有氧運(yùn)動(dòng)對衰老進(jìn)程中海馬膠質(zhì)細(xì)胞激活及炎性因子表達(dá)的影響

熊亞亞，賈 佳，郝選明

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有氧運(yùn)動(dòng)對衰老進(jìn)程中海馬膠質(zhì)細(xì)胞激活及炎性因子表達(dá)的影響

熊亞亞1，賈 佳2，郝選明1

1.華南師范大學(xué) 體育科學(xué)學(xué)院, 廣州 510006; 2.廣州市水蔭路小學(xué), 廣州 510075。

炎性衰老的核心機(jī)制歸因于隨衰老進(jìn)程神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活程度逐漸增加，慢性炎性逐步積累從而導(dǎo)致神經(jīng)炎性水平呈進(jìn)行性升高。研究利用D-半乳糖注射所建立的大鼠衰老模型，觀察衰老進(jìn)程中膠質(zhì)細(xì)胞激活與神經(jīng)炎性水平的變化，并利用在衰老進(jìn)程中和衰老形成后進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)這兩種干預(yù)方式，尋求有氧運(yùn)動(dòng)能否通過改善神經(jīng)炎性水平來延緩衰老。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，伴隨著衰老進(jìn)程，海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活程度逐步升高，且GFAP、CD11b 和TNF-α表達(dá)呈現(xiàn)漸進(jìn)性發(fā)展，提示神經(jīng)炎性逐步積累，證實(shí)膠質(zhì)細(xì)胞過度激活和神經(jīng)炎性水平進(jìn)行性升高是導(dǎo)致機(jī)體逐漸衰老的重要機(jī)制。在衰老進(jìn)程中早期進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)，可顯著降低神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活程度并有效降低神經(jīng)炎性水平，這應(yīng)該是運(yùn)動(dòng)對抗衰老的重要機(jī)制。而衰老形成后進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)，則難于有效降低神經(jīng)炎性水平。提示，中老年人越提早開始運(yùn)動(dòng)，抗衰老效果越明顯。

衰老；膠質(zhì)細(xì)胞；神經(jīng)炎性；運(yùn)動(dòng)干預(yù)

2017年國家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)顯示，我國60歲以上人口已超2.4億，占比高達(dá)17.3%，在我國快速步入老齡化的今天，探索衰老的機(jī)制并尋求有效延緩衰老的方法，無疑具有重要的理論和實(shí)踐意義。

現(xiàn)階段衰老機(jī)制有多種假說，諸如自由基假說、線粒體損傷假說、程序性衰老假說等。而炎性衰老假說發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)衰老的核心是一種逐漸累加的慢性低度炎癥，即隨年齡增長，機(jī)體神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活程度逐漸增加，炎癥穩(wěn)態(tài)失衡，促炎性細(xì)胞因子水平逐漸增加而抗炎性因子水平逐漸下降，神經(jīng)炎癥狀態(tài)呈現(xiàn)進(jìn)行性加重，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙、腦組織損傷累積、認(rèn)知障礙和神經(jīng)退化等神經(jīng)衰老特征。

神經(jīng)炎癥主要由小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活所誘導(dǎo)。靜息狀態(tài)下，小膠質(zhì)細(xì)胞主要發(fā)揮免疫監(jiān)視作用。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到應(yīng)激時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞激活具有促炎（M1型）和抗炎（M2型）兩種極化方向，取決于細(xì)胞間環(huán)境和誘導(dǎo)刺激[21]。CNS（中樞神經(jīng)系統(tǒng)）正常活動(dòng)時(shí)，神經(jīng)元可釋放TGF-β、CD22、CX3CL1、BDNF等，使小膠質(zhì)細(xì)胞向抗炎方向極化，通過吞噬作用清除細(xì)胞碎片，并釋放神經(jīng)生長因子及抗炎因子以減輕神經(jīng)損傷，促進(jìn)組織修復(fù)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。而當(dāng)CNS受到炎癥、感染、外傷等因素刺激時(shí)，釋放的CCL21、ATP、UTP、谷氨酸等可過度激活小膠質(zhì)細(xì)胞，誘發(fā)炎癥反應(yīng)并釋放大量促炎因子（TNF-α、NO、IL-1β、IL-6等）及細(xì)胞毒性物質(zhì)，引起神經(jīng)元失能及細(xì)胞死亡，造成神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙[28]。星形膠質(zhì)細(xì)胞的主要作用是營養(yǎng)、隔離及支持神經(jīng)元，構(gòu)成神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)。激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞亦可釋放多種炎癥介質(zhì)加重神經(jīng)元損傷，損傷血腦屏障完整性，導(dǎo)致外周炎癥介質(zhì)進(jìn)入中樞進(jìn)一步加重神經(jīng)炎性[11]。因此，膠質(zhì)細(xì)胞過度激活是衰老進(jìn)程中海馬神經(jīng)炎癥發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

