甘肅黑豬H-FABP基因多態(tài)性篩查及蛋白功能預(yù)測

張 麗，劉麗霞，農(nóng)偉倫，李慧潔，張國華，盧建雄

(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730124)

甘肅黑豬是我國甘肅省培育的第一個瘦肉型專門化新豬種，含有內(nèi)江豬、巴克夏和八眉豬的血緣，主要分布在甘肅天水、隴南、平?jīng)觥c陽及甘南等地，陜西也有零星分布。甘肅黑豬的繁殖力和純合度均較高，與其他優(yōu)質(zhì)品種公豬雜交后代在繁殖性能及增重速度和胴體瘦肉率方面表現(xiàn)出高的雜種優(yōu)勢。脂肪酸結(jié)合蛋白(Fatty acid binding proteins，F(xiàn)ABPs)是一類低分子量對脂肪酸有較高親和力的可溶性蛋白質(zhì)。至今為止，已經(jīng)分離出9種類型，其中，心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(Hear fatty acid binding proteins，H-FABP)、脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白(Adipocyte fatty acid binding proteins，A-FABP)、肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(Live fatty acid binding proteins，L-FABP)、腸型脂肪酸結(jié)合蛋白(Intestinal fatty acid binding proteins，I-FABP)是該家族中比較常見的4種類型[1]。其中，H-FABP基因是影響肌內(nèi)脂肪含量(Intramuscular fat，IMF)的主要基因，對機(jī)體脂肪代謝有調(diào)控作用，研究H-FABP基因多態(tài)性對改善豬肉品質(zhì)具有重大意義[2]。肌內(nèi)脂肪含量是影響豬肉品質(zhì)的重要因素，主要作用是在肌內(nèi)脂肪氧化時溶解肌纖維束，從而提高肌肉嫩度和多汁性，進(jìn)而能通過Mailard反應(yīng)產(chǎn)生香味[3]。H-FABP作為FABPs家族中的重要成員，其mRNA表達(dá)量與IMF顯著相關(guān)[4]，是影響肌內(nèi)脂肪含量的重要候選基因，深入研究該基因的蛋白結(jié)構(gòu)與功能可為提高豬IMF提供理論基礎(chǔ)。

本研究以甘肅黑豬為研究對象，克隆出H-FABP基因4個外顯子，快速篩選其多態(tài)性，利用生物信息學(xué)方法從分子水平預(yù)測和分析其氨基酸理化性質(zhì)、編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，以期揭示甘肅黑豬H-FABP基因的遺傳特征，為該基因相關(guān)生長發(fā)育性狀和肌內(nèi)脂肪沉積等研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 耳組織DNA的提取及DNA池構(gòu)建

102頭甘肅黑豬新生仔豬耳組織，每頭剪取5 g，置于75%乙醇的離心管中保存并做好標(biāo)記，-70 ℃保存。采用試劑盒法提取基因總DNA。提取好的DNA，經(jīng)紫外分光光度計檢測后稀釋成相同濃度，各樣品吸取5 μL 用于構(gòu)建DNA池。

1.2 引物設(shè)計、PCR擴(kuò)增及序列測定

參照NCBI網(wǎng)站發(fā)布的野豬H-FABP基因序列(No.Y16180)，利用Primer 3.0在線軟件設(shè)計4對特異性引物(表1)用于擴(kuò)增甘肅黑豬H-FABP基因的4個外顯子區(qū)域，引物交由蘇州金唯智生物有限公司合成。經(jīng)PCR擴(kuò)增，獲得的良好產(chǎn)物由凝膠回收試劑盒純化回收后送至蘇州金唯智進(jìn)行雙向測序。測序結(jié)果用Lasergene系列軟件比對、矯正、拼接，最終獲得甘肅黑豬H-FABP基因編碼區(qū)序列。

