液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)人尿中去氨加壓素及其在人尿中的消除研究

閆 寬，董 穎，徐友宣，馬艷華，張力思，楊志勇，馮飛飛

(國(guó)家體育總局反興奮劑中心，北京 100029)

圖1 去氨加壓素的分子結(jié)構(gòu)式(MW=1 068.426 4)Fig.1 Molecular structural formula of desmopressin(MW=1 068.426 4)

去氨加壓素(1-Desamino-8-D-arginine-vasopressin)是人工合成的精加壓素(Vasopressin)類似物，其結(jié)構(gòu)是將精加壓素1位的半胱氨酸以及8位的L-精氨酸分別換成β-巰基丙酸和D-精氨酸(圖1)。該藥物臨床常用于中樞性尿崩癥、遺尿癥、術(shù)中止血、預(yù)防出血及某些出血性疾病的治療，其主要原理為拮抗腎臟集尿管中的V2受體，增加細(xì)胞水分的再吸收以達(dá)到抗利尿的作用。由于其對(duì)血液具有一定的稀釋作用，世界反興奮劑機(jī)構(gòu)(簡(jiǎn)稱WADA)于2012年將去氨加壓素列入禁用清單中的掩蔽劑類禁用物質(zhì)[1-5]。

由于去氨加壓素為小肽類藥物，且易溶于水，因此無法使用液-液萃取等常規(guī)前處理方式，直接進(jìn)樣的檢測(cè)方法又暫時(shí)無法達(dá)到WADA對(duì)該藥物的檢測(cè)限，因此檢測(cè)去氨加壓素的前處理方式只能使用固相萃取[6-8]。固相萃取是世界各國(guó)實(shí)驗(yàn)室對(duì)于小肽類藥物檢測(cè)的主流方法，但文獻(xiàn)報(bào)道的前處理步驟較復(fù)雜且檢測(cè)儀器價(jià)格昂貴[9-11]。Esposito等[10-11]采用去脂、過夜冷凍干燥等前處理手段降低尿液帶來的基質(zhì)干擾，提高去氨加壓素的分辨率，并使用了熱電公司的QE儀器確保靈敏度在pg/mL級(jí)別，該方法靈敏度很高，適合小批量樣品的定性定量，但無法實(shí)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)大批量樣品的檢測(cè)，且儀器昂貴。國(guó)內(nèi)尚無從人尿液中檢測(cè)該藥物的報(bào)道[12-13]。因此建立一種快速、價(jià)廉、高通量檢測(cè)該藥物的方法十分必要。同時(shí)文獻(xiàn)中提到可在3種服藥方式(口服、注射、鼻內(nèi))后2 h的尿液樣品中檢出去氨加壓素原型，但也僅限對(duì)受試后留取的樣品進(jìn)行定性實(shí)驗(yàn)，且國(guó)內(nèi)外暫無對(duì)服用去氨加壓素后體內(nèi)消除情況的報(bào)道[12-13]。因此，檢測(cè)并研究志愿者受試后留取的尿液樣本，可以明確該藥物的檢測(cè)窗口期，為興奮劑檢測(cè)工作提供一定的參考信息。

本文在前人研究的基礎(chǔ)上，對(duì)樣品前處理進(jìn)行了改進(jìn)，減少了前處理時(shí)間，實(shí)驗(yàn)得到的檢出限能夠達(dá)到WADA對(duì)于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的技術(shù)要求，可在不漏檢的情況下提高工作效率。首次完成了受試后較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)陽性樣品的檢測(cè)，將可檢測(cè)窗口期增至10 h左右，最高可達(dá)到13 h，增強(qiáng)了實(shí)際檢測(cè)的效果和必要性，并可為興奮劑檢查工作提供一定依據(jù)和幫助，同時(shí)采用LC-MS/MS檢測(cè)并繪制了去氨加壓素代謝產(chǎn)物在人體內(nèi)的代謝曲線，加深了對(duì)去氨加壓素在體內(nèi)代謝和消除的理解。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent1290/6460C液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)安捷倫科技公司)；GENIE VORTEX-2 旋渦混合器(美國(guó)Scientific Industries公司)；Mettler PM200電子天平(感量0.001 g，德國(guó)IKA公司)；Milli-Q 超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)；TECHNE(Dri-Block DB-3D)氮?dú)飧稍飪x(英國(guó)Bibby公司)。

甲醇(美國(guó)Fisher Scientific公司)，異丙醇、甲酸、乙腈、甲基叔丁基醚(美國(guó)Dikma科技有限公司)，甲酸銨(瑞士Fluka分析試劑公司)，乙酸乙酯(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，上述試劑均為色譜純；氨水(北京化工廠)、磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。液相色譜柱：Onyx Monolothic C18(100 mm× 2.0 mm,美國(guó)Phenomenex公司)；固相萃取柱：Sep-Pak Vac 6cc C18-500 mg(Waters中國(guó)有限公司)；尖底進(jìn)樣瓶(美國(guó)Wheaton公司)；螺口進(jìn)樣瓶、螺口瓶蓋、鉗口進(jìn)樣瓶、鉗口瓶蓋(美國(guó)安捷倫儀器公司)；2 mL及 5 mL 低吸附試管(德國(guó)Eppendorf公司)。