有氧運(yùn)動(dòng)可通過多種機(jī)制抑制神經(jīng)系統(tǒng)的氧化損傷，如上調(diào)GSH-Px等過氧化物酶、CCL11等趨化因子，亦能增強(qiáng)神經(jīng)發(fā)生[8]和突觸再生[16]，維持海馬體積，改善腦血管[6]，改善腦能量代謝[7]，有效延緩認(rèn)知障礙。因此，本實(shí)驗(yàn)推測，運(yùn)動(dòng)也許可以通過抑制海馬神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活及改善炎性因子水平來延緩衰老。

鑒于此，本研究通過注射D-半乳糖建立大鼠衰老模型，試圖觀察炎性衰老過程中膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況以及神經(jīng)細(xì)胞炎性因子的表達(dá)情況。同時(shí)，采取衰老進(jìn)程中和衰老形成后進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)兩種干預(yù)方式，比較在衰老進(jìn)程中早期運(yùn)動(dòng)及晚期運(yùn)動(dòng)干預(yù)對海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞激活與TNF-α等炎性因子表達(dá)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

8周齡SPF級雄性SD大鼠50只，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號：粵監(jiān)證字2015A034。溫度20±3 ℃，濕度50%～70%，晝夜節(jié)律12 h/12 h，自由飲食飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組，分組情況如下。

圖1 實(shí)驗(yàn)大鼠分組情況

Figure 1. Experimental Rats Grouping

大鼠分組的目的：1）安靜（A）組是6周靜養(yǎng)組，衰老組是注射D-半乳糖建模組，兩組比較可觀察衰老大鼠的差異性變化。2）衰老同期運(yùn)動(dòng)組是注射D-半乳糖建模期間運(yùn)動(dòng)組，同靜養(yǎng)組和衰老組比較，可觀察衰老進(jìn)程中進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)的效果。3）在六周D-半乳糖衰老建模后，分為兩組，一組為衰老后安靜組，即在無干預(yù)情況下繼續(xù)自然衰老6周，以觀察繼續(xù)衰老的變化。另一組為衰老后運(yùn)動(dòng)組，即在衰老形成后再進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)，并與衰老后安靜組比較，觀察運(yùn)動(dòng)對繼續(xù)衰老的影響。4）兩個(gè)運(yùn)動(dòng)組比較，可觀察在衰老進(jìn)程中早期和晚期不同階段進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)后抗衰老效果方面的差異。

1.2 D-半乳糖致衰老模型的建立

D-半乳糖是機(jī)體正常代謝產(chǎn)物，可轉(zhuǎn)化為1-磷酸葡萄糖參與三羧酸循壞；過量D-半乳糖可被醛糖還原酶還原成具有細(xì)胞毒性的半乳糖醇生成醛類和ROS，使脂質(zhì)、蛋白及核酸過氧化，線粒體結(jié)構(gòu)受損功能受阻，增加淀粉樣蛋白水平，誘發(fā)代謝障礙和認(rèn)知障礙，是理想的快速衰老模型。

具體實(shí)施：大鼠頸背部皮下注射D-半乳糖150 mg/kg/天，持續(xù)6周；安靜組大鼠頸背部皮下注射等體積0.9%生理鹽水，持續(xù)6周。

6周持續(xù)造模后篩選造模成功的大鼠進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)如下：毛色暗黃，無光澤；食量減少，體重減輕；真皮厚度變薄；反應(yīng)遲緩等。

1.3 運(yùn)動(dòng)方案

大鼠運(yùn)動(dòng)方式為無負(fù)重游泳。大鼠游泳池直徑為 60 cm，深度為80 cm。水溫35±2 ℃，60 min /天，3天/周，共持續(xù)6周。

