基于時(shí)間序列模型評(píng)估淀粉樣蛋白引起的腦血管內(nèi)皮功能損傷

朱成燕，劉昊晨，何 華，柳曉泉

(中國(guó)藥科大學(xué)藥代動(dòng)力學(xué)教研室，南京 210009)

阿爾茲海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)隨年齡增加而增大，嚴(yán)重危害老年人健康[1]，目前發(fā)病機(jī)制尚不明確。流行病學(xué)研究表明AD和腦血管疾病之間存在很多共通之處，糖尿病、高血壓、肥胖等都是其共同風(fēng)險(xiǎn)因素[2-3]。在AD尚未出現(xiàn)臨床癥狀前，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷會(huì)加劇神經(jīng)元損傷，腦血管內(nèi)皮功能在AD疾病進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用[4]。Aβ作為AD疾病進(jìn)程中的重要生物標(biāo)記物，大量文獻(xiàn)報(bào)道其在腦內(nèi)積聚會(huì)引起神經(jīng)毒性[5]。針對(duì)Aβ引起的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷進(jìn)行研究，有助于加深對(duì)AD發(fā)病機(jī)制的理解。

目前文獻(xiàn)報(bào)道的有關(guān)Aβ對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷主要包括線粒體功能損傷和血管舒張障礙。一方面細(xì)胞膜上鈣離子通道轉(zhuǎn)運(yùn)活性增加，胞外Ca2+內(nèi)流增加，線粒體作為調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)的重要細(xì)胞器，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+超載時(shí)，線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔打開(kāi)線粒體膜電位(MMP)下降，釋放細(xì)胞色素C和其他促凋因子，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[6]。另一方面，Ca2+內(nèi)流會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性下降，內(nèi)皮型NO合成減少，造成血管舒張功能受損[7]。相關(guān)機(jī)制如圖1所示。

Figure1 Mechanism of cerebral endothelial impairment induced by beta amyloid (Aβ)

目前對(duì)Aβ引起的腦血管內(nèi)皮功能損傷研究主要集中于機(jī)制的探討，尚無(wú)對(duì)疾病進(jìn)程的動(dòng)態(tài)評(píng)估。時(shí)間序列模型是一種廣泛應(yīng)用的數(shù)量分析方法，多用于分析現(xiàn)象隨時(shí)間變化的波動(dòng)規(guī)律[8]。向量自回歸模型(vector autoregressive model，VAR)是最常用的多元回歸時(shí)間序列分析技術(shù)之一，該模型聯(lián)立多個(gè)方程式，且任一內(nèi)生變量與所有內(nèi)生變量的滯后值形成回歸，可以用來(lái)估計(jì)聯(lián)合內(nèi)生變量之間的動(dòng)態(tài)關(guān)系[9]。

本研究根據(jù)實(shí)驗(yàn)獲得Aβ誘導(dǎo)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的時(shí)間序列，基于VAR模型描述相關(guān)生物標(biāo)記物之間的動(dòng)態(tài)關(guān)系以及評(píng)價(jià)不同標(biāo)記物結(jié)構(gòu)沖擊的重要性，考察相關(guān)標(biāo)記物對(duì)細(xì)胞損傷的影響和貢獻(xiàn)程度并探討給藥策略。

1 材 料

1.1 試 劑

人源[Gly22]-淀粉樣蛋白1-42(美國(guó)Sigma公司)；Fluo-4鈣離子試劑盒、RPMI-1640培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗(美國(guó)賽默飛世爾公司)；一氧化氮合成酶檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒、L-刀豆氨酸(中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司)；牛血清白蛋白(美國(guó)Biological Industries Beit Haemek公司)；0.25%蛋白胰酶消化液、無(wú)菌DMSO(中國(guó)上海翊圣有限公司)；噻唑藍(lán)(中國(guó)生興生物有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀 器

Milli-Q Gradient A10超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)；萬(wàn)分之一電子分析天平(美國(guó)梅特勒托利多公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)；生物安全柜、CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；高壓滅菌鍋(日本Tomy公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.3 細(xì)胞株

永生化人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株由中國(guó)藥科大學(xué)劉曉東教授惠贈(zèng)。