采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。去氨加壓素的標(biāo)準(zhǔn)品與用作內(nèi)標(biāo)的去氨加壓素類似物(DEAMINO-CYS1,VAL4,D-ARG8)-VASOPRESSIN均購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，純度≥98%。

用于志愿者受試的藥品名為醋酸去氨加壓素片，為輝凌(瑞士)制藥有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品前處理使用3 mL甲醇對(duì)C18固相萃取柱進(jìn)行活化后，加入2 mL磷酸鹽緩沖液(用氨水調(diào)至pH 8.5)進(jìn)行淋洗，將2 mL待測(cè)尿樣加入SPE柱，控制載樣流速小于1 mL/min，待樣品過柱充分后用3 mL純水對(duì)SPE柱進(jìn)行淋洗，隨后用3 mL體積比為80∶ 20的乙腈-乙酸乙酯(含5%甲酸)混合溶液洗脫，盡量吹干固相萃取柱并收集洗脫液，將洗脫液經(jīng)氮?dú)獯蹈?40 ℃)后，加入初始流動(dòng)相并定容至200 μL，采用LC-MS/MS進(jìn)行分析。由于去氨加壓素為小肽類物質(zhì)，在前處理過程中用低吸附試管以降低對(duì)該物質(zhì)回收率的影響。

1.2.2色譜條件色譜柱：Phenomenex Onyx Monolothic C18(100 mm× 2.0 mm);流動(dòng)相：A為10 mmol/L甲酸銨水溶液(用甲酸調(diào)至pH 3.5)，B為乙腈。洗脫梯度：0～10 min，10%～90% B，10～12 min，90%B;平衡時(shí)間：3 min。流速：0.4 mL/min;柱溫：40 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.3質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源；離子采集模式：正離子；毛細(xì)管電壓：4 000 V；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流量：10 L/min；霧化氣壓力：20 psi；鞘氣溫度：400 ℃；鞘氣流量：12 L/min。

1.3 去氨加壓素的代謝實(shí)驗(yàn)

8名健康志愿者(4男4女)，年齡在23～25歲之間。留取空白尿后，服用0.2 mg醋酸去氨加壓素片，留取受試后第1 d的全部尿樣，及后3 d每隔12 h采集1次的陽性尿樣。所有尿樣均立刻于-20 ℃冰箱中冷凍保存。使用優(yōu)化后的前處理方法對(duì)尿樣進(jìn)行處理后上機(jī)檢測(cè)，基于實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制原型物質(zhì)代謝的曲線圖，以確定該物質(zhì)的檢測(cè)窗口期。

圖2 去氨加壓素的子離子掃描圖Fig.2 The product ion scan result of desmopressin

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)，選用ESI+電離模式對(duì)母離子進(jìn)行全掃描，確定母離子，去氨加壓素由于其小肽的結(jié)構(gòu)，更易產(chǎn)生雙電荷離子[M+2H]2+。使用SIM模式優(yōu)化加速電壓以保證母離子的傳輸效率，使用子離子掃描模式打碎母離子，尋找合適的子離子碎片(圖2)。經(jīng)過裂解規(guī)律的分析，選擇碎片m/z328.0、120.0為子離子，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]。最后，使用MRM模式對(duì)選擇的診斷離子對(duì)進(jìn)行碰撞能優(yōu)化。表1為優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)。

表1 去氨加壓素及內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass parameters of desmopressin and IS

*quantitative ion

2.2 色譜條件的優(yōu)化

由于去氨加壓素具有小肽類結(jié)構(gòu)，且分子量大于1 000，可能導(dǎo)致色譜柱堵塞或快速老化，因此本實(shí)驗(yàn)選擇分離大分子物質(zhì)的專用填料一體柱Phenomenex Onyx Monolothic C18(100 mm× 2.0 mm)。相比于甲醇，有機(jī)相選擇乙腈可使目標(biāo)物的響應(yīng)和分離效果更理想，選擇pH 3.5的10 mmol/L甲酸銨水溶液為水相可提高離子化效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，去氨加壓素及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的基線分離效果良好，峰寬均在0.2 min左右，去氨加壓素的保留時(shí)間約為2.7 min，內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間為3.3 min左右(見圖3)。

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1緩沖液pH值的選擇根據(jù)不同比例配制不同pH值(6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)的緩沖液(用甲酸或氨水進(jìn)行調(diào)整)，并考察了不同pH值下去氨加壓素的響應(yīng)值(質(zhì)量濃度為2 μg/L的加標(biāo)尿樣)。結(jié)果顯示，由于去氨加壓素為堿性物質(zhì)，采用pH 8.5的緩沖液時(shí)，其在SPE柱上的回收效果最佳。