1.4 取材

最后一次運(yùn)動(dòng)后自由飲食飲水24 h，隨后禁食12 h后取材。腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，灌注取腦，分離海馬組織。-80 ℃冰箱冷凍待用。

1.5 測試指標(biāo)及方法

1.5.1 膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)——GFAP、CD11b

纖維性星形膠質(zhì)細(xì)胞染色：在白質(zhì)分布，胞體較大，突起細(xì)長，分支較少，胞質(zhì)內(nèi)含大量膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）組成的膠質(zhì)絲，因此常用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)標(biāo)記GFAP特異性識別星形膠質(zhì)細(xì)胞。

小膠質(zhì)細(xì)胞染色：CD11b則是小膠質(zhì)細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物。人抗大鼠GFAP免疫組化單克隆抗體、小鼠抗大鼠CD11b/c多克隆抗體購于福州邁新公司。

組織化學(xué)切片：海馬組織石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片；二甲苯脫蠟；3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，加入檸檬酸抗原修復(fù)液，放于微波爐中用高火加熱至沸騰修復(fù)抗原；10%羊血清封閉；一抗4 ℃孵育過夜、二抗室溫濕盒30 min；DAB顯色；蘇木素復(fù)染；脫水、透明、封片。

1.5.2 神經(jīng)炎性水平——TNF-α

TNF-α是一種重要的促炎性細(xì)胞因子，它是局部炎癥反應(yīng)的早期介質(zhì)，同時(shí)也是全身炎癥急性期反應(yīng)的啟動(dòng)者。山羊抗大鼠TNF-α多克隆抗體購于福州邁新公司。

1.6 數(shù)據(jù)分析及處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 海馬CA3區(qū)HE染色

如圖2所示，光鏡下可見安靜（A）組HE染色海馬CA3區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu)完整清晰、椎體細(xì)胞層排列緊密、細(xì)胞間隙均勻、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整、染色質(zhì)均一、無明顯細(xì)胞丟失。

圖2 大鼠海馬CA3區(qū)HE染色(400倍)

Figure 2. Hematoxylin-eosin Staining in Rat Hippocampus CA3 Areas(×400)

注：A:安靜（A）組 B:衰老（S）組 C:衰老同期運(yùn)動(dòng)（YS）組 D:衰老后安靜（SA）組 E:衰老后運(yùn)動(dòng)（SY）組，下同。

與安靜（A）組相比，衰老（S）組、衰老后安靜（SA）組和衰老后運(yùn)動(dòng)（SY）組海馬CA3區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂、有明顯退行性變化、椎體細(xì)胞層排列稀疏、細(xì)胞間隙增大、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞核固縮、細(xì)胞丟失明顯。衰老組海馬CA3區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂，椎體細(xì)胞層排列稀疏，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，可見細(xì)胞核固縮。提示，6周的D-半乳糖注射已經(jīng)誘導(dǎo)了大鼠海馬神經(jīng)元發(fā)生變性。

兩個(gè)運(yùn)動(dòng)干預(yù)組與衰老組相比，不同階段的運(yùn)動(dòng)干預(yù)對大鼠海馬CA3區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)影響明顯不同。衰老同期運(yùn)動(dòng)（YS）組與衰老（S）組相比，椎體細(xì)胞層排列緊密，細(xì)胞間隙均勻，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，染色質(zhì)均一，無明顯細(xì)胞丟失現(xiàn)象，提示在衰老進(jìn)程中進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)可顯著改善膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。而衰老后運(yùn)動(dòng)（SY）組與衰老后安靜（SA）組相比，大鼠海馬CA3區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)和細(xì)胞損傷丟失情況相似，提示，衰老后進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)效果不甚明顯。

2.2 膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)

2.2.1 大鼠海馬CA1區(qū)GFAP免疫組化

膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）是星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞骨架成分。GFAP在各組大鼠海馬CA1區(qū)表達(dá)情況見圖3、圖6。

圖3 大鼠海馬CA1區(qū)GFAP免疫組化染色(400倍)

Figure 3. Immunohistochemical Staining of GFAP in Rat Hippocampus CA1 Areas(×400)

安靜（A）組大鼠海馬GFAP表達(dá)量少、陽性反應(yīng)顏色淺、星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體小、突起細(xì)長不明顯。與安靜（A）組相比，衰老（S）組、衰老同期運(yùn)動(dòng)（YS）組、衰老后安靜（SA）組和衰老后運(yùn)動(dòng)（SY）組GFAP表達(dá)量增多，陽性反應(yīng)顏色加深，星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯增值，細(xì)胞體積增大，突起增多變粗大。D-半乳糖造模組與安靜對照組GFAP表達(dá)均具有極顯著差異，提示，衰老大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞激活程度極顯著高于安靜對照大鼠。