表1 甘肅黑豬 H-FABP 基因引物信息Tab.1 Information of H-FABP primersin Gansu black pigs

1.3 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)處理

按照參考文獻(xiàn)[5-6]中介紹的在線軟件對甘肅黑豬H-FABP基因編碼區(qū)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘肅黑豬H-FABP基因PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得明亮清晰的條帶，片段大小與預(yù)期擴(kuò)增片段長度相符(圖1)。

2.2 甘肅黑豬H-FABP基因SNPs篩選及等位基因頻率估算

經(jīng)過軟件剪切拼接獲得甘肅黑豬H-FABP基因編碼區(qū)序列402 bp，將拼接好的甘肅黑豬H-FABP基因與GenBank中野豬(Y16180)編碼區(qū)序列比對，發(fā)現(xiàn)存在4個SNPs位點(diǎn)(圖2)，以外顯子和內(nèi)含子的第1個堿基為基準(zhǔn)，在第1內(nèi)含子734 bp處發(fā)生C→T突變，在第2外顯子152 bp處發(fā)生T→C突變，在第2內(nèi)含子30，121 bp處發(fā)生G→A和T→G突變，分別命名為C734T-Intron1、T152C-Exon2、G30A-Intron2、T121G-Intron2。其中，T152C-Exon2為錯義突變，氨基酸由原來的異亮氨酸(Ile)轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸(Thr)。等位基因頻率估測結(jié)果顯示，突變前后存在明顯差異(表2)。

M.Marker DL2000；1～4. H-FABP基因Exon1～Exon4 PCR產(chǎn)物。M.Marker DL2000;1-4. PCR product of Exon1-Exon4.

圖2 甘肅黑豬H-FABP基因測序結(jié)果Fig.2 Results of sequencing of H-FABP gene in Gansu black pigs

表2 甘肅黑豬 H-FABP基因的SNPs位點(diǎn)突變類型及等位基因頻率Tab.2 SNPs mutation types and allele frequency of H-FABPgene in Gansu black pigs

2.3 甘肅黑豬H-FABP氨基酸理化性質(zhì)預(yù)測分析

甘肅黑豬H-FABP基因編碼區(qū)翻譯的133個氨基酸殘基是由20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸構(gòu)成(圖3)，其中，負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp + Glu)為18，正電荷殘基總數(shù)(Arg + Lys)為17；分子式為C653H1052N172O206S4，分子質(zhì)量約為14.74 ku，半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為14.42。

圖3 甘肅黑豬H-FABP編碼氨基酸組成Fig.3 Putative amino acid compositionof H-FABPinGansublackpigs

2.4 甘肅黑豬H-FABP氨基酸親水性/疏水性預(yù)測分析

甘肅黑豬H-FABP編碼氨基酸親水性/疏水性預(yù)測結(jié)果如圖4所示，橫坐標(biāo)為編碼氨基酸位置，縱坐標(biāo)為親水性/疏水性分值。正值代表疏水性，負(fù)值代表親水性。其分值越高，疏水性越強(qiáng)；反之，則親水性越強(qiáng)。在氨基酸多肽鏈的第113 位丙氨酸(Ala)疏水性最強(qiáng)(+1.289)，第103位的天冬氨酸(Arg)親水性最強(qiáng)(-2.444)。整條氨基酸多肽鏈中，親水氨基酸所占比例較高，為62.15%，總平均親水值為-0.248，所以該蛋白表現(xiàn)為親水性。

圖4 甘肅黑豬H-FABP氨基酸疏水性預(yù)測結(jié)果Fig.4Hydrophobicity prediction resultsof H-FABP in Gansu black pigs

2.5 甘肅黑豬H-FABP氨基酸信號肽跨膜區(qū)的預(yù)測分析

信號肽位于分泌蛋白的N端。一般由15～30個氨基酸組成。信號肽是指導(dǎo)新合成蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)移的N-末端的短肽鏈，它負(fù)責(zé)把蛋白質(zhì)引導(dǎo)到含不同細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的亞細(xì)胞器內(nèi)[7]。信號肽預(yù)測結(jié)果顯示(圖5)，甘肅黑豬H-FABP氨基酸的C值為0.158，Y 值為0.122，S值為0.104，第14-15位氨基酸之間為切割點(diǎn)。因此，基本可以判定甘肅黑豬H-FABP編碼蛋白不存在信號肽。

