yáng)性臨床樣品中，檢測(cè)符合率為100%，明顯高于普通PCR方法的50%。郭慧娟等[14]建立的Taq Man熒光定量PCR檢測(cè)PCV2的方法最低可以檢測(cè)4.53×102個(gè)拷貝/mL，比普通PCR檢測(cè)方法高100倍，并且與其他病毒沒有交叉反應(yīng)，重復(fù)性好，特異性高。

本試驗(yàn)根據(jù)熒光定量PCR原理，設(shè)計(jì)針對(duì)PCV2ORF2序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過對(duì)多種條件的優(yōu)化，擬建立一種快速、靈敏、特異的基于SYBRGreen熒光定量PCR(SYBRGreen Real-time qPCR)的PCV2診斷方法，旨在為PCV2臨床診斷及研究提供科學(xué)的診斷方法。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

病毒株、細(xì)胞株和載體：PCV2-zz毒株由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室臨床分離得到，豬瘟病毒(CSFV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病毒(PRV)為本實(shí)驗(yàn)室保存。豬圓環(huán)病毒疑似病料為2015年河南省多個(gè)地區(qū)送檢的發(fā)病豬的脾臟和淋巴結(jié)。PK-15細(xì)胞、PMD19-T載體和JM109大腸桿菌由本實(shí)驗(yàn)室保存。

主要試劑：SYBRGreen I PreMix聚合酶、DL2000 Marker、ExTaq酶等為大連寶生物工程公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、病毒基因組提取試劑盒等購(gòu)自O(shè)MEGA公司。DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自HyClone公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的PCV2ORF2基因序列設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物(表1)。其中P1含有NheⅠ的酶切位點(diǎn)，P2含有PmeⅠ的酶切位點(diǎn)用于構(gòu)建作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的載體pMD19T-ORF2和常規(guī)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增長(zhǎng)度為702 bp；P3、P4為用于熒光定量PCR檢測(cè)的特異引物，擴(kuò)增長(zhǎng)度為122 bp。2對(duì)引物均由上海生工生物工程服務(wù)有限公司合成。

1.3 病毒DNA的提取

將臨床分離到的PCV2-zz接種到PK-15細(xì)胞上傳代，傳至第10代后，反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心10 min，收集病毒，使用OMEGA公司的病毒基因組提取試劑盒提取PCV2的DNA，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 pMD19T-ORF2陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以提取的PCV2的DNA為模板，利用特異性引物P1和P2對(duì)PCV2ORF2的基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為25 μL：ExTaq12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，加滅菌水補(bǔ)齊25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃ 變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，利用膠回收試劑盒回收純化，并與pMD-19T載體連接，經(jīng)過酶切、測(cè)序鑒定，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD19T-ORF2，作為構(gòu)建熒光定量PCR的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板。

表1 用于pMD19T-ORF2構(gòu)建、常規(guī)PCR和SYBRGreen Real-time qPCR的引物Tab.1 Primers used for pMD19T-ORF 2 construction，standard PCR and SYBRGreen Real-time qPCR

注：下劃線表示酶切位點(diǎn)。

Note:Underlined indicate restriction site.

1.5 SYBRGreen Real-time qPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

為了獲得熒光定量PCR的最佳反應(yīng)條件，本試驗(yàn)以pMD19T-ORF2作為模板對(duì)熒光定量PCR的各反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，包括對(duì)引物(P3/P4)的工作濃度、退火溫度等條件的優(yōu)化。分別以終濃度為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 μmol/L的引物進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，根據(jù)Ct值和擴(kuò)增曲線確定引物的最佳工作濃度；并分別以55，58，60，62，64 ℃作為退火溫度對(duì)熒光定量PCR進(jìn)行相應(yīng)的優(yōu)化，根據(jù)Ct值獲得最佳的退火溫度。

1.6 SYBRGreen Real-time qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定pMD19T-ORF2濃度，計(jì)算重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)，調(diào)整質(zhì)粒濃度并將其從3×108個(gè)拷貝/mL 10倍系列稀釋到3×102個(gè)拷貝/mL作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)，以起始標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值(lg)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)做回歸曲線，建立PCV2檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)該反應(yīng)的溶解曲線進(jìn)行分析。

1.7 SYBRGreen Real-time qPCR方法的檢測(cè)限分析

以稀釋后的pMD19T-ORF2(3×108～3×102個(gè)拷貝/mL)為模板，分別用P1/P2、P3/P4引物進(jìn)行普通PCR和熒光定量PCR，并對(duì)2種方法的檢測(cè)限進(jìn)行分析。

1.8 SYBRGreen Real-time qPCR方法的特異性檢測(cè)

利用病毒基因組提取試劑盒分別提取PPV和PRV的DNA，提取PRRSV和CSFV的RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA；分別以其為模板，采用SYBR Green Real-time qPCR方法進(jìn)行檢測(cè)，并以pMD19T-ORF2(3×108～3×104個(gè)拷貝/mL)為模板作為陽(yáng)性對(duì)照，設(shè)立空白對(duì)照組，以檢測(cè)該方法的特異性。