運(yùn)動(dòng)干預(yù)兩組與衰老組相比，不同階段的運(yùn)動(dòng)干預(yù)對大鼠海馬CA1區(qū)GFAP表達(dá)的影響不同，衰老同期運(yùn)動(dòng)（YS）組與衰老（S）組相比大鼠海馬GFAP表達(dá)量少，陽性反應(yīng)顏色淺，星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體小，突起細(xì)長不明顯，IOD值減小20.5%，有極顯著性差異(<0.01)；而衰老后運(yùn)動(dòng)（SY）組與衰老后安靜（SA）組相比GFAP陽性表達(dá)相似，星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量形態(tài)相近，表達(dá)無顯著性差異(＞0.05)。提示，在衰老進(jìn)程中進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)可有效改善衰老進(jìn)程中星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活程度，而衰老形成后進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)，盡管對星形膠質(zhì)細(xì)胞激活情況有一定改善，但無明顯效果。

2.2.2 大鼠海馬CA1區(qū)CD11b免疫組化

CD11b 是常用的小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，主要表達(dá)在活化的小膠質(zhì)細(xì)胞胞漿，各組CD11b表達(dá)情況見圖4、圖6。

圖4 大鼠海馬CA1區(qū)CD11b免疫組化染色(400倍)

Figure 4. Immunohistochemical Staining of CD11b in Rat Hippocampus CA1 Areas(×400)

光鏡下可見安靜（A）組大鼠海馬CD11b陽性表達(dá)率低，陽性反應(yīng)顏色淺、細(xì)胞胞體小，核小而致密。

與安靜（A）組相比，衰老（S）組、衰老同期運(yùn)動(dòng)（YS）組、衰老后安靜（SA）組和衰老后運(yùn)動(dòng)（SY）組CD11b表達(dá)極顯著升高(<0.01)，陽性反應(yīng)顏色加深，細(xì)胞體積增大，MG胞體呈球形或延長。提示，衰老造模組大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞激活程度極顯著高于安靜對照組大鼠。

運(yùn)動(dòng)干預(yù)兩組與衰老組相比，不同階段的運(yùn)動(dòng)干預(yù)對大鼠海馬CA1區(qū)CD11b表達(dá)的影響亦不同。衰老同期運(yùn)動(dòng)（YS）組與衰老（S）組相比，大鼠海馬CD11b陽性反應(yīng)顏色淺，小膠質(zhì)細(xì)胞胞體小，突起不明顯，IOD值減小18.4%，有顯著性差異(<0.05)。而衰老后運(yùn)動(dòng)（SY）組與衰老后安靜（SA）組相比，大鼠海馬CA1區(qū)CD11b陽性表達(dá)相似，小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量形態(tài)相近，無顯著差異(＞0.05)。提示，衰老進(jìn)程中進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)可顯著改善小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況，而衰老后進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)則無明顯干預(yù)效果。

2.3 神經(jīng)炎性水平

2.3.1 大鼠海馬CA2區(qū)TNF-α免疫組化

TNF-α是強(qiáng)前致炎因子，可產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)，介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)，常以其水平代表炎性水平。各組TNF-α表達(dá)情況見圖5、圖6。

圖5 大鼠海馬CA2區(qū)TNF-α免疫組化染色(400倍)

Figure 5. Immunohistochemical Staining of TNF-α in Rat Hippocampus CA1 Areas(×400)

圖6 各組大鼠海馬神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及炎性因子（GFAP、CD11b、TNF-α）累計(jì)光密度值（IOD）

Figure 6. Changes of GFAP，CD11b and TNF-α Integrated Optical Density in 5 Groups

安靜（A）組大鼠海馬CA2區(qū)TNF-α表達(dá)量少，胞體染色淺。與安靜（A）組相比，衰老（S）組、衰老同期運(yùn)動(dòng)（YS）組、衰老后安靜（SA）組和衰老后運(yùn)動(dòng)（SY）組TNF-α表達(dá)均顯著性升高（＜0.01），這表明在衰老影響下和D-半乳糖干預(yù)下，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞均可過度激活，產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)。