2.6 甘肅黑豬H-FABP編碼蛋白質(zhì)磷酸化與N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測分析

甘肅黑豬H-FABP編碼蛋白質(zhì)磷酸化與N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果如圖6所示，氨基酸編碼序列中存在19個潛在的磷酸化位點(diǎn)，分別為4個Ser位點(diǎn)(Ser56、Ser64、Ser83、 Ser122)、14個Thr位點(diǎn)(Thr8、Thr40、Thr41、Thr51、Thr54、Thr57、Thr61、Thr74、Thr75、Thr103、Thr104、Thr117、Thr119、Thr126)和1個Tyr位點(diǎn)(Tyr20)，并存在1個潛在的N-糖基化位點(diǎn)。

圖5 甘肅黑豬H-FABP氨基酸信號肽預(yù)測結(jié)果Fig.5 Result of signal peptide on Gansu black pig H-FABP

2.7 甘肅黑豬H-FABP蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

多肽鏈依賴氫鍵排列成在一維方向上具有規(guī)則重復(fù)的構(gòu)象就是該蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。甘肅黑豬H-FABP編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖7，8所示，β-折疊(e)數(shù)量最多，α-螺旋(h)數(shù)量最少，其次為無規(guī)則卷曲，二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測該蛋白為混合型蛋白。

實(shí)線.磷酸化潛力值；虛線.N-糖基化潛力值。Full line.Potential of phosphorylation;Dashed line.Potential of N-Glycosylation.

h.α螺旋；e.β-折疊；t.β-轉(zhuǎn)角；c.無規(guī)則卷曲。h.Alpha helix; e.Beta sheet; t.Beta turn; c.Random coil.

A.T152C-Exon2突變前；B.T152C-Exon2突變后。紅色.α螺旋；黃色.β折疊；綠色.β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲。A.Before mutation T152C-Exon2; B.After mutation T152C-Exon2.Red.Alpha helix; Yellow.Beta sheet-sheet; Green.Beta turn and random coil.

2.8 甘肅黑豬H-FABP氨基酸序列的同源性比較及系統(tǒng)發(fā)育分析

甘肅黑豬H-FABP氨基酸與其他物種同源性比較結(jié)果顯示，H-FABP基因幾乎在所有哺乳動物中都有表達(dá)，在某些非哺乳動物中也存在，但以哺乳動物為主；從進(jìn)化樹上可以看出，與甘肅黑豬親緣關(guān)系最近的為野驢和綿羊，都為偶蹄目動物，符合物種進(jìn)化規(guī)律(圖9)。

圖9 甘肅黑豬H-FABP蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 Phylogenetic tree of H-FABP protein in Gansu black pigs

