薏苡仁提取物對(duì)BALB/c小鼠特應(yīng)性皮炎模型的療效觀察及機(jī)制探討

王俊霞 楊子微 車雅敏 單士軍 陳洪鐸

300052天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院皮膚性病科（王俊霞、楊子微、車雅敏、單士軍）；中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚性病科（陳洪鐸）

特應(yīng)性皮炎（AD）的發(fā)生與遺傳、環(huán)境、免疫等因素密切相關(guān)［1］。薏苡仁是禾本科植物薏苡的種子［2］，其活性成分主要為薏苡仁油、薏苡仁多糖、薏苡仁油多肽等，具有增強(qiáng)免疫力、抗炎、抗腫瘤等多種作用［3］。我們探討薏苡仁提取物（theextraction of Semen Coicis，ESC）對(duì)AD模型小鼠的治療效果，初步探討其作用機(jī)制。

一、材料

1.動(dòng)物：SPF級(jí)純系健康BALB/c雌性小鼠40只，6～8周齡，體重20～ 22 g，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（京）2014?0004，由天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。

2.試劑與儀器：2，4-二硝基氯苯（DNCB）來自美國Sigma公司，ESC及其基質(zhì)由鉑唯愛天津生物科技有限公司提供，ESC為10%（v/v）薏米油提取物，基質(zhì)包括卵磷脂和一些賦形劑。白細(xì)胞介素4（IL?4）、IgE、干擾素γ（IFN?γ）ELISA檢測(cè)試劑盒來自天津賽東南生物技術(shù)有限公司。

二、分組及處理

1.分組及處理：40只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白組8只、模型組32只。造模完成后，空白組8只、模型組8只立即處死，另24只小鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、ESC組、基質(zhì)組，每組8只。各組小鼠分籠飼養(yǎng)，保持自由飲水和標(biāo)準(zhǔn)飲食，定期清潔消毒。

2.造模：小鼠在室溫（25±1）℃和60%濕度條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)前1天用10%硫化鈉溶液背部脫毛（面積2 cm×2 cm）；實(shí)驗(yàn)第1～3天每天將100μl 1%DNCB溶液（以丙酮和橄欖油1∶4作為基質(zhì)配制而成）外涂于小鼠背部脫毛區(qū)及雙耳部；第4天開始改用0.1%DNCB 100μl，每2天外涂1次，直到第28天［4］。造模第28天，模型組小鼠背部出現(xiàn)紅斑、丘疹、滲出、結(jié)痂，耳部出現(xiàn)腫脹、紅斑，在該組8只小鼠背部取材行病理檢查，摘眼球取血，3 000 r/min（離心半徑10 cm）離心20min，分離上清液，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.治療方案：模型對(duì)照組不予任何處理，ESC組和基質(zhì)組小鼠每天背部皮損分別涂抹ESC或基質(zhì)，每次200μl，涂抹后按摩小鼠皮損處，使其充分吸收，連續(xù)4周。根據(jù)小鼠與人體的體表面積比例換算給藥劑量，即200μl/cm2，薏苡仁提取物的濃度為10%（參考既往研究薏苡仁提取物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響實(shí)驗(yàn)所得出的最適濃度［5］）。末次給藥12 h后，3組小鼠均摘除眼球取血，靜置后離心，留取血清備用。在所有小鼠背部皮損處取5mm2組織標(biāo)本，4%甲醛固定備用。

三、觀察指標(biāo)及方法

1.小鼠皮損表現(xiàn)：造模完成及末次給藥12 h后觀察各組小鼠背部皮損大體表現(xiàn)，將紅斑、滲出、結(jié)痂、搔抓、干燥分別按正常（0分）、輕度（1分）、中度（2分）、重度（3分）評(píng)分。

2.小鼠耳部皮損厚度：用測(cè)厚儀于造模前、造模完成及末次給藥12 h后測(cè)量各組小鼠左耳厚度。

3.組織病理學(xué)觀察：對(duì)組織標(biāo)本行石蠟包埋切片、HE染色，觀察每組小鼠表皮、真皮改變。甲苯胺藍(lán)染色，觀察肥大細(xì)胞浸潤情況，計(jì)算每組10個(gè)高倍（×400倍）視野下肥大細(xì)胞數(shù)，取平均值。

4.水通道蛋白3（AQP3）、Toll樣受體2（TLR2）和TLR4表達(dá)檢測(cè)：石蠟切片脫蠟水化，抗原修復(fù)，加兔抗鼠一抗（TLR2多克隆抗體，1∶100稀釋；AQP3多克隆抗體，1∶200稀釋；TLR4多克隆抗體，1∶400稀釋），加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（美國Sigma公司），雙花扁豆凝集素（DBA）顯色，封片觀察。

