過表達SOX7對膽囊癌GBC-SD細胞增殖生物學特性的影響及其機制研究

陳兆紅 何迎盈 張友才 魯丁瑜

膽囊癌是最常見的膽道系統(tǒng)惡性腫瘤之一，具有早期診斷困難，惡性程度高，同時預(yù)后極差的特點[1]。盡管新的針對膽囊癌治療的手段和方案在不斷的更新改進，但治療效果卻并不理想。膽囊癌患者的預(yù)后并未得到顯著改善，其5年生存率始終低于5%。所以探尋新的治療靶點，總結(jié)有效治療方法顯得尤為重要。

SOX7屬于SRY相關(guān)基因家族。該家族能夠編碼一系列重要的轉(zhuǎn)錄因子，其共同特點是具有一個保守的HMG-box DNA結(jié)合域。近年來，有研究表明，SOX7(Sex determining region Y-box 7)基因的表達異常參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[2-4]。但是，SOX7基因與膽囊癌的關(guān)系以及該基因是否影響膽囊癌細胞生物學特性還未見報道。本實驗采用特異性的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染膽囊癌細胞，挑選穩(wěn)定過表達SOX7基因的GBC-SD細胞作為實驗對象，檢測該細胞增殖、凋亡情況，并進一步探索其可能牽涉的細胞信號通路，探索膽囊癌的治療新靶點，為膽囊癌的治療提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 膽囊癌GBC-SD細胞系

膽囊癌GBC-SD細胞系購于美國ATCC(American type culture collection)。RPIM-1640(Hyclone公司)作為細胞培養(yǎng)基，其中添加有10%胎牛血清、青霉素100 IU/mL和鏈霉素100 IU/mL。

1.2 儀器和試劑

酶標儀購于美國Thermo公司；熒光顯微鏡購于美國FAS scan公司；Edu細胞增殖試劑盒、Hoechst 33342細胞凋亡試劑盒購于聯(lián)科生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購于日本東仁化工公司；蛋白抗體Akt、p-Akt、PTEN及β-actin購自于美國Santa cruz公司。

1.3 實驗與方法

1.3.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與篩選 從上海生工有限公司購得重組質(zhì)粒pcDNA3.1-SOX7及其陰性空載體pc-DNA3.1-mock。取對數(shù)生長的GBC-SD細胞接種于24孔板中。待細胞長至80%融合時，每孔按照質(zhì)粒與脂質(zhì)體體積為1∶2.5加入1 mL無血清培養(yǎng)基中共培養(yǎng)8 h，之后將培養(yǎng)基更換為含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止反應(yīng)。之后將細胞以1∶3的比例分孔繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后用添加了600 μg/mL的G418培養(yǎng)基對細胞進行穩(wěn)定篩選。2周之后，挑選生長良好的細胞克隆進行擴增。以pc-DNA3.1-mock轉(zhuǎn)染的細胞作為對照組，以pcDNA3.1-SOX7轉(zhuǎn)染的細胞作為實驗組參與后續(xù)功能實驗。

1.3.2 細胞活性檢測 將GBC-SD細胞制備成混懸液，并以1×104個/孔的密度接種于96孔板。孵育72 h后用100 μL的細胞培養(yǎng)基RPIM-1640與10 μL的CCK-8試劑混勻，加入各孔之中。再將96孔板置于37℃細胞培養(yǎng)箱孵育1 h后，采用酶標儀測定光密度(OD)值，設(shè)定激發(fā)波長為450 nm。

1.3.3 Real-time PCR檢測 取對數(shù)生長期的GBC-SD細胞，用Trizol法提取總RNA。按cDNA反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Takara公司)產(chǎn)品說明書進行操作。將2 μg的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以此為模板進行擴增。SOX7序列：上游：5′-CAAGATGCTGGGAAAGTCGT-3′，下游：5′-CCGGTACTTGTAGTTGGGGTAGT-3′。內(nèi)參GAPDH序列：上游：5′-AGCCTCAAGATCATCAGCAAT-3′，下游：5′-TGTGGTCATGAGTCCTTCCACG-3′。引物購自上海生工有限公司。反應(yīng)體系總體積20 μL，其中模板cDNA為1.5 μL，上下游引物分別為1 μL，SYBR混合物10 μL，無菌蒸餾水1.5 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，然后95℃預(yù)變性10 s，緊接著60℃退火30 s。再于70℃延伸30 s。以GAPDH作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析。

1.3.4 Hoechst 33342細胞染色 將已制備好的細胞爬片用PBS浸洗三次，然后于4%多聚甲醛固定1 h。PBS清洗三遍，將玻片浸泡在裝有Hoechst33342染液的染色缸中，避光10 min；在340 nm的激發(fā)光下觀察：熒光顯微鏡(×100)下，隨機選取5個視野計數(shù)?；罴毎蕪浬⒕鶆驘晒猓蛲黾毎嘶蚣毎|(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀熒光。如果見到3個或3個以上的DNA熒光碎片被認為是凋亡細胞。

