CD44v6、Transgelin、Transgelin2在結(jié)直腸癌的表達(dá)及預(yù)后意義

曹永 鄭慧哲 金在順 呂強(qiáng)（通訊作者） 高曉虹（通訊作者）

（1遵義醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理教研室 貴州 遵義 563099）

（2牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院 黑龍江 牡丹江 157011）

（3牡丹江醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 黑龍江 牡丹江 157011）

（4遵義醫(yī)學(xué)院生理教研室 貴州 遵義 563099）

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是一種多基因疾病，由抑制基因、致癌基因、錯(cuò)配修復(fù)基因以及細(xì)胞周期調(diào)控基因的改變引起[1]。雖然近年相繼報(bào)道了一些腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物如CD133、CD44等以及結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)分子標(biāo)記物如IMP3、S100A2等[2]，但隨著干細(xì)胞標(biāo)記物的深入研究證實(shí)多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展都與CD44v6有密切關(guān)系[3]，CD44v6是最早發(fā)現(xiàn)的一種CD44粘附分子，在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要促進(jìn)作用[4]，但CD44v6是否可作為獨(dú)立判斷結(jié)直腸癌預(yù)后標(biāo)記物的研究報(bào)道甚少。因此，本研究擬聯(lián)合檢測(cè)CD44v6和Transgelin、Transgelin2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)，并分析其與臨床病理特征及對(duì)預(yù)后生存的影響。

1.材料與方法

1.1 材料

收集徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院（2005～2008年）資料完整的原發(fā)性結(jié)直腸癌112例及相應(yīng)癌旁組織，男62例，女50例，年齡21～87歲，平均53.6歲，病例依據(jù)（AJCC）TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ、Ⅱ期59例，Ⅲ、Ⅳ期53例，低分化32例，高-中分化80例（表1）。實(shí)驗(yàn)標(biāo)本征得徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1.2 試劑和方法

標(biāo)本制成組織微陣列（tissue microarray，TMA），厚4um連續(xù)切片，采用S-P（streptavidin-perosidase）試劑盒（福州邁新）檢測(cè)3種抗體：CD44v6（ABD serotec，貨號(hào)∶MCA1730）、Transgelin（Proteintech，貨號(hào)：10493-1-AP）和Transgelin2（Proteintech，貨號(hào)：10234-2-AP）。Transgelin、Transgelin2（1∶150稀釋?zhuān)?、CD44v6（1∶200稀釋?zhuān)?，?.01mol/L枸櫞酸鹽酸緩沖液（pH6.0）高溫高壓法行抗原修復(fù)，PBS液代替一抗做空白對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

分析陽(yáng)性細(xì)胞占同類(lèi)細(xì)胞的百分比及陽(yáng)性細(xì)胞的著色強(qiáng)度，判斷免疫組化結(jié)果。三種蛋白均成棕褐色表達(dá)，CD44v6線性表達(dá)于細(xì)胞膜，Transgelin顆粒狀表達(dá)于細(xì)胞核，Transgelin2顆粒狀表達(dá)于胞漿；每例標(biāo)本觀察5個(gè)視野（400倍），計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，染色強(qiáng)度：無(wú)染色為0，輕度染色為1，中度染色為2，強(qiáng)染色為3；陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比：0分為陽(yáng)性細(xì)胞＜10%，1分為10%～30%，2分為30%～50%，3分為50%～70%，4分為70%～100%，兩種積分相乘，依照0為陰性（-），1～3為弱陽(yáng)性（+），4～8為陽(yáng)性（++），9～12為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。免疫組化結(jié)果由兩名病理科醫(yī)生獨(dú)立判讀，判讀結(jié)果不一致時(shí)，由第三方病理醫(yī)生參與協(xié)商做出判讀。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0和Stata12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分別用以秩和檢驗(yàn)、Pearman相關(guān)分析、Kaplan-Meier生存分析、Cox模型分析。

2.結(jié)果

2.1 CD44v6、Transgelin、Transgelin2 表達(dá)

三種蛋白均為棕褐色表達(dá)，CD44v6在112例結(jié)直腸癌中陽(yáng)性表達(dá)74例（66.1%），呈線性分布于癌細(xì)胞膜，癌巢及周邊區(qū)域表達(dá)明顯增強(qiáng)（圖1-A、B、C、D），癌旁無(wú)表達(dá)。Transgelin有94例（83.9%）陽(yáng)性表達(dá)，呈顆粒狀表達(dá)于細(xì)胞核，（圖1-E、F、G、H），癌旁間質(zhì)偶有表達(dá)。Transgelin2有71例（63.4%）呈棕褐色顆粒表達(dá)于癌細(xì)胞漿，（圖1-I，J、K、L），癌旁組織偶有表達(dá)。

圖1 CD44v6、Transgelin和Transgelin2免疫組化染色

2.2 Transgelin、Transgelin2、CD44v6表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

CD44v6與結(jié)直腸癌腫瘤大?。é?=22.002，P=0.000）、AJCC分期（χ2=30.023，P=0.000）、組織學(xué)分級(jí)（χ2=14.638，P=0.002）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=34.504，P=0.000）密切相關(guān)；Transgelin與組織學(xué)分級(jí)（χ2=22.409，P=0.000）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=7.932，P=0.047）顯著相關(guān)；Transgelin2與AJCC分期（χ2=32.594，P=0.000），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=12.406，P=0.006）顯著相關(guān)。

