分子生物學(xué)技術(shù)在結(jié)核病診斷及耐藥檢測中的應(yīng)用

宮俐 韓中波

（吉林市結(jié)核病防治研究所 吉林 吉林 132011）

Xpert Mtb/RIF技術(shù)使用半定量巢氏熒光PCR，該技術(shù)針對結(jié)核桿菌利福平耐藥基因rpoB基因區(qū)設(shè)定引物、探針，擴增熒光檢測，其是否發(fā)生基因突變，檢測標本中是否含有結(jié)核桿菌及是否對利福平耐藥，整個實驗過程需3小時左右。線性探針雜交技術(shù)（Hain）檢測技術(shù)直接從臨床收集的病人肺部涂片陽性痰標本中提取核酸DNA、用生物素標記的引物進行多重PCR擴增和反向雜交。通過檢測rpoB基因突變（編碼RNA聚合酶β-亞單位）確定對利福平的耐藥性；通過檢測katG基因（編碼過氧化氫酶）和inhA基因的啟動子區(qū)（編碼NADH烯酰酸性磷酸酶還原酶）確定對異煙肼的耐藥性。從而，對來自培養(yǎng)物或病人肺部涂片陽性痰標本的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及其耐利福平和/或異煙肼耐藥基因進行分子生物學(xué)檢測。

1.資料和方法

1.1 標本來源

2015年10月至2018年6月期間吉林市結(jié)核病防治研究所及所轄各縣區(qū)結(jié)防所收治的疑似結(jié)核病患者共1345份痰標本。

1.2 檢測方法

對1345份痰標本進行熒光染色涂片鏡檢檢測、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、結(jié)核桿菌比例法藥敏，相關(guān)操作及結(jié)果判定。其操作均按《結(jié)核病診斷細菌學(xué)檢驗規(guī)程》進行。

臨床確診肺結(jié)核病442例，對442例患者痰標本進行Xpert Mtb/RIF檢測和線性探針雜交技術(shù)（Hain）檢測，其操作均按試劑說明書進行。

2.結(jié)果

2.1 1345例初診肺結(jié)核可疑患者，經(jīng)X線、CT、實驗室檢查，臨床最終確診肺結(jié)核病442例，確診率為32.9%。

2.2 Xpert Mtb/RIF檢測及線性探針雜交技術(shù)（Hain）檢測結(jié)核桿菌應(yīng)用價值的評價

對442例肺結(jié)核患者痰標本進行涂片鏡檢，改良羅氏培養(yǎng)陽性率分別為24.4%（108/442）、42.3%（187/442），對442例肺結(jié)核病人痰標本進行Xpert Mtb/RIF檢測、線性探針雜交技術(shù)（Hain）檢測陽性率分別為49.5%（219/442）、44.8%（198/442）。Xpert Mtb/RIF檢測陽性率略高線性探針雜交技術(shù)（Hain）檢測，兩種分子生物學(xué)方法檢測陽性率明顯高于涂片鏡檢，改良羅氏培養(yǎng)法。

2.3 Xpert Mtb/RIF檢測利福平耐藥

Xpert Mtb/RIF檢測結(jié)果報告時間只需2～3小時，遠遠低于培養(yǎng)（2個月）、培養(yǎng)藥敏（3個月）的報告時間。Xpert Mtb/RIF檢測利福平耐藥與傳統(tǒng)方法比較，敏感度為90.2%、特異性為97.0%。見表1。

表1 Xpert Mtb/RIF檢測利福平耐藥與傳統(tǒng)方法比較

2.4 線性探針雜交技術(shù)（Hain）檢測利福平、異煙肼耐藥

檢測結(jié)果報告時間需2～3天，遠遠低于培養(yǎng)（2個月）、培養(yǎng)藥敏（3個月）的報告時間。線性探針雜交技術(shù)（Hain）檢測利福平耐藥與傳統(tǒng)方法比較，敏感度為88.0%、特異性為95.4%。檢測異煙肼耐藥與傳統(tǒng)方法比較，敏感度為73.7%、特異性為90.3%。見表2。