3 討論

FABPs家族基因作為影響豬肉嫩度、風(fēng)味的肉質(zhì)基因，其4種主要家族基因的多態(tài)性對豬肉嫩度、風(fēng)味的影響程度以及作用原理不同。H-FABP作為主要家族成員，其主要功能是與疏水性配體結(jié)合，促使細(xì)胞攝取脂肪酸，從而影響豬肉多汁性[8]。單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(Single nucleotide polymorphisms site，SNPs)是染色體基因組中單個核苷酸堿基以顛換、轉(zhuǎn)換、插入和缺失等形式突變所引起的DNA序列的改變[9]，是基因組水平上最常見的一種遺傳變異類型，具有多態(tài)性豐富和遺傳穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，在哺乳動物中平均每300～1 000 bp就有1個SNP位點(diǎn)[10]。位于基因內(nèi)部的部分編碼區(qū)的SNPs可引起蛋白質(zhì)編碼氨基酸序列的變異，這種改變會影響DNA各組成元件的功能以及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA水平和蛋白質(zhì)的表達(dá)，進(jìn)一步會導(dǎo)致生物機(jī)體功能或性狀的改變。何桂娟等[11]、周春寶等[12]與周泉勇等[13]分別在莆田黑豬、蘇姜豬和玉山黑豬H-FABP基因5′調(diào)控區(qū)與第2外顯子均發(fā)現(xiàn)多態(tài)性。郭吉利等[14]研究顯示，豫南黑豬H-FABP基因5′調(diào)控區(qū)和第2內(nèi)含子存在4個SNPs，且第2內(nèi)含子上的3個酶切位點(diǎn)處于連鎖平衡狀態(tài)。本研究也認(rèn)為，H-FABP基因?yàn)楦叨榷鄳B(tài)基因。甘肅黑豬H-FABP基因存在4個堿基突變位點(diǎn)，分別為C734T-Intron1、T152C-Exon2、G30A-Intron2、T121G-Intron2，其中，T152C-Exon2為錯義突變，導(dǎo)致氨基酸由原來的異亮氨酸(Ile)轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸(Thr)。覃兆鮮等[15]在陸川豬H-FABP基因編碼區(qū)第235 bp處發(fā)現(xiàn)1個A→G的錯義突變，氨基酸由原來的精氨酸變(Arg)變?yōu)楦拾彼?Gly)。這可能是由品種、遺傳背景、飼養(yǎng)環(huán)境等不同導(dǎo)致的。

蛋白質(zhì)由20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸構(gòu)成，其不同的空間結(jié)構(gòu)對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、構(gòu)象和功能具有重要影響。甘肅黑豬H-FABP編碼蛋白由133個氨基酸構(gòu)成，依據(jù)氨基酸理論等電點(diǎn)(6.11)、半衰期(30 h)和氨基酸的不穩(wěn)定指數(shù)14.42(<40)推測，該蛋白是穩(wěn)定蛋白，與高紅等[16]分析結(jié)果一致，符合賈浩等[17]關(guān)于蛋白質(zhì)半衰期與穩(wěn)定性之間呈正相關(guān)的理論。總平均疏水性能夠體現(xiàn)蛋白質(zhì)的親水/疏水性質(zhì)，且數(shù)值越高代表疏水能力越強(qiáng)[18]，甘肅黑豬H-FABP編碼氨基酸總平均疏水性值為-0.248，由此推斷，該蛋白為親水的可溶性蛋白，與高紅等[16]和王蘭萍等[19]認(rèn)為的相同或相近物種間H-FABP基因編碼蛋白質(zhì)差異不大的理論完全一致。蛋白質(zhì)磷酸化影響著蛋白質(zhì)翻譯后的修飾，發(fā)生的酯化作用改變了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，以磷酸化形式的混合物介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的活性，既可以改變細(xì)胞應(yīng)激或新陳代謝，又可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用、基因表達(dá)、細(xì)胞生長和分化[20]。甘肅黑豬H-FABP編碼氨基酸有19個潛在的磷酸化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)可能影響到細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，從而影響機(jī)體的生理生化功能。蛋白質(zhì)經(jīng)過糖基化作用使不同的蛋白質(zhì)打上不同的標(biāo)記，最后形成糖蛋白，從而改變多肽構(gòu)象和增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。因此，糖基化作用是對蛋白質(zhì)很重要的修飾過程。蛋白質(zhì)序列中的N-糖基化，這種修飾可能干擾酶的折疊，而蛋白質(zhì)的錯誤折疊將導(dǎo)致蛋白體降解，或者妨礙通過分泌途徑的轉(zhuǎn)運(yùn)，阻礙底物結(jié)合引起活性的喪失[21]。蛋白質(zhì)糖基化作用對蛋白質(zhì)折疊、分選及其定位有重要影響，主要修飾天冬酰胺上的N端，參與受體激活、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等作用，影響免疫分子的結(jié)構(gòu)和功能，從而影響機(jī)體對抗原的應(yīng)答反應(yīng)[22]。甘肅黑豬H-FABP編碼蛋白質(zhì)僅存在1個N-糖基化位點(diǎn)，有可能直接影響H-FABP基因調(diào)控IMF的增加。信號肽能引導(dǎo)新蛋白質(zhì)的合成，決定著該蛋白是否為分泌蛋白以及擔(dān)負(fù)新生肽鏈在細(xì)胞中的定位，從而影響蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的功能[23]。因此，信號肽在蛋白質(zhì)合成過程中起到非常重要的作用，但本研究顯示，甘肅黑豬H-FABP基因編碼蛋白質(zhì)不存在信號肽，為非分泌蛋白，與高紅等[16]研究結(jié)果一致。