2 方 法

2.1 HCMEC/D3細(xì)胞培養(yǎng)

HCMEC/D3培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中，其中含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素，在37 ℃且含5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，消化傳代，按不同實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行稀釋。其中，細(xì)胞活力檢測(cè)法[10]細(xì)胞濃度為每毫升1.5×104個(gè)，鈣離子濃度測(cè)定[11]細(xì)胞濃度為每毫升2×105個(gè))，eNOS測(cè)定[12-13]細(xì)胞濃度為每毫升1×105個(gè)。將稀釋好的細(xì)胞懸液按照每孔200 μL接種到預(yù)包被的96孔板中，測(cè)定線粒體膜電位時(shí)將稀釋好的細(xì)胞懸液(每毫升1×105個(gè))按照每孔1 mL接種到預(yù)包被的24孔板中[14]，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞活力測(cè)定

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和Aβ組，對(duì)照組為正常培養(yǎng)基，Aβ組為含2.5 μmol/L Aβ的RPMI 1640培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24 h后，去除各孔培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS緩沖液潤(rùn)洗2遍。每孔加入0.5 mg/mL的噻唑藍(lán)溶液150 μL，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。吸去噻唑藍(lán)溶液，每孔加入DMSO 150 μL，37 ℃振搖溫孵10 min，使結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀在37 ℃下測(cè)定，以不含細(xì)胞的孔為空白對(duì)照，490 nm波長(zhǎng)處讀取相應(yīng)吸收度。并使用公式(1)進(jìn)行計(jì)算。

Viability=(AAβ-Ablank)/(Acontrol-Abl)×100%

(1)

式中：AAβ是Aβ組的吸收度；Ablank是空白孔的吸收度；Acontrol是對(duì)照組的吸收度。

2.3 鈣離子濃度測(cè)定

Fluo-4 NW作為一種熒光探針用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和Aβ組，對(duì)照組為正常培養(yǎng)基，Aβ組為含2.5 μmol/L Aβ的RPMI 1640培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24 h后，去除各孔培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS緩沖液潤(rùn)洗2遍。每孔加入加樣緩沖液100 μL，其中在一空白組加入1%Triton X-100 10 μL視為最大鈣離子組，另一空白組加入50 mmol/L EGTA 10 μL視為最小鈣離子組，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育40 min。直接取該96孔板使用多功能酶標(biāo)儀在37 ℃下測(cè)定，激發(fā)波長(zhǎng)494 nm，發(fā)射波長(zhǎng)515 nm，讀取相應(yīng)熒光強(qiáng)度。胞漿鈣離子濃度使用公式(2)進(jìn)行計(jì)算。

(2)

式中：Kd為結(jié)合常數(shù)，一般為345 nmol/L；FAβ為Aβ組熒光強(qiáng)度；Fmin為最小鈣離子組熒光強(qiáng)度；Fmax為最大鈣離子組熒光強(qiáng)度。

2.4 eNOS活性測(cè)試

采用熒光檢測(cè)探針DAF-FM DA測(cè)定eNOS活性。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和Aβ組，對(duì)照組為正常培養(yǎng)基，Aβ組為含2.5 μmol/L Aβ的RPMI 1640培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24 h后，去除各孔培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS緩沖液潤(rùn)洗2遍。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配制NOS檢測(cè)緩沖液和NOS檢測(cè)反應(yīng)液，其中，NOS檢測(cè)緩沖液中加入L-刀豆氨酸，L-刀豆氨酸終濃度為500 μmol/L。每孔加入NOS檢測(cè)緩沖液100 μL，再加入檢測(cè)反應(yīng)液100 μL，輕輕混勻。在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育40 min。使用多功能酶標(biāo)儀在37 ℃下測(cè)定，以不含細(xì)胞的孔為空白對(duì)照，激發(fā)波長(zhǎng)495 nm，發(fā)射波長(zhǎng)515 nm，讀取相應(yīng)熒光強(qiáng)度。以對(duì)照組的eNOS活力為1，加了Aβ后eNOS的相對(duì)活力使用公式(3)進(jìn)行計(jì)算。

eNOSactivity=(FAβ-Fblank)/(Fcontrol-Fblank)×100%

(3)