衰老同期運(yùn)動(dòng)（YS）組與衰老（S）組相比，海馬區(qū)TNF-α染色變淺，IOD值減少31.0％，有極顯著性差異(<0.01)，而衰老后運(yùn)動(dòng)（SY）組與衰老后安靜（SA）組表達(dá)情況相似(＞0.05)。提示，衰老進(jìn)程中進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)可有效調(diào)節(jié)神經(jīng)炎性水平，而衰老后再進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)對神經(jīng)炎性水平改善效果并不明顯，這可能與神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的損傷進(jìn)行性加重有關(guān)。

3 討論與分析

3.1 D-半乳糖急性衰老模型

自然衰老大鼠飼養(yǎng)周期長，價(jià)格昂貴，因此許多學(xué)者選擇快速衰老模型（SMA）開展研究，D-半乳糖衰老模型發(fā)生機(jī)制與氧化應(yīng)激損傷和自由基毒性有關(guān)，可使認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)技能減弱，是理想的快速衰老模型。建?？梢鹨幌盗猩窠?jīng)衰老性變化，包括強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)forced swim test (FST)、光暗轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)light/dark transition (LDT) test、水迷宮試驗(yàn)Morris water maze (MWM)、 被動(dòng)回避試驗(yàn)passive avoidance test (PAT)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)elevated plus maze (EPM) test等焦慮、記憶障礙的行為學(xué)變化；脂質(zhì)過氧化[12]，膠質(zhì)細(xì)胞過度激活[2]，抗氧化劑酶（SOD、MDA、GSH等）等氧化損傷水平升高，炎性標(biāo)記物p-p65、p-FOXO3a、COX-2、iNOS和IL-6水平升高。以TNF-α代表促炎性，以IL-10代表抗炎性的M1/M2水平發(fā)生變化[30]，發(fā)生神經(jīng)遞質(zhì)水平顯著下降、乙酰膽堿酯酶升高等突觸功能障礙[13]、神經(jīng)細(xì)胞凋亡[27]、BDNF釋放降低、海馬神經(jīng)元減少、CREB水平降低導(dǎo)致記憶障礙等。

6周D-半乳糖干預(yù)后，免疫組化可明顯觀察到星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生過度激活現(xiàn)象（圖3、圖4）。衰老（S）組與安靜（A）組相比，GFAP、CD11b表達(dá)均有顯著性升高（＜0.05），表明膠質(zhì)細(xì)胞激活情況與D-半乳糖急性衰老模型關(guān)系密切，甚至表明反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞增生參與了D-半乳糖誘導(dǎo)的神經(jīng)衰老的病理過程。

3.2 衰老進(jìn)程中膠質(zhì)細(xì)胞激活與神經(jīng)炎性水平的變化

隨年齡增長和衰老進(jìn)程，神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能必然會正常老化，機(jī)體神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活會逐漸增加，神經(jīng)炎性水平會逐漸累積，促炎性細(xì)胞因子水平會逐漸增加而抗炎性因子水平則逐漸下降。

6周D-半乳糖干預(yù)后，神經(jīng)炎性水平標(biāo)志物TNF-α表達(dá)極顯著升高，提示衰老進(jìn)程中伴隨著炎性介質(zhì)的明顯升高。這種升高主要?dú)w因于膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活、神經(jīng)系統(tǒng)的氧化損傷、HPA軸功能過度激活、過量谷氨酸的神經(jīng)興奮性毒性等引起。而中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性炎癥介質(zhì)浸潤會擾亂內(nèi)皮細(xì)胞即血腦屏障，使衰老機(jī)體中外周血液中失衡的炎性細(xì)胞因子（Th1/Th2中大量的外周促炎因子）得以進(jìn)入中樞，從而進(jìn)一步加劇神經(jīng)炎癥。這種促炎傾向通過干擾LTP，減少BDNF、IGF-1的表達(dá)，減少神經(jīng)發(fā)生，削弱突觸可塑性，影響著神經(jīng)系統(tǒng)的功能（圖7）。

圖7 衰老大腦的神經(jīng)炎性變化

Figure 7. Aging Brain and Neuroinflammation[5]