表2 線性探針雜交技術(shù)（Hain）檢測利福平耐藥與傳統(tǒng)方法比較

3.討論

近年來，Xpert Mtb/RIF檢測系統(tǒng)逐漸在基層推廣使用、線性探針雜交技術(shù)（Hain）在具有條件地市級實驗室推廣，本文對Xpert Mtb/RIF檢測技術(shù)、線性探針雜交技術(shù)（Hain）在檢測臨床標本診斷結(jié)核病及利福平、異煙肼耐藥檢測中的應(yīng)用價值進行評價。

Xpert Mtb/RIF核酸檢測采用美國公司GeneXpert檢測系統(tǒng)，是一種半巢式實時定量熒光PCR體外擴增技術(shù)，針對利福平耐藥rpoB基因81bp核心區(qū)間（RRDR）設(shè)計相關(guān)引物、核酸探針，檢測相關(guān)基因是否發(fā)生突變，進而診斷是否結(jié)核桿菌感染以及是否對利福平耐藥。本研究Xpert Mtb/RIF檢測陽性率為49.5%，高于涂片鏡檢、結(jié)核桿菌培養(yǎng)法的陽性檢出率，且時間遠遠小于培養(yǎng)（6～8周）。Xpert Mtb/RIF檢測利福平耐藥與傳統(tǒng)方法比較，敏感度為90.2%、特異性為97.0%。表明Xpert Mtb/RIF技術(shù)檢測結(jié)核桿菌具較高有的臨床應(yīng)用價值，可以對肺結(jié)核的診斷及合理規(guī)范治療起到重要作用。線性探針雜交技術(shù)（Hain），從培養(yǎng)物或直接從臨床收集的病人痰標本中提取核酸DNA、用生物素標記的引物進行多重PCR擴增和反向雜交。雜交包括下列步驟：擴增產(chǎn)物的變性，單鏈雜交、生物素標記的擴增產(chǎn)物與膜上的探針雜結(jié)合、嚴格漂洗、與鏈霉親和素/堿性磷酸酶（AP）標記物孵育、堿性磷酸酶介導(dǎo)的顯色反應(yīng)，判讀模板，便于對所獲帶型簡易、快速做出解釋。實驗只需3天時間，即可檢測出結(jié)核桿菌及利福平和異煙肼是否耐藥。線性探針雜交技術(shù)（Hain）檢測結(jié)核分支桿菌陽性率為44.8%，線性探針雜交技術(shù)（Hain）檢測利福平耐藥與傳統(tǒng)方法比較，敏感度為88.0%、特異性為95.4%。檢測異煙肼耐藥與傳統(tǒng)方法比較，敏感度為73.7%、特異性為90.3%。

Xpert Mtb/RIF檢測技術(shù)、線性探針雜交技術(shù)（Hain）均是世衛(wèi)組織認可的結(jié)核病快速檢測新方法，Xpert Mtb/RIF檢測技術(shù)具有簡單、快捷，只需3小時左右即可得到報告；生物安全要求低，具備生物安全柜就可操作，具有較高的陽性檢出率，Xpert Mtb/RIF檢測利福平耐藥與傳統(tǒng)比例法藥敏進行比較，敏感性和特異性均較高，在基層結(jié)核病防治機構(gòu)具有較高的應(yīng)用價值。研究表明，線性探針雜交技術(shù)（Hain）可快速、準確鑒定結(jié)核分枝桿菌并對利福平、異煙肼耐藥基因進行檢測,適用于檢測結(jié)核菌株和痰標本，可大幅縮短藥物敏感試驗時間,有利于指導(dǎo)臨床用藥治療。但該技術(shù)對實驗室有嚴格要求，需要在通過認證的PCR實驗室進行試驗，更適合在市級結(jié)核病PCR實驗室進行推廣。