式中：FAβ是Aβ組熒光強(qiáng)度；Fblank是空白孔熒光強(qiáng)度；Fcontrol是對(duì)照組熒光強(qiáng)度。

2.5 線粒體膜電位測(cè)定

JC-1是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位測(cè)定的熒光探針。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和Aβ組，對(duì)照組為正常培養(yǎng)基，Aβ組為含2.5 μmol/L Aβ的RPMI 1640培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24 h后，去除各孔培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS緩沖液潤(rùn)洗2遍。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配制JC-1染色液，每孔加入JC-1染色工作液300 μL和培養(yǎng)基300 μL，充分混勻，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育20 min。在孵育期間，配制JC-1染色緩沖液，并置于冰浴。37 ℃孵育結(jié)束后，用溫?zé)o菌PBS緩沖液潤(rùn)洗2遍。每孔加入0.05%胰蛋白酶300 μL消化3 min，加入含血清培養(yǎng)基200 μL終止消化，吹打混懸。轉(zhuǎn)速為1 000 r/min，離心5 min，棄去上清液。加入JC-1染色緩沖液300 μL洗滌并重懸細(xì)胞，在轉(zhuǎn)速為800 r/min溫度為4 ℃條件下離心2 min，沉淀細(xì)胞，棄上清液。再加入JC-1染色緩沖液300 μL洗滌并重懸細(xì)胞，在轉(zhuǎn)速為800 r/min溫度為4 ℃條件下離心2 min，沉淀細(xì)胞，棄上清液。加入JC-1染色緩沖液200 μL重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至96孔透明底黑板中，使用多功能酶標(biāo)儀在常溫下測(cè)定。其中，檢測(cè)JC-1單體時(shí)，激發(fā)波長(zhǎng)490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm；檢測(cè)JC-1聚合物時(shí)，激發(fā)波長(zhǎng)525 nm，發(fā)射波長(zhǎng)590 nm，讀取相應(yīng)熒光強(qiáng)度。并采用單體/聚合物的形式得到相關(guān)數(shù)據(jù)。

3 時(shí)間序列模型

3.1 模型建立

1980年Sims開(kāi)創(chuàng)性地提出VAR模型，該模型常用于多元回歸時(shí)間序列分析[9]。VAR(p)模型是基于一系列時(shí)間序列的觀測(cè)值和時(shí)間滯后階數(shù)的回歸模型，在多個(gè)時(shí)間序列中捕捉線性關(guān)系，將單變量自回歸模型推廣到由多元時(shí)間序列變量組成的向量自回歸模型[15]。本研究基于VAR模型對(duì)Aβ引起的細(xì)胞活力變化與各生物標(biāo)記物之間的關(guān)系進(jìn)行解析。其中，VAR(p)模型的數(shù)學(xué)表達(dá)式如公式(4)所示。

yt=c+A1yt-1+A2yt-2+…+Apyt-p+εt

(4)

式中，p是滯后階數(shù)，yt是k維內(nèi)生變量向量，t是一個(gè)k維時(shí)間序列；c為k維常數(shù)項(xiàng)；A1，A2，…，Ap為k×k維待估計(jì)的系數(shù)矩陣；εt是k維擾動(dòng)向量項(xiàng)(∑是εt的k維協(xié)方差矩陣)，可以同期相關(guān)，通常與自己的滯后值不相關(guān)，也與等式右邊的變量有關(guān)。

3.2 模型評(píng)估

VAR模型的評(píng)估主要采用了可視化預(yù)測(cè)檢驗(yàn)(visual predictive check，VPC)和似然比檢驗(yàn)法(likelihood ratio test，LRT)。VPC法以直觀方式評(píng)價(jià)模型的準(zhǔn)確性和預(yù)測(cè)能力，目前在模型預(yù)測(cè)中廣泛應(yīng)用，但是該方法目前沒(méi)有合適的統(tǒng)計(jì)量，無(wú)法從理論上證明模型的合理性，具有一定的局限性。LRT是同時(shí)反映模型靈敏度和特異性的復(fù)合指標(biāo)，主要用于檢驗(yàn)當(dāng)前模型是否需要約束。具體來(lái)說(shuō)，比較一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的模型與一個(gè)簡(jiǎn)單模型，檢驗(yàn)它能否顯著地適用于該數(shù)據(jù)集。LRT提供了一個(gè)客觀的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)選擇合適的模型。