3.2.1 神經(jīng)炎性

細(xì)胞因子參與了神經(jīng)遞質(zhì)代謝以及神經(jīng)可塑性等神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)中幾乎所有活動(dòng)。各種細(xì)胞因子所構(gòu)成的信息網(wǎng)絡(luò)也是大腦及其他生理系統(tǒng)中調(diào)節(jié)控制的體現(xiàn)。細(xì)胞因子具有復(fù)雜的級聯(lián)模式和協(xié)同/拮抗作用，它們在不同細(xì)胞之間相互交流，將內(nèi)環(huán)境的變化轉(zhuǎn)化為分子信號。通常根據(jù)其對炎癥的影響，分為促炎性的IL-1、IL-6、TNF和抗炎性的IL-4、IL-10、TGF-β等。

抗炎性細(xì)胞因子（如IL-4和TGF-β）具有保護(hù)神經(jīng)元及神經(jīng)前體細(xì)胞的功能，IL-4還可促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生對學(xué)習(xí)和記憶功能起關(guān)鍵作用的BDNF，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生BNDF、IGF-1、TGF-β，進(jìn)而影響神經(jīng)功能。

大量流行病學(xué)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究業(yè)已證實(shí)，神經(jīng)炎癥與AD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，使用非甾體抗炎藥有利于抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。如通過阿司匹林、布洛芬、IL-10等藥物預(yù)處理可使小膠質(zhì)細(xì)胞tau蛋白磷酸化水平降低，二甲胺四環(huán)素可減少Aβ及GFAP的表達(dá)，抑制TNF-α表達(dá)可改善AD患者認(rèn)知功能。

3.2.2 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞過度激活所產(chǎn)生的強(qiáng)促炎效應(yīng)

小膠質(zhì)細(xì)胞為胚胎發(fā)育過程中遷移到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞，激活時(shí)變?yōu)榘⒚装蜆?，可釋放多種炎性介質(zhì)，并可通過吞噬作用（突觸修剪）參與突觸網(wǎng)絡(luò)的重構(gòu)。衰老中的小膠質(zhì)細(xì)胞可通過降低被激活閾值及增加炎性介質(zhì)釋放等方式增強(qiáng)炎性反應(yīng)。激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞具有抵抗自由基毒害作用和消除過量谷氨酸作用，但亦可釋放多種炎性介質(zhì)激發(fā)炎癥反應(yīng)并進(jìn)一步加重神經(jīng)元損傷。在AD等病理?xiàng)l件下，星形膠質(zhì)細(xì)胞被淀粉樣蛋白激活后會大量聚集于淀粉樣蛋白斑周圍，導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞不能及時(shí)清除淀粉樣蛋白。

本研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α水平在衰老同期運(yùn)動(dòng)中下調(diào)非常明顯，而在衰老后運(yùn)動(dòng)組中并無明顯改善，提示，衰老大鼠神經(jīng)系統(tǒng)對神經(jīng)炎性的調(diào)節(jié)能力明顯降低，這可能與累積的神經(jīng)炎性損傷神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)。TNF-α在腦脊液中大量出現(xiàn)會阻礙神經(jīng)元間的突觸信號傳遞[9]。帕金森患者腦組織和腦脊液中亦可檢測到TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高，這可能與NF-κB、MAPK通路激活有關(guān)[26]。TNF-α還能通過p38MAPK通路調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活[29]。盡管大量報(bào)告顯示過高TNF-α?xí)ν挥|可塑性造成負(fù)性影響，但生理水平（低水平）的TNF-α在大腦正常發(fā)育中也起到重要作用。TNF-α同時(shí)也能通過調(diào)節(jié)突觸伸展、增強(qiáng)興奮性突觸強(qiáng)度并支持LTP，進(jìn)而影響神經(jīng)可塑性[14]。下調(diào)CD11b及CD4+表達(dá)，可降低大腦炎性浸潤狀態(tài)，糾正淀粉樣蛋白負(fù)載，減少Aβ斑塊[18]。

3.2.3 血腦屏障過度開放與神經(jīng)衰老的外周機(jī)制

星形膠質(zhì)細(xì)胞是數(shù)目最多的膠質(zhì)細(xì)胞，其功能包括支持營養(yǎng)神經(jīng)元、幫助神經(jīng)元遷移、調(diào)節(jié)離子濃度和物質(zhì)代謝、參與神經(jīng)遞質(zhì)和激素調(diào)節(jié)、抵抗神經(jīng)毒性物質(zhì)、促進(jìn)神經(jīng)分化和免疫調(diào)節(jié)等。星形膠質(zhì)細(xì)胞與腦毛細(xì)血管緊密相連，通過誘導(dǎo)內(nèi)皮的緊密連接形成血-腦屏障（BBB），這些緊密連接可限制溶質(zhì)通過。內(nèi)皮細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及血液免疫細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用，維持了神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。因此，BBB可受中樞神經(jīng)系統(tǒng)和血液中的免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子和趨化因子的調(diào)節(jié)。