5.血清細(xì)胞因子檢測(cè)：按試劑盒說明書操作，ELISA法檢測(cè)血清IgE、IL?4和IFN?γ水平。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，方差齊性檢驗(yàn)后，兩樣本均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用方差分析及SNK法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

四、結(jié)果

1.小鼠皮損表現(xiàn)：造模第28天，空白組小鼠皮膚沒有任何變化，模型組小鼠皮膚出現(xiàn)不同程度的紅斑、干燥、抓痕、結(jié)痂，煩躁。給藥第28天，ESC組小鼠皮損緩解，其臨床癥狀評(píng)分與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），基質(zhì)組與模型對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、表1。

2.小鼠耳部皮損厚度：治療28天后，基質(zhì)組、模型對(duì)照組、ESC組左耳厚度兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。見表1。

3.小鼠背部皮損組織病理表現(xiàn)：造模完成后，空白組小鼠表皮薄，真皮膠原規(guī)則，附屬器正常，無炎癥細(xì)胞浸潤；模型組表皮角化過度、角化不全、漿液滲出，表皮棘層增厚，細(xì)胞間水腫，真皮顯著炎癥細(xì)胞浸潤，見圖2A、2B。治療28 d時(shí)模型對(duì)照組和基質(zhì)組表皮輕度增生，細(xì)胞間水腫，真皮中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤；ESC組表皮稍增厚，伴真皮內(nèi)稀疏炎癥細(xì)胞浸潤。見圖2。ESC組與模型對(duì)照組及基質(zhì)組比較真皮浸潤的肥大細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

圖1 各組小鼠皮損表現(xiàn) 造模完成后空白組小鼠幾乎沒有變化，模型組小鼠背部出現(xiàn)不同程度的紅斑、抓痕、結(jié)痂。治療28 d后，薏苡仁提取物組小鼠皮損消退，表皮光滑；模型對(duì)照組和基質(zhì)組仍可見脫屑、增厚

圖2 特應(yīng)性皮炎造模完成后及治療28 d時(shí)各組小鼠皮損病理表現(xiàn)（2A、2B：HE×200；2C～2E：HE×100）

表1 特應(yīng)性皮炎小鼠臨床癥狀評(píng)分、皮損厚度、真皮肥大細(xì)胞浸潤程度比較（±s）

表1 特應(yīng)性皮炎小鼠臨床癥狀評(píng)分、皮損厚度、真皮肥大細(xì)胞浸潤程度比較（±s）

注：a與模型對(duì)照組比較，P＜0.05；b與基質(zhì)組比較，P＜0.05

組別模型對(duì)照組薏苡仁提取物組基質(zhì)組F值P值n值8 8 8臨床癥狀評(píng)分2.50±0.58 1.50±0.58a 2.25±0.50 7.20＜0.001鼠耳厚度（mm）0.33±0.01b 0.31±0.01ab 0.28±0.01 16.10＜0.001浸潤肥大細(xì)胞數(shù)（個(gè)/400倍視野）28.94±1.28 15.18±1.64a 28.08±2.15 8.40＜0.01

4.免疫組化檢測(cè)結(jié)果：見圖3。治療28 d時(shí)，模型對(duì)照組AQP3表達(dá)高于基質(zhì)組但低于ESC組；模型對(duì)照組TLR2和TLR4表達(dá)高于基質(zhì)組，ESC組TLR2和TLR4較模型對(duì)照組表達(dá)下降。基質(zhì)組與模型對(duì)照組AQP3及TLR2和TLR4表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

5.血清IgE、IL?4和IFN?γ水平：見表2。造模完成后，模型組外周血IgE、IL?4水平顯著高于空白組（q值分別為-6.88、-5.07，均P ＜ 0.05），IFN?γ水平顯著低于空白組（q=8.50，P ＜ 0.05）。治療28 d時(shí)，ESC組外周血IgE、IL?4水平顯著低于模型對(duì)照組（q值分別為6.63、8.95，均P ＜ 0.05），IFN?γ水平高于模型對(duì)照組（q=-4.78，P＜0.05），基質(zhì)組與模型對(duì)照組相比，上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

五、討論

半抗原法是目前比較常用的AD造模方法，此方法也在文獻(xiàn)［6］中提及，即采取小劑量DNCB多次刺激小鼠，產(chǎn)生的皮膚炎癥反應(yīng)類似于人類的AD。這種方法已經(jīng)大量應(yīng)用于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床。本研究用DNCB作為致敏劑刺激小鼠進(jìn)行造模，刺激完成后小鼠背部皮膚出現(xiàn)紅斑、滲出、結(jié)痂等典型皮損，說明成功建立AD小鼠模型。