1.9 SYBRGreen Real-time qPCR方法的重復(fù)性試驗(yàn)

以不同拷貝數(shù)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)。選取3×107，3×106，3×105個(gè)拷貝/mL 這3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行該熒光定量PCR，每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)，平行做3次。根據(jù)結(jié)果依次對(duì)Ct值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.10 臨床樣品的檢測(cè)

本次用來檢測(cè)的臨床樣品為34份，利用病毒基因組提取試劑盒提取相關(guān)DNA，用建立的PCV2 SYBR Green熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 pMD19T-ORF2陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備

2.1.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定 以PCV2-zz DNA為模板，用P1和P2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠結(jié)果顯示，目的片段大小約為702 bp，與預(yù)測(cè)的結(jié)果相一致(圖1)。

M.DL2000；1.PCV2-CAP 擴(kuò)增產(chǎn)物。M.DL2000；1.PCR product of PCV2-CAP.

2.1.2 重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物鑒定 將從感受態(tài)細(xì)胞JM109中獲得的pMD19T-ORF2重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定顯示在702 bp處有目的條帶出現(xiàn)，表明目的片段成功插入pMD-19T載體中(圖2)。另外，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期的片段相一致。

M.DL10000；1.雙酶切產(chǎn)物。M.DL10000；1.Double digests.

2.2 SYBRGreen Real-time qPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

本試驗(yàn)對(duì)熒光定量PCR反應(yīng)的引物濃度和退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，在引物的最佳終濃度為0.2 μmol/L，最適退火溫度為55 ℃。因此，25 μL反應(yīng)體系包括SYBRGreen I PreMix聚合酶12.5 μL，上下游引物(10 μmol/mL)各0.5 μL，模板1 μL，超純水10.5 μL；最適反應(yīng)條件為：94 ℃，10 s；94 ℃變性5 s、60 ℃退火10 s、72 ℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)。

2.3 SYBRGreen Real-time qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以10倍系列稀釋的pMD19T-ORF2(3×108，3×107，3×106，3×105，3×104，3×103，3×102個(gè)拷貝/mL)作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，通過對(duì)Ct值結(jié)果的分析，建立PCV2擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=-3.092 2x+31.304，其斜率為3.092 2，相關(guān)系數(shù)是0.998 5，結(jié)果顯示，其線性結(jié)果好(圖3)。從熒光定量PCR溶解曲線的分布圖3可以看出，溶解曲線的特征峰比較單一，并且擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度在77～79 ℃，說明熒光定量PCR的擴(kuò)增沒有形成引物二聚體，也沒有出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物。

2.4 常規(guī)PCR與SYBRGreen Real-time qPCR靈敏度的對(duì)比

同樣以濃度為3×108～3×102個(gè)拷貝/mL 的pMD19T-ORF2為模板，P1和P2為引物進(jìn)行常規(guī)PCR，并對(duì)常規(guī)PCR檢測(cè)限進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明(圖4)，常規(guī)PCR的最小檢出量為3×104個(gè)拷貝/mL；而針對(duì)同樣的模板，熒光定量PCR的最小檢出量為3×102個(gè)拷貝/mL，比常規(guī)PCR高100倍，說明該熒光定量PCR對(duì)PCV2的檢測(cè)更敏感。

2.5 SYBRGreen Real-time qPCR特異性檢測(cè)結(jié)果

用所建立的SYBRGreen Real-time qPCR方法對(duì)CSFV、PPV、PRRSV、PRV這些病毒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，只有pMD19T-ORF2陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，而針對(duì)CSFV、PRRSV、PRV等病毒無擴(kuò)增；此外，針對(duì)PPV病毒在Ct值為38.16時(shí)出現(xiàn)微量擴(kuò)增，由于CT>31判定為陰性(表2)。檢測(cè)結(jié)果證明，所建立的SYBRGreen Real-time qPCR方法特異性較高。

A.標(biāo)準(zhǔn)曲線；B.擴(kuò)增曲線；C.溶解曲線。A.Standard curve;B.Amplification curve;C.Melting curve.

M.DL2000 Marker；1～7.標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度為3×108～3×102拷貝/mL；8.陰性對(duì)照。M.DL2000 Marker；1-7.Different template concentrations from 3×108 copies/mL to 3×102 copies/mL；8.Negative control.