衰老進(jìn)程中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的長期慢性炎性介質(zhì)暴露會擾亂BBB的內(nèi)皮屏障，這種炎性介質(zhì)可源自于中樞本身，亦包含血液中的炎性介質(zhì)。衰老中胸腺逐步萎縮，血液中T淋巴細(xì)胞生成減少，免疫功能降低，導(dǎo)致外周血中促炎介質(zhì)持續(xù)增多，更多的促炎因子會通過受損的血腦屏障進(jìn)入中樞。通過這種方式，外周免疫衰老會進(jìn)一步加深中樞部的神經(jīng)炎性水平。外周免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子及其他免疫介質(zhì)，如TNF-α、IL-1、甚至可溶性IL-1受體，均可以通過BBB激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，產(chǎn)生促炎介質(zhì)，如NO、前列腺素、趨化因子和內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子等。這些促炎介質(zhì)又會進(jìn)一步損傷BBB的完整性，加重神經(jīng)炎性。這種過高的促炎介質(zhì)會導(dǎo)致髓鞘脫失損傷血腦屏障，干擾LTP所需的微妙平衡，削弱突觸可塑性，并減少BDNF和IGF-1的生成，減少神經(jīng)發(fā)生，影響正常的神經(jīng)功能。血清炎性標(biāo)志物也是預(yù)測認(rèn)知能力下降的有效指標(biāo)[24]?？梢?，外周免疫衰老引起的促炎因子通過血腦屏障進(jìn)一步加深神經(jīng)炎性是神經(jīng)衰老的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，但其在神經(jīng)衰老中的重要性還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)支持。

3.3 衰老進(jìn)程中進(jìn)行不同運(yùn)動(dòng)干預(yù)的效果與可能機(jī)制

體育運(yùn)動(dòng)作為一種有效且相對簡單的行為干預(yù)措施，可通過多種途徑影響神經(jīng)功能。研究發(fā)現(xiàn)，通過運(yùn)動(dòng)可改善突觸密度逆轉(zhuǎn)衰老過程中的突觸損失并維持海馬體積；促進(jìn)海馬Ach含量增加[3]，上調(diào)海馬神經(jīng)粘附因子表達(dá)[4]，保持和相關(guān)神經(jīng)元連接，保持腦容量變化；增強(qiáng)LTP，改善細(xì)胞興奮性；改善腦血流量，增加酮的利用吸收，保持大腦葡萄糖的吸收，改善大腦能量代謝；改善氧化應(yīng)激，增加抗氧化能力，減輕大腦氧化損傷程度[22],改善神經(jīng)元凋亡。運(yùn)動(dòng)可影響神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，如BDNF、血管內(nèi)皮生長因子、神經(jīng)生長因子[1]、膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子[23]、NT3、NT4/5等協(xié)同作用誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)可塑性；改善水迷宮、回避試驗(yàn)等認(rèn)知記憶功能[25]。運(yùn)動(dòng)可減少老齡小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，增加IGF-1表達(dá)以減少神經(jīng)炎癥[15]，降低小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞激活水平，增加BDNF表達(dá)，降低炎性衰老、維持神經(jīng)發(fā)生[17]。穩(wěn)定的中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)可有效誘發(fā)神經(jīng)保護(hù)機(jī)制以應(yīng)對各種危險(xiǎn)因素。但運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度過大時(shí)，如高于乳酸閾時(shí)，運(yùn)動(dòng)對老齡小鼠神經(jīng)炎性以及神經(jīng)發(fā)生的改善作用則會消失[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過6周的游泳運(yùn)動(dòng)大鼠海馬膠質(zhì)細(xì)胞激活程度和神經(jīng)炎性水平顯著降低，表明在衰老進(jìn)程中進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)可顯著降低神經(jīng)炎性水平，從而延緩衰老。而衰老后運(yùn)動(dòng)（SY）組6周運(yùn)動(dòng)的結(jié)果與衰老（S）組相比雖有下降趨勢，但并無顯著性差異，提示，衰老形成后再進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)，所產(chǎn)生的神經(jīng)修復(fù)作用可能無法完全抵消衰老后進(jìn)行性加重的神經(jīng)損傷，因此，這種運(yùn)動(dòng)干預(yù)對膠質(zhì)細(xì)胞和TNF-α的改善作用不明顯。