2.3 CD44v6、Transgelin、Transgelin2的相關(guān)關(guān)系

結(jié)直腸癌中Transgelin 和Transgelin2為負(fù)相關(guān)性（r=-0.228，P=0.016），Transgelin和CD44v6無(wú)相關(guān)性（P＞0.05），Transgelin2和 CD44v6呈正相關(guān)（r=0.556，P=0.000），Transgelin2和CD44v6在結(jié)直腸癌中起相互促進(jìn)作用。

2.4 CD44v6、Transgelin、Transgelin2表達(dá)與各臨床病理參數(shù)對(duì)患者預(yù)后影響

Kaplan-Meier生存分析如圖2示，CD44v6陽(yáng)性患者術(shù)后五年生存率明顯低于陰性患者（P=0.000）（圖2-i），而Transgelin、Transgelin2表達(dá)患者術(shù)后五年生存率與陰性患者無(wú)顯著差異（P=0.386，P=0.982）（圖2-g，h）；腫瘤大小，AJCC分期，組織學(xué)分級(jí)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（圖2-c，d，e，f）均與預(yù)后明顯相關(guān)（P=0.000），而性別、年齡與生存無(wú)關(guān)（P=0.956，P=0.508）（圖2-a，b）。

圖2 CD44v6、Transgelin、Transgelin2與臨床病理特征的Kaplan-Meier分析

2.5 Cox模型分析

經(jīng)Cox分析顯示：腫瘤大小[HR（95%CI）：0.573（0.361～0.908）；P=0.018]、組織學(xué)分級(jí)（Poor）[HR（95%CI）：13.408（5.330～33.728）；P=0.000]、AJCC 分期（Ⅲ+Ⅳ）[HR（95%CI）：5.051（2.959～8.621）；P=0.000]、 CD44v6[HR（95%CI）：0.277（0.131～0.587）；P=0.001]均可作為判斷結(jié)直腸癌預(yù)后的指標(biāo)。（HR：hazard ratio；CI∶confidence interval）

3.討論

人類(lèi)CD44基因因其結(jié)構(gòu)中外顯子的差異分為：CD44（s）標(biāo)準(zhǔn)型和CD44（v）變異型[5]，而CD44v6是最早發(fā)現(xiàn)的一種CD44粘附分子，在腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要促進(jìn)作用[4，6]。已證實(shí)乳腺癌等多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移都與CD44v6有密切關(guān)系[3]。Matilde Todaro等[7]發(fā)現(xiàn)CD44v6可能是一個(gè)功能性生物標(biāo)記分子又是結(jié)直腸癌干細(xì)胞治療性靶點(diǎn)之一。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中CD44v6表達(dá)顯著高于癌旁組織，并且CD44v6表達(dá)與腫瘤大小、AJCC分期、組織學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均關(guān)系密切，并隨著腫瘤細(xì)胞分裂增多，癌巢周邊其陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)，可能與腫瘤干細(xì)胞分裂旺盛及蛋白表達(dá)增多相關(guān)。本研究通過(guò)Kaplan-Meier和Cox分析發(fā)現(xiàn)，CD44v6表達(dá)患者術(shù)后五年生存率明顯低于陰性患者，進(jìn)一步明確CD44v6可作為判斷結(jié)直腸癌預(yù)后的獨(dú)立標(biāo)記物。

Transgelin也被稱(chēng)為SM22[6-8]、轉(zhuǎn)膠蛋白等，并證實(shí)存在于細(xì)胞骨架中[9]，Transgelin可通過(guò)抑制HT1080細(xì)胞中MMP9表達(dá)而抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移[10]。Transgelin2是Transgelin的同系物，其具體功能作用機(jī)制不詳。本研究發(fā)現(xiàn)Transgelin表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，Transgelin2與結(jié)直腸癌AJCC分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，預(yù)后分析顯示，Transgelin和Transgelin2都不可作為判斷結(jié)直腸癌預(yù)后的標(biāo)記物，但可作為評(píng)判腫瘤進(jìn)展能力的指標(biāo)。研究還發(fā)現(xiàn)癌組織中Transgelin和Transgelin2的表達(dá)均比正常組織增強(qiáng)，其研究結(jié)果與Shields JM[11]、Kaplan-Alberquerque[12]等的研究結(jié)論不同，同時(shí)揭示，Transgelin和Transgelin2在結(jié)直腸癌中呈負(fù)相關(guān)，即二者在腫瘤發(fā)生發(fā)展中呈相互抑制作用，這在以前研究結(jié)果中鮮有報(bào)道。至于Transgelin和Transgelin2在不同惡性腫瘤中表達(dá)的不同以及功能的差異，可能因樣本量、地區(qū)差異、實(shí)驗(yàn)試劑等多方面因素導(dǎo)致。

CD44v6和Transgelin2表達(dá)呈正相關(guān)，說(shuō)明CD44v6和Transgelin2的協(xié)同表達(dá)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起相互促進(jìn)作用，此結(jié)果與Lee等[13]報(bào)道轉(zhuǎn)膠蛋白可促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的侵襲和遷移，腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)膠蛋白的表達(dá)量高于非腫瘤細(xì)胞中的25倍相符，研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)膠蛋白具有促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞侵襲和遷移的功能。轉(zhuǎn)膠蛋白在結(jié)直腸癌中即促進(jìn)腫瘤的發(fā)展又與CD44v6相互作用影響腫瘤惡性進(jìn)展，但其作用機(jī)制尚不清楚。

綜上所述，CD44v6可作為獨(dú)立判斷結(jié)直腸癌預(yù)后的生物標(biāo)記物，而Transgelin和Transgelin2可作為評(píng)判腫瘤進(jìn)展能力的參考指標(biāo)。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步探討三者在分子通路中的相關(guān)作用機(jī)制。