基于D101C大孔吸附樹脂的原人參三醇組皂苷的分離研究

成樂琴，張躍偉，李延春，李 玲，孫 碩

(1.吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022；2.吉林省彩森仁生物科技有限責(zé)任公司，吉林 通化 134000)

人參皂苷是人參(Panax ginseng C．A．Meyer)屬五加科草本植物—人參的代表性藥物活性成分[1]，根據(jù)皂苷元結(jié)構(gòu)的不同，主要分為達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷和齊墩果酸型五環(huán)三萜皂苷，其中達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜皂苷分為原人參二醇組皂苷(以下簡稱PPD型皂苷)和原人參三醇組皂苷(以下簡稱PPT型皂苷).

人參皂苷顯示出良好的藥理活性.例如人參皂苷Rg1可以抑制白血病細(xì)胞增殖[2]；人參皂苷Re對(duì)阿爾茨海默病有治療作用[3]；人參皂苷Rh1能抑制人肝癌細(xì)胞MMP-1的表達(dá)[4]；PPT型皂苷20(S)-原人參三醇和20(S)-原人參二醇具有抗疲勞作用和抗應(yīng)激作用[5,6]；人參皂苷Rg3、Rg5、Rk1、Rh2等具有良好的抗腫瘤、提高免疫力、保護(hù)心血管、改善記憶力[7-11]等功效.

大量的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)表明，目前對(duì)人參皂苷的研究更多集中在PPD型皂苷，特別是聚焦在通過PPD型主要人參皂苷的結(jié)構(gòu)修飾獲得的次級(jí)皂苷及其衍生物，因此有必要進(jìn)行PPT型皂苷的分離研究，為PPT型皂苷、單體PPT型皂苷以及衍生物的藥理活性的廣泛開展提供原料支持.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

人參莖葉總皂苷購自撫松第一參廠，含PPT型皂苷27.2%，PPD型皂苷24.8%；D101C大孔吸附樹脂購自西安藍(lán)曉科技發(fā)展有限公司；蒸餾水自制、乙醇為分析純；乙腈為色譜純；純凈水為娃哈哈食品有限公司生產(chǎn)的飲用純凈水.

P230P型高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)；TS-200B臺(tái)式振蕩器(上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造器有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 D101C大孔吸附樹脂的預(yù)處理

1.2.2 人參莖葉總皂苷的吸附條件對(duì)D101C大孔吸附樹脂吸附的影響

稱取預(yù)處理過D101C大孔吸附樹脂1.000 0 g(濕重)若干，分別加入15 mL濃度為5、10、15、20、25 mg/mL的人參莖葉總皂苷水溶液，在15～55 ℃條件下振蕩吸附6～18 h，過濾.濾液經(jīng)過HPLC分析測定，換算出單位樹脂對(duì)PPD型皂苷和PPT型皂苷的吸附量.樹脂對(duì)人參皂苷的吸附量以PPD型皂苷和PPT型皂苷的含量之和計(jì)算.

1.2.3 乙醇濃度對(duì)D101C大孔吸附樹脂的選擇性解析影響

稱取預(yù)處理過的D101C大孔吸附樹脂1.000 0 g(濕重)，加入15 mL濃度為15 mg/mL的人參莖葉總皂苷水溶液，在15 ℃振蕩吸附14 h.吸附液過濾，上清稀釋3倍，重新利用D101C大孔吸附樹脂震蕩吸附3 h.樹脂用蒸餾水洗滌3次，于25 ℃條件下分別用25%、30%、35%、45%、50%和55%的乙醇溶液振蕩解吸14 h.解析液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，HPLC分析，測定乙醇濃度對(duì)D101C大孔吸附樹脂解析PPD皂苷和PPT皂苷的影響.

1.2.4 人參皂苷的HPLC分析

色譜條件：采用色譜柱12030468R(150×4.60 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；紫外檢測波長：203 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量:：20 μL；流動(dòng)相：乙腈(A)，純凈水(B).

梯度洗脫程序：0.00 min，A：22%；10.00 min，A：22%；20.00 min，A：27%；25.00 min，A：31%；45.00 min，A：38%；50 min，A：50%；51 min，A：90%；71 min，A：90%；71.1 min，A：22%；81.1 min，A：22%.

2 結(jié)果與討論

2.1 D101C大孔吸附樹脂的預(yù)處理

D101C大孔吸附樹脂中含有殘留的聚合單體、致孔劑、分散劑和防腐劑，在使用前對(duì)樹脂進(jìn)行了乙醇浸泡、酸堿洗滌和蒸餾水洗滌等預(yù)處理，使用前用蒸餾水洗至無醇味.另取部分預(yù)處理D101C大孔吸附樹脂在烘箱中烘干至質(zhì)量不再下降，計(jì)算出樹脂含水量為66.17%.