2.6 SYBRGreen Real-time qPCR可重復(fù)性試驗(yàn)分析

為了驗(yàn)證SYBRGreen熒光定量PCR檢測(cè)PCV2方法的穩(wěn)定性，分別選取3×107，3×106，3×105個(gè)拷貝/mL做組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果表明，組內(nèi)重復(fù)檢測(cè)的Ct值誤差小于0.2，變異系數(shù)在0.29%～0.32%；組間重復(fù)檢測(cè)的Ct值誤差小于0.2，變異系數(shù)在0.32%～0.36%(表3)，表明該方法具有很好的重復(fù)性。

表2 SYBRGreen Real-time qPCR特異性檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Result of specificity of the SYBRGreen Real-time qPCR

表3 SYBRGreen Real-time qPCR批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 The reproducibility of inter- assay and intra-assay for the SYBRGreen Real-time qPCR

2.7 臨床樣品檢測(cè)

利用SYBRGreen Real-time qPCR和普通PCR對(duì)38份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示(表4)，用SYBRGreen Real-time qPCR檢測(cè)PCV2的方法共檢測(cè)到陽(yáng)性樣品31份，檢出率為81.5%(31/38)；用普通PCR檢測(cè)PCV2的方法共檢測(cè)到26份陽(yáng)性樣品，檢出率為68.4%(26/38)。該熒光定量PCR的檢出率相比普通PCR高出13.1%，說明熒光定量PCR敏感性高于普通PCR，更適合臨床樣品的檢測(cè)。

表4 SYBRGreen Real-time qPCR與普通PCR臨床樣品檢測(cè)結(jié)果的比較Tab.4Comparison between SYBRGreen Real-time qPCR and conventional PCR for clinical sampled etection

3 結(jié)論與討論

PCV是引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(Porcine circovirus associated disease，PCVAD)的主要病原，該病毒增殖快、毒力強(qiáng)、更容易破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)，引起免疫能力下降，繼而造成其他病毒或細(xì)菌混合感染，給疾病的診斷和治療帶來了極大的困難[15-17]。因此，對(duì)PCV2感染早期臨床快速診斷就顯得尤為重要。在PCV2的主要檢測(cè)方法中，血清學(xué)檢測(cè)通常采用病毒中和試驗(yàn)和ELISA方法，但這些檢測(cè)手段比較復(fù)雜，技術(shù)要求高，耗時(shí)長(zhǎng)；尤其是病毒中和試驗(yàn)，該檢測(cè)方法對(duì)病毒分離鑒定及抗體要求比較高。另外，在ELISA檢測(cè)過程中，操作不規(guī)范極易造成假陽(yáng)性結(jié)果[18]，不同的血清稀釋度對(duì)ELISA檢測(cè)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)也會(huì)有影響。由于PCV2是DNA病毒，常規(guī)PCR在DNA水平檢測(cè)PCV2是有效手段[19]，但與熒光定量PCR相比，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，耗時(shí)也比較長(zhǎng)，檢測(cè)敏感度較低，對(duì)于含毒量比較低的豬群則不易檢出，因此，對(duì)于亞臨床感染豬群，常規(guī)PCR會(huì)造成漏檢。目前，熒光定量PCR是國(guó)內(nèi)檢測(cè)PCV2的最有效的手段，它能以數(shù)值的形式更直觀地判斷豬群感染PCV2的情況，并且具有靈敏性高、特異性強(qiáng)、耗時(shí)短的優(yōu)點(diǎn)[20-21]。

本研究通過參考已經(jīng)報(bào)道PCV1和PCV2全基因序列差異性的文章[22-23]，分析2種亞型在ORF2片段區(qū)的差異，從而選取了PCV2ORF2的相對(duì)保守區(qū)，在保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，建立了一種SYBRGreen Real-time qPCR檢測(cè)PCV2的診斷方法。該方法與CSFV、PPV、PRRSV和PRV這些病毒的核酸均無交叉反應(yīng)，說明該方法的特異性強(qiáng)。通過對(duì)溶解曲線的分析得出在擴(kuò)增過程中未產(chǎn)生引物二聚體和非特異性擴(kuò)增，并且擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度在79～81℃波動(dòng)，屬于正常波動(dòng)范圍。根據(jù)不同的稀釋倍數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品擴(kuò)增得到的Ct值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.092 2x+ 31.304，其斜率為3.0922，相關(guān)系數(shù)是0.998 5，結(jié)果顯示其線性較好。組內(nèi)重復(fù)檢測(cè)和組間重復(fù)檢測(cè)的變異系數(shù)都低于0.32%，說明熒光定量PCR具有很好的重復(fù)性。熒光定量PCR對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的最小檢出量為3×102個(gè)拷貝/mL，比常規(guī)PCR方法高出100倍，與其他研究學(xué)者所建立的熒光定量PCR檢測(cè)PCV2方法的敏感性相差較小[24-26]。在38份臨床檢測(cè)樣品中，熒光定量PCR陽(yáng)性樣品檢出率為81.5%，明顯高于普通PCR的68.4%。結(jié)果表明，該試驗(yàn)所建立的豬圓環(huán)病毒2型SYBRGreen Real-time PCR檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、耗時(shí)短，適合臨床樣品的檢測(cè)，該方法的建立為PCV2流行病學(xué)的調(diào)查和臨床疫病的檢測(cè)提供了技術(shù)支持，同時(shí)為疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)提供了參考依據(jù)。