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，對其進(jìn)行預(yù)測和分析有助于研究該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)與密碼子第2位存在聯(lián)系，遺傳密碼的組織結(jié)構(gòu)反映了蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，因此，推動蛋白質(zhì)組織結(jié)構(gòu)的主要適應(yīng)力之一可能是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，影響著蛋白質(zhì)的折疊，從而影響蛋白質(zhì)的功能[24]。本研究中，甘肅黑豬H-FABP編碼產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋數(shù)量小于30%，β-折疊數(shù)量大于30%，由此可推測該蛋白為混合型蛋白；二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致，均以β-折疊為主導(dǎo)地位，其次為無規(guī)則卷曲和α-螺旋，不含有其他二級結(jié)構(gòu)，這與高紅等[16]、王蘭萍等[19]和Zheng等[25]分析結(jié)果一致。α-螺旋和無規(guī)則卷曲是蛋白質(zhì)中配體與受體結(jié)合的活性部位，無規(guī)則卷曲更容易受到側(cè)鏈的相互影響而改變空間構(gòu)象[26]，H-FABP蛋白質(zhì)肽鏈中的某些氨基酸可導(dǎo)致其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響其與受體結(jié)合的親和力及其生物學(xué)活性，進(jìn)而影響豬肉中肌內(nèi)脂肪含量的分布，從而影響豬肉品質(zhì)。對錯義突變位點(diǎn)T152C-Exon2進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析表明，突變前后α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角均沒有改變，可能是編碼氨基酸肽鏈中只有1個錯義突變位點(diǎn)，雖然氨基酸改變了，但并沒有引起該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。突變前后蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析結(jié)果表明，T152C-Exon2位點(diǎn)突變堿基T、 C分別對應(yīng)的氨基酸為異亮氨酸(Ile)和蘇氨酸(Thr)，氨基酸的性質(zhì)由非極性轉(zhuǎn)變?yōu)闃O性。位于編碼蛋白質(zhì)活性中心的大部分氨基酸殘基為非極性的疏水性氨基酸，這種變異可能對該蛋白質(zhì)的功能產(chǎn)生一定影響，但蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)突變前后并沒有發(fā)生改變。錯義突變指堿基序列的改變將導(dǎo)致編碼氨基酸的變化，從而對蛋白質(zhì)產(chǎn)生影響[27]。同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，甘肅黑豬與綿羊、野驢等偶蹄獸同源性最近，與小家鼠、鼠、褐家鼠的遺傳距離最遠(yuǎn)，親緣關(guān)系也最遠(yuǎn)，與其他有蹄類可歸為一類。

本研究系統(tǒng)地對甘肅黑豬H-FABP基因編碼氨基酸的理化特性、蛋白結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了預(yù)測，為進(jìn)一步確定H-FABP基因多態(tài)性與IMF的關(guān)系，尋求與IMF沉積緊密連鎖的遺傳標(biāo)記，以便在甘肅黑豬育種實(shí)踐的標(biāo)記輔助選擇中發(fā)揮遺傳改良作用提供依據(jù)。