2.2 人參莖葉總皂苷濃度對(duì)D101C大孔吸附樹脂的吸附影響

稱取五份預(yù)處理過的D101C大孔吸附樹脂1.000 0 g(濕重)，分別加入15 mL濃度為5、10、15、20、25 mg/mL的人參莖葉總皂苷水溶液，在25 ℃條件下振蕩吸附12 h.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1.

濃度/(mg·mL-1)圖1 濃度對(duì)PPD、PPT和總皂苷的吸附影響

樹脂對(duì)人參莖葉總皂苷的吸附量根據(jù)如下公式計(jì)算：

(1)

式中，Qe為單位樹脂對(duì)人參皂苷吸附總量，mg/g；C0為吸附前人參莖葉皂苷水溶液濃度，mg/mL；Ce為吸附后人參莖葉皂苷水濃度，mg/mL；Vi為人參莖葉皂苷水溶液的體積，mL；W為干樹脂的質(zhì)量，g.

由圖1可以看出，人參莖葉總皂苷水溶液的濃度對(duì)D101C大孔吸附樹脂吸附PPT型和PPD型皂苷的影響非常顯著，且對(duì)兩種不同類型皂苷的吸附影響規(guī)律有所不同.即PPD皂苷的吸附量隨著人參莖葉總皂苷濃度的增大而增大，PPT型皂苷的吸附量隨著人參莖葉總皂苷濃度的增大先增加后減少，而人參莖葉總皂苷的吸附量在15 mg/mL時(shí)達(dá)到最大.

分別對(duì)不同莖葉皂苷濃度下的未吸附的上清皂苷溶液過濾后減壓濃縮至干，計(jì)算上清液中兩種皂苷的含量及質(zhì)量比，結(jié)果見圖3和圖4.

濃度/(mg·mL-1)圖2 上清液中PPT與PPD皂苷含量

濃度/(mg·mL-1)圖3 上清液中PPT與PPD皂苷比值

由圖2可知，人參莖葉皂苷濃度從5 mg/mL增加到15 mg/mL時(shí)，上清液中PPT型皂苷含量逐漸增大，而PPD型皂苷大多數(shù)被樹脂吸附，因此含量很少；而皂苷濃度進(jìn)一步增大時(shí)，兩種皂苷的含量同時(shí)顯著增加.圖3是不同皂苷濃度下上清液中兩種皂苷的質(zhì)量比，與兩種皂苷含量的變化趨勢不同，PPT與PPD皂苷的比值在15 mg/mL的人參莖葉皂苷濃度下達(dá)到最大值25.5，此時(shí)PPT皂苷的含量為28.3%，略高于原料，PPT皂苷在兩種皂苷中所占比例為96.2%，高于原料的52.4%.

綜合考慮人參皂苷的吸附特點(diǎn)及上清液中PPT皂苷的富集程度，D101C大孔吸附樹脂對(duì)人參莖葉皂苷的吸附濃度確定為15 mg/mL.

2.3 吸附時(shí)間對(duì)D101C大孔吸附樹脂選擇性吸附的影響

稱取七份預(yù)處理過的D101C大孔吸附樹脂1.000 0 g(濕重)，分別加入15 mL濃度為15 mg/mL的人參莖葉總皂苷水溶液，在25 ℃溫度下振蕩吸附6、8、10、12、14、16和18 h.樹脂對(duì)PPD、PPT和人參莖葉總皂苷的吸附結(jié)果見圖4.

時(shí)間/h圖4 不同吸附時(shí)間下PPT與PPD皂苷的吸附量曲線

吸附時(shí)間對(duì)樹脂吸附PPD皂苷的影響較小，對(duì)PPT皂苷的吸附影響相對(duì)較大.在D101C大孔吸附樹脂對(duì)莖葉皂苷的吸附中，隨著吸附時(shí)間的增加，PPD皂苷吸附量有微弱增長，而PPT吸附量有微弱降低，當(dāng)吸附時(shí)間達(dá)到14 h時(shí)，PPT皂苷的吸附量最小，繼續(xù)延長吸附時(shí)間時(shí)，由于PPD皂苷已基本被吸附，不隨時(shí)間而增加，因此PPT吸附量出現(xiàn)反轉(zhuǎn)增大的現(xiàn)象.由此可見，吸附時(shí)間為14 h更有利于PPT皂苷在上清液中的富集.

2.4 吸附溫度對(duì)D101C大孔吸附樹脂選擇性吸附的影響

稱取五份預(yù)處理過的D101C大孔吸附樹脂1.000 0 g(濕重)，加入15 mL濃度為15 mg/mL的人參莖葉總皂苷水溶液，分別在15、25、35、45、55 ℃條件下振蕩吸附14 h.樹脂對(duì)PPD、PPT和人參莖葉總皂苷的吸附結(jié)果見圖5.