2.3.2洗脫液的選擇在空白尿樣中添加相同濃度的藥物，分別以甲醇、異丙醇、乙腈、乙酸乙酯和甲基叔丁基醚等常用有機(jī)溶劑(均含體積分?jǐn)?shù)為5%的甲酸)為洗脫溶劑，對(duì)比了去氨加壓素在質(zhì)譜中的響應(yīng)強(qiáng)度。結(jié)果顯示，以乙酸乙酯為洗脫液時(shí)，去氨加壓素在質(zhì)譜中的響應(yīng)強(qiáng)度最大，回收效果最好，且信噪比最佳；乙腈的回收效果次之。將乙酸乙酯和乙腈按照一定比例混溶后作為洗脫溶劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)乙腈和乙酸乙酯的體積比為80∶ 20時(shí)(含5%甲酸)洗脫能力最好。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了洗脫溶劑中不同甲酸含量(0%、5%、10%、15%)的影響，結(jié)果表明，甲酸為5%時(shí)的洗脫效果最佳。因此，實(shí)驗(yàn)最終選擇體積比為80∶ 20的乙腈-乙酸乙酯(含5%甲酸)混合溶液作為洗脫液。

2.4 線性范圍及檢出限

配制不同質(zhì)量濃度的去氨加壓素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.5、1、2、5、10、15、20 μg/L),在優(yōu)化色譜條件下進(jìn)行檢測(cè),以去氨加壓素及內(nèi)標(biāo)的峰面積比(y)與質(zhì)量濃度(x，μg/L)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到去氨加壓素的線性方程和相關(guān)系數(shù)(r2)，按照信噪比接近3計(jì)算該方法的檢出限(LOD)。結(jié)果表明，去氨加壓素的線性范圍為0.5～20 μg/L，線性方程為y=0.002 1x-0.595 5，r2=0.997 2，檢出限為0.2 μg/L。

2.5 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

使用10份不同空白尿樣分別配制去氨加壓素的加標(biāo)水平為0.5、2、5 μg/L的尿樣，進(jìn)行日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)；再用6份不同空白尿樣分別配制上述3個(gè)水平的去氨加壓素加標(biāo)尿樣，進(jìn)行日間精密度、提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。在低、中、高3個(gè)水平下的日內(nèi)、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于10%，提取回收率均高于59%，基質(zhì)效應(yīng)為83.2%～121.3%。表明實(shí)驗(yàn)存在一定的基質(zhì)增強(qiáng)或抑制效應(yīng)，但基本控制在±20%內(nèi)，符合WADA對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的一般要求，可以滿足尿樣中去氨加壓素的檢測(cè)要求。

表2 去氨加壓素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、回收率及基質(zhì)效應(yīng)Table 2 RSDs,recoveries and matrix effects of desmopressin

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用本方法測(cè)定了8位志愿者受試后0～24 h內(nèi)的陽性尿樣，并將結(jié)果與空白尿及配制的加標(biāo)樣品進(jìn)行對(duì)比。圖4分別為添加了0.5 μg/L的對(duì)照樣品、某位志愿者受試前的空白樣品及其服藥后2 h左右留取的陽性樣品的藥物檢測(cè)情況。

圖5 志愿者服藥后留取的尿樣中去氨加壓素的檢測(cè)濃度Fig.5 Desmopressin concentration after volunteers took the drug

圖5顯示了8名志愿者服藥前后尿樣中去氨加壓素原型代謝的檢測(cè)濃度，最高檢出質(zhì)量濃度達(dá)2.4 μg/L，最長(zhǎng)可檢測(cè)時(shí)間達(dá)到服藥后800 min(約13 h)，去氨加壓素在尿中濃度達(dá)到峰值的平均時(shí)間在服藥后70～150 min。相比于已有文獻(xiàn)報(bào)道，本研究首次采用LC-MS/MS檢測(cè)人體服用去氨加壓素后的原型代謝情況并繪制代謝曲線；同時(shí)明確了去氨加壓素在人體內(nèi)的代謝峰值時(shí)間；且相比其他報(bào)道僅在服藥后120 min(2 h)收集的尿液樣品中檢出去氨加壓素原型，本研究在服藥后最長(zhǎng)800 min之后(約13 h左右)仍可檢出藥物原型。詳細(xì)數(shù)據(jù)見表3。

表3 8位志愿者服藥后尿樣中去氨加壓素的檢測(cè)數(shù)據(jù)Table 3 Analysis data of desmopressin from 8 volunteers positive urine

M:male;F:female

3 結(jié) 論

本研究建立并優(yōu)化了對(duì)檢測(cè)去氨加壓素具有專屬性和有效性的檢測(cè)方法，在保證一定回收率，滿足WADA對(duì)該物質(zhì)檢出限要求的同時(shí)，縮短了前處理時(shí)間。后續(xù)實(shí)驗(yàn)證明該方法可從陽性尿樣中檢測(cè)出去氨加壓素，同時(shí)，根據(jù)檢測(cè)多人服藥后留取的陽性尿，繪制并明確了單次服用該藥物在人體內(nèi)的消除情況，并確定了檢測(cè)窗口期。本方法簡(jiǎn)便，通用性廣，檢測(cè)成本低，且相比已有文獻(xiàn)將去氨加壓素的檢測(cè)窗口期延長(zhǎng)至服藥后800 min，提升了檢測(cè)能力，為興奮劑檢查部門提供了數(shù)據(jù)參考。