Marlatt等人對9月齡小鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)至17月齡，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)可使其在老年仍能保留較強(qiáng)的空間記憶能力，且具有較高的神經(jīng)發(fā)生和BDNF水平，維持大腦功能[19]；15周中等強(qiáng)度跑臺運(yùn)動(dòng)可有效改善12月齡中年雌性大鼠衰老早期的ROS、SOD、GPx、AMPK、PGC-1α等氧化應(yīng)激情況[20]，這些與本研究衰老同期運(yùn)動(dòng)組神經(jīng)炎性水平較低的結(jié)果基本一致。Yang等人通過對3、6、9、12、21月齡小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠到9月齡時(shí)新生神經(jīng)元數(shù)目大大減少（＞95%），主要由增殖減少導(dǎo)致。對不同年齡小鼠進(jìn)行一個(gè)月運(yùn)動(dòng)干預(yù)可以使神經(jīng)元數(shù)量和功能有所增加，但不能回復(fù)增殖率下降導(dǎo)致的神經(jīng)發(fā)生減少[31]，這與本研究中衰老后運(yùn)動(dòng)的抗衰老效果不明顯的結(jié)果基本一致。

4 結(jié)論

在衰老進(jìn)程中，海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活程度逐步升高，GFAP, CD11b 和TNF-α表達(dá)呈現(xiàn)漸進(jìn)性發(fā)展，提示神經(jīng)炎性逐步積累，證實(shí)膠質(zhì)細(xì)胞過度激活和神經(jīng)炎性水平進(jìn)行性升高是促進(jìn)神經(jīng)衰老的重要機(jī)制。這可能是由于血腦屏障過度開放及神經(jīng)炎癥調(diào)節(jié)機(jī)制受抑形成惡性循環(huán)，致使外周炎癥介質(zhì)浸潤中樞神經(jīng)，神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)受損并發(fā)生功能障礙，最終導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的炎性衰老。

在衰老進(jìn)程中進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)，可有效改善膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)及促炎因子的表達(dá)從而降低神經(jīng)炎性水平，延緩衰老并延遲神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展。然而衰老形成后，由于膠質(zhì)細(xì)胞過度激活大量釋放促炎因子致神經(jīng)元損傷，此階段進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)對神經(jīng)炎性衰老雖有緩解作用但效果并不顯著。提示，運(yùn)動(dòng)可以有效延緩衰老，但難于逆轉(zhuǎn)衰老，且中老年人越提早開始運(yùn)動(dòng)抗衰老效果越明顯。

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Effects of Aerobic Exercise on Activation of Neuroglia Cells and Expression of Inflammatory Factors in Aging Rats

XIONG Ya-ya1, JIA Jia2, HAO Xuan-ming1

1.South China Normal University,Guangzhou 510006,China; 2.Guangzhou ShuiYin Road Primary School,Guangzhou 510075,China.

The aging mechanism in nervous system is closely related to increased activation of neuroglia cells and progressing neuroinflammation with aging. This study tried to shed some light on relationship between chronic inflammation accumulation and aerobic exercise so as to understand how exercise intervened nervous aging through inflammation. Two exercise-interventions, with and after aging, was used, and expressing level of astrocytes, microglia and TNF-α was tested. Result suggested that exercise with aging can significantly reduced activating level of astrocytes, microglia and expression of GFAP, CD11b and TNF-α, however, no significant reductions were observed when exercise after aging. This showed that exercise could effectively delay aging progression through improving neuroinflammation, and the earlier in age to exercise, the better to delay aging.

G804.7

A

1000-677X(2018)08-0067-08

10.16469/j.css.201808008

2018-02-06；

2018-07-12

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(9151063101000059)。

熊亞亞,女,在讀博士研究生,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)、免疫與健康,E-mail:372911789@qq.com。

郝選明,男,教授,博士研究生導(dǎo)師,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)、免疫與健康,E-mail:850888696@qq.com。