溫度/(mg·mL-1)圖5 不同溫度條件下PPT和PPD皂苷的吸附量曲線

在探索的溫度范圍內(nèi)，吸附溫度對(duì)PPD皂苷的吸附影響不大，這是因?yàn)?5 ℃時(shí)PPD皂苷吸附量為55.41 mg/g，吸附率已經(jīng)達(dá)到99.27%.于此形成對(duì)比的是PPT皂苷的吸附量隨著吸附溫度的增加逐漸增大，這說明相對(duì)低的吸附溫度有助于上清液中PPT皂苷的富集.

2.5 乙醇濃度對(duì)D101C大孔吸附樹脂的選擇性解析影響

PPT型皂苷和PPD型皂苷由于分子骨架結(jié)構(gòu)不同，極性不同，在D101C大孔吸附樹脂中的吸附和被解析能力有所相同.PPT型皂苷極性相對(duì)弱，在D101C大孔吸附樹脂中的吸附能力弱于PPD型皂苷，因此更容易被解析.在其他條件不變，只改變解析液乙醇濃度時(shí)，兩種皂苷的解析率及皂苷含量見圖6～7.

乙醇濃度/%圖6 不同乙醇濃度下PPT和PPD皂苷的解析率

由圖6可知，隨著乙醇濃度的增大，PPT和PPD皂苷的解析率均呈現(xiàn)增加的趨勢.當(dāng)乙醇濃度由25%增加到45%時(shí)，PPT皂苷解析率增幅明顯，PPD皂苷解析率增幅微弱.當(dāng)乙醇濃度為45%時(shí)，PPT皂苷解析率為93.9%，而PPD皂苷解析率僅為10.3%.當(dāng)繼續(xù)增加乙醇濃度時(shí)，PPT皂苷解析率變化不大，而PPD皂苷解析率出現(xiàn)大幅增長，這說明PPT皂苷可以在相對(duì)低濃度乙醇中解析，而PPD皂苷需要在相對(duì)高濃度乙醇中才能很好地解析.

乙醇濃度/%圖7 解析液中PPT和PPD皂苷的含量

由圖7可知，不同濃度的乙醇解析液對(duì)PPT皂苷的純度影響非常大.隨著乙醇濃度的增大，PPT皂苷含量逐漸增大到86.80%，繼續(xù)增大乙醇濃度，PPT皂苷的解析率雖然有所增加(見圖7)，但含量開始減小，當(dāng)乙醇濃度為55%時(shí)，PPT皂苷含量降至63.10%，說明在此乙醇濃度下部分人參莖葉皂苷中的其他其他雜質(zhì)被解析.綜合不同濃度乙醇解析液中皂苷的含量、解析率，用45%濃度的乙醇解析對(duì)PPT皂苷的分離提純更加有利.

圖8是未經(jīng)D101C大孔吸附樹脂處理的人參莖葉皂苷原料和通過樹脂吸附和乙醇解析得到的提純?nèi)藚⑶o葉皂苷的HPLC分析譜圖.

圖8 人參莖葉總皂苷(A)和提純后人參皂苷(B)的HPLC譜圖

表1 PPD與PPT皂苷分離前后對(duì)比

3 結(jié) 論

本文主要考察了D101C大孔吸附樹脂對(duì)人參莖葉皂苷的吸附和解吸影響，并利用樹脂對(duì)莖葉皂苷中PPT型皂苷和PPD型皂苷的吸附和解析特點(diǎn)，分離了PPT型皂苷.實(shí)驗(yàn)表明，D101C大孔吸附樹脂對(duì)PPD型皂苷的吸附能力優(yōu)于對(duì)PPT型皂苷的吸附能力；人參莖葉皂苷中PPD型皂苷含量較低，吸附溫度對(duì)PPD皂苷的吸附影響不大，對(duì)PPT皂苷的吸附起促進(jìn)作用；吸附時(shí)間對(duì)人參莖葉皂苷中PPD型皂苷的吸附影響小，對(duì)PPT皂苷的吸附表現(xiàn)為先小幅減小，后增大的趨勢：乙醇解析莖葉皂苷時(shí)，45%乙醇解析時(shí)，93.9%的PPT型皂苷可以被解析，而PPD型皂苷只有10.2%能夠被解析.本研究通過D101C大孔吸附樹脂的吸附和解析方法，從人參莖葉總皂苷中分離了PPT皂苷，該方法操作簡單，PPT/PPD比值大，PPT純度高，為人參莖葉皂苷中分離PPT皂苷提供了簡單易行的操作方法.