4 結(jié) 果

4.1 腦血管內(nèi)皮功能損傷相關(guān)生物標(biāo)記物以及細(xì)胞活力水平

將HCMEC/D3與含2.5 μmol/L Aβ的RPMI 1640培養(yǎng)基共同孵育，細(xì)胞活力和相關(guān)標(biāo)記物水平變化如圖2所示。細(xì)胞活力隨時(shí)間下降，在早期快速下降，后期下降速度變慢。細(xì)胞活力變化的同時(shí)也伴隨著相關(guān)生物標(biāo)記物的改變，其中鈣離子在早期快速涌入胞漿內(nèi)，4 h后進(jìn)入平臺(tái)期。eNOS在早期快速下降，4 h后變化不大。MMP處于持續(xù)下降的狀態(tài)，前期下降速度快，后期下降速度變慢。

eNOS:Endothelial nitric oxide synthase;MMP:Mitochondrial membrane potential

4.2 時(shí)間序列模型估計(jì)與結(jié)果分析

4.2.1 細(xì)胞活力對(duì)各生物標(biāo)記物的脈沖響應(yīng)分析 基于VAR模型的脈沖響應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)在本期給相關(guān)標(biāo)記物包括胞漿Ca2+，eNOS，MMP一個(gè)沖擊后，細(xì)胞活力表現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)。如圖3所示：給胞漿Ca2+一個(gè)正沖擊后，細(xì)胞活力被抑制并持續(xù)走低；給eNOS和MMP一個(gè)正沖擊后，細(xì)胞活力上升，并在前期上升速度較快，后期上升速度有所下降。

Figure3 Pulse response analysis of cytosolic calcium ion (A),eNOS (B) and MMP (C) to cell viability

4.2.2 方差解析 基于VAR模型的方差解析發(fā)現(xiàn)不同生物標(biāo)記物對(duì)細(xì)胞活力貢獻(xiàn)程度不同，結(jié)果如圖4所示。胞漿Ca2+水平對(duì)細(xì)胞損傷的平均貢獻(xiàn)率最大，這種貢獻(xiàn)率隨疾病進(jìn)程發(fā)展而下降，其次是eNOS，eNOS對(duì)細(xì)胞活力的影響隨著疾病發(fā)展而增加，但一直小于胞漿Ca2+。該損傷進(jìn)程中MMP對(duì)細(xì)胞活力的影響最小。

Figure4 Variance decomposition of cell viability through biomarkers

4.2.3 時(shí)間序列模型的評(píng)估 VPC檢驗(yàn)如圖5所示，觀測(cè)值大部分落在95%置信區(qū)間帶，且均勻分布兩側(cè)，說(shuō)明該時(shí)間序列模型擬合度良好。無(wú)約束的VAR模型和多個(gè)有約束的VAR模型(A0，A1，A2，A3，A4，A5，A6，A7)采用LRT法進(jìn)行比較，統(tǒng)計(jì)參數(shù)如表1所示。最終選擇了擬合度最好的模型A4，A4的約束關(guān)系如圖6所示。

Figure5 Visual predicted check for the time series of cytosolic calcium ion(A),eNOS(B),MMP(C) and cell viability(D),σ=0.05.The area between dotted line represents the 95% confidence interval of the simulated median value.The line represents the simulated median value of simulated value.The circle represents the observed value

Table1 Statistical parameters of VAR Stat means statistic,c value means critical value

Model No.P valueStat.c valueA0 vs A11-17.947.81A2 vs A312.803.84A4 vs A51-17.393.84A6 vs A70.142.173.84A0 vs A21-0.613.84A4 vs A61-18.203.84A4 vs A01-0.553.84

A0-A7:represent the model with a different constraint relationship,respectively

Figure6 Schematic diagram of the constraint relation of the model A4

5 討 論

本研究通過(guò)Aβ誘導(dǎo)腦血管內(nèi)皮功能損傷實(shí)驗(yàn)，獲得4個(gè)時(shí)間序列，建立時(shí)間序列模型，探討相關(guān)標(biāo)記物對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷進(jìn)程的影響和貢獻(xiàn)度。