Outside?inside是近年來比較認(rèn)可的關(guān)于AD發(fā)病機(jī)制的一種假說，Outside指基因、環(huán)境等因素造成皮膚屏障功能的破壞；inside指皮膚屏障功能受損，引起Th2細(xì)胞活化、細(xì)胞因子分泌增多等一系列超敏反應(yīng)［7］。各種因素導(dǎo)致皮膚屏障功能受損，致敏原通過受損皮膚屏障進(jìn)入機(jī)體，Th2細(xì)胞活化導(dǎo)致IL?4生成增多，誘導(dǎo)IgE產(chǎn)生；IL?4還可以抑制IFN?γ誘導(dǎo)皮膚轉(zhuǎn)錄，使IFN?γ對(duì)IgE合成的抑制作用減弱［8?9］。因此IgE、IL?4、IFN?γ是AD治療的重要靶點(diǎn)。我們用DNCB致敏BALB/C小鼠，構(gòu)建AD小鼠模型，并外用ESC治療，結(jié)果顯示，模型對(duì)照組小鼠血清IgE、IL?4水平升高，IFN?γ下降；模型小鼠經(jīng)ESC治療后，血清IgE、IL?4水平下降，IFN?γ水平升高，說明ESC可降低AD模型組小鼠IgE、IL?4水平，升高IFN?γ水平。

AQP在維持皮膚的水合平衡中有重要意義［10］，AQP3表達(dá)異常是AD的病理機(jī)制［11］之一。健康小鼠皮膚AQP3主要定位于基底層及皮膚附屬器。AD患者AQP3棘層表達(dá)增加［12］。本研究中，AQP3在空白組小鼠僅表達(dá)在基底層；治療28 d后，模型對(duì)照組基底層及棘層AQP3表達(dá)增加，ESC組AQP3表達(dá)恢復(fù)到基底層，棘層極少，說明ESC可調(diào)控AQP3表達(dá)。

圖3 治療28 d時(shí)小鼠皮膚水通道蛋白3和Toll樣受體2、4表達(dá)變化（雙花扁豆凝集素×200）

表2 各組小鼠血清中白細(xì)胞介素4（IL?4）、IgE、干擾素γ（IFN?γ）水平比較（± s，ng/L）

表2 各組小鼠血清中白細(xì)胞介素4（IL?4）、IgE、干擾素γ（IFN?γ）水平比較（± s，ng/L）

注：n=8。a與空白組比較，P＜0.05；b與模型對(duì)照組比較，P＜0.05

組別空白組模型組模型對(duì)照組薏苡仁提取物組基質(zhì)組IgE 5.81±1.30 9.06±0.99a 11.30±0.51 6.800±1.25b 10.64±0.12 IL?4 62.12±13.02 96.86±1.82a 98.34±9.03 53.81±4.17b 91.95±5.68 IFN?γ 64.11±6.15 42.20±6.45a 43.65±1.87 70.18±10.94b 44.93±1.20

TLR是近年來發(fā)現(xiàn)的一類重要的模式識(shí)別受體［13］。TLR可識(shí)別微生物高度保守成分即病原體相關(guān)分子模式（pathogen?associated molecular pattern，PAMP），通過激活NF?kB信號(hào)通路介導(dǎo)天然免疫及炎癥反應(yīng)［14］。TLR2和TLR4受體幾乎存在于所有的病原微生物中，兩者細(xì)胞定位不同，其中TLR2識(shí)別革蘭陽性細(xì)菌的肽聚糖及真菌的甘露聚糖，TLR4識(shí)別革蘭陰性細(xì)菌的脂多糖（LPS），刺激肥大細(xì)胞通過產(chǎn)生細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)，都與AD的發(fā)生密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，角質(zhì)形成細(xì)胞不但是構(gòu)成皮膚屏障的結(jié)構(gòu)細(xì)胞，還是參與皮膚天然免疫的重要細(xì)胞［4］，角質(zhì)形成細(xì)胞誘導(dǎo)性過度表達(dá)TLR2和TLR4形成的天然免疫與AD的炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究中治療28 d時(shí)，模型對(duì)照組小鼠TLR2和TLR4在表皮全層角質(zhì)形成細(xì)胞膜及胞質(zhì)過度表達(dá)，以細(xì)胞膜為主，而ESC組TLR2和TLR4表達(dá)下降，說明薏苡仁提取物可降低TLR2和TLR4表達(dá)，抑制AD的免疫反應(yīng)。

綜上，本研究中ESC明顯減輕AD模型小鼠耳部腫脹、改善皮膚炎癥反應(yīng)程度，同時(shí)降低血清IgE、IL?4水平，升高IFN?γ水平，調(diào)節(jié)皮膚AQP3、TLR2和TLR4的表達(dá)。提示ESC對(duì)AD模型小鼠有良好治療效果，可能是通過調(diào)節(jié)血清IgE、IL?4及IFN?γ等炎癥因子水平和影響AQP3、TLR2和TLR4的表達(dá)、抑制免疫反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。本研究為AD治療提供了新策略。