首先，0～24 h內(nèi)胞漿Ca2+、eNOS、MMP水平對(duì)細(xì)胞活力的動(dòng)態(tài)分析表明給各個(gè)生物標(biāo)記物一個(gè)正向沖擊后，細(xì)胞活力受到影響。其中胞內(nèi)Ca2+水平對(duì)細(xì)胞活力具有反向作用，細(xì)胞鈣超載會(huì)引起細(xì)胞活力下降。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)胞鈣超載主要通過(guò)4個(gè)途徑激起細(xì)胞凋亡：(1)過(guò)度激活Ca2+依賴(lài)酶，比如鈣蛋白酶、鈣調(diào)磷酸酶，調(diào)節(jié)凋亡家族Bcl-2蛋白活性[16]，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)打開(kāi)，從而導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，激活半胱天冬酶-3[17]；(2)鈣超載激活胱天冬酶-12[18]，間接激活胱天冬酶-3[19]；(3)高濃度胞漿Ca2+水平促進(jìn)Aβ生成和聚集，直接引起細(xì)胞凋亡[20]；(4)胞內(nèi)鈣超載也會(huì)影響線粒體功能，線粒體功能受損伴隨著胞內(nèi)活性氧水平增加，線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔打開(kāi)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[6]。結(jié)果與本研究一致。而eNOS和MMP對(duì)細(xì)胞活力具有正向作用。eNOS分泌的NO能夠維持血管正常舒張功能，穩(wěn)定的MMP有利于維持細(xì)胞的正常生理功能。

其次，根據(jù)方差解析結(jié)果可以看出，在Aβ誘導(dǎo)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷進(jìn)程中，胞漿Ca2+水平對(duì)細(xì)胞活力的貢獻(xiàn)率最大，并且這種影響隨疾病進(jìn)程延長(zhǎng)而下降。在損傷早期，胞漿Ca2+主要有兩個(gè)來(lái)源：(1)Aβ作用于細(xì)胞膜，使得細(xì)胞膜上Ca2+通道活性增加，造成胞漿Ca2+濃度增加[21-22]；(2)Aβ可以激活未折疊蛋白反應(yīng)，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣向胞漿涌入[23]。胞漿Ca2+水平遠(yuǎn)高于細(xì)胞自身對(duì)Ca2+的調(diào)節(jié)范圍，引發(fā)胞內(nèi)Ca2+超載。隨著疾病進(jìn)程發(fā)展，細(xì)胞各方面生理功能發(fā)生改變，胞漿Ca2+對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的貢獻(xiàn)率度下降，可能有更多機(jī)制參與到該損傷進(jìn)程中，包括炎癥、氧化應(yīng)激、能量代謝障礙等[5]。一方面，線粒體作為主要供能場(chǎng)所，由于胞內(nèi)鈣超載受到損傷，線粒體能量供應(yīng)不足，影響Ca2+向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞基本生理活動(dòng)受到影響；另一方面，線粒體損傷引起胞內(nèi)ROS水平增加，線粒體內(nèi)膜脂質(zhì)和蛋白對(duì)氧化應(yīng)激敏感，脂代謝異常，而內(nèi)膜損傷加劇線粒體去極化和功能受損[24]。同時(shí)，Aβ可以引起誘導(dǎo)性一氧化氮合酶、胞間黏附分子-1、單核細(xì)胞趨化蛋白、白介素6等表達(dá)增加，這些炎性蛋白都會(huì)對(duì)腦血管內(nèi)皮功能造成損傷[5]。據(jù)此推斷在早期干預(yù)鈣離子通道有可能改善Aβ引起的腦血管內(nèi)皮功能損傷，這一觀點(diǎn)得到了一些文獻(xiàn)支持。臨床研究發(fā)現(xiàn)干預(yù)鈣離子通道能夠改善腦血管內(nèi)皮功能，如尼莫地平、氟桂利嗪等鈣離子拮抗劑臨床上廣泛用于各類(lèi)腦血管疾病[25]，長(zhǎng)期使用鈣離子拮抗劑能夠降低老年癡呆的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[26]，這證明該推斷可能是可行的。但是干預(yù)鈣通道能在多大程度上改善腦血管內(nèi)皮損傷以及如何影響AD疾病進(jìn)程還有待進(jìn)一步研究。

本研究建立了一個(gè)有約束的向量自回歸模型，該約束關(guān)系考慮到了機(jī)制中生物標(biāo)記物之間的關(guān)系。同時(shí)，適當(dāng)增加了一些聯(lián)系使得該模型更趨于合理。該模型只具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而不以嚴(yán)格的生理關(guān)系作為依據(jù)。一般情況下，我們不糾結(jié)于模型的約束關(guān)系。本研究的意義在于首次引入VAR模型評(píng)估相關(guān)生物標(biāo)記物對(duì)細(xì)胞損傷的的影響和貢獻(xiàn)率，并根據(jù)VAR模型推斷在損傷早期干預(yù)Ca2+通道，調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+水平，有可能改善Aβ引起的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。