1.3.5 Edu細胞熒光染色法 處于對數(shù)生長的GBC-SD細胞，以每孔300個活細胞接種于96孔板中，置于細胞孵箱中48 h。用細胞培養(yǎng)基1 000∶1的比例稀釋Edu溶液，制備適量50 μM的Edu培養(yǎng)基，每孔加入100 μL稀釋后的Edu，孵育1 h，棄去培養(yǎng)基，之后用PBS清洗細胞2次，每次5 min，每孔加入100 μL 4%多聚甲醛的室溫孵育30 min之后每孔加入2 mg/mL甘氨酸，脫色搖床孵育5 min，棄甘氨酸溶液；PBS清洗5 min，0.5% Triton X-100破膜10 min；PBS清洗1次。DAPI染色完成后，熒光顯微鏡觀察。以上所有實驗均重復(fù)三次，每組設(shè)置三個復(fù)孔，熒光顯微鏡(×100)下隨機取五個視野，計數(shù)總細胞數(shù)及Edu染色陽性細胞個數(shù)，相對細胞增殖比例=(Edu染色陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù))/(對照組Edu染色陽性細胞數(shù)/對照組總細胞數(shù))。所有實驗重復(fù)三次。

1.3.6 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗 將細胞用RIPA裂解，制作細胞裂解液。等量蛋白采用12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后電轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯膜上，室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入特異性一抗，然后4℃過夜孵育。TBST洗膜3次，每次5 min，室溫下孵育1 h，采用ECL化學發(fā)光和曝光顯影。其中β-actin、GAPDH、SOX7、PTEN、Akt及p-Akt的濃度分別是：1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶3 000。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 過表達SOX7基因影響GBC-SD細胞的活性

Real-time PCR檢測結(jié)果表明，對照組SOX7基因在mRNA水平的表達量為(100.0±2.3)%，而實驗組SOX7 mRNA的相對達量為(353.0±28.1)%，差異具有統(tǒng)計學意義(t=15.54，P<0.001)(圖1A)。將穩(wěn)定過表達SOX7基因的細胞制備成混懸液，分別接種到96孔板中，定期測量細胞活性。72 h后，對照組的細胞在450 nm激發(fā)光下吸光度值為(4.6±0.4)，而實驗吸光度值為(2.4±0.2)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.021)(圖1B)。

圖1 過表達SOX7基因?qū)BC-SD細胞活性的影響Figure 1 Effects of SOX7 overexpression on the mRNA expression and cell viability of GBC-SD cells

2.2 過表達SOX7影響GBC-SD細胞的增殖、凋亡

將對照組和實驗組細胞分別接種到96孔板中，48 h后采用Edu免疫熒光染色觀察結(jié)果。實驗表明，對照組細胞增殖比例為(33.3±3.4)%，實驗組細胞增殖比例為(12.2±4.2)%，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.76，P=0.0025)(圖2)。同時，Hoechst 33342細胞凋亡熒光染色結(jié)果表明，對照組細胞凋亡比例為(5.2±1.3)%，實驗組細胞凋亡比例為(10.2±2.4)%，實驗組的細胞凋亡比例高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(t=3.17，P=0.0338)(圖3)。

2.3 過表達SOX7基因?qū)BC-SD細胞PTEN/Akt信號通路的影響

分別收集實驗組和對照組細胞總蛋白，采用Western blot檢測PTEN、Akt及p-Akt蛋白的表達。PTEN蛋白在對照組中的相對表達量為(0.2±0.02)，而在實驗組中為(0.7±0.04)，差異具有統(tǒng)計學意義(t=19.36，P=0.0001。對照組中Akt蛋白的相對表達量為(0.6±0.01)，實驗組為(0.6±0.03)，差異無統(tǒng)計學意義(t=0，P=0.2)。p-Akt蛋白在對照組中的相對表達量為(0.8±0.03)，在實驗組中的表達為(0.4±0.02)，差異具有統(tǒng)計學意義(t=19.2，P<0.0001)(圖4)。

圖2 過表達SOX7對GBC-SD細胞增殖的影響Figure 2 Effects of SOX7 overexpression on cell proliferation of GBC-SD cells

圖3 過表達SOX7對GBC-SD細胞凋亡的影響Figure 3 Effects of SOX7 overexpression on cell apoptosis of GBC-SD cells

圖4 SOX7過表達對GBC-SD細胞PTEN/Akt通路相關(guān)蛋白表達的影響Figure 4 Effects of SOX7 overexpression on PTEN/Akt signal pathways of GBC-SD cells

3 討論

SOX(SRY related high mobility group box)家族的共同特征是具有一類高保守的HMG結(jié)構(gòu)域，該家族編碼的蛋白廣泛參與機體眾多生理過程，如性別決定、調(diào)節(jié)胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、軟骨形成、血細胞生成、晶狀體的發(fā)育等多臟器的分化。研究表明，該家族不僅參與人體正常生理過程，同時在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中也起到重要作用[5]。其中，SOX7是SOX基因家族的一個重要成員。有研究表明，SOX7基因的異常表達與口腔癌關(guān)系密切，在口腔鱗狀上皮癌組織中的表達低于癌旁的正常組織，抑制SOX7基因的表達，明顯增強口腔鱗狀上皮癌細胞的增殖，促進轉(zhuǎn)移[3]。同樣，在乳腺癌組織中SOX7基因表達低于正常組織，與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展呈負相關(guān)[6]。在卵巢癌中，SOX7在進展期腫瘤中的表達明顯降低[7]。

SOX7基因在上述腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用，但是SOX7與膽囊癌的關(guān)系目前尚未知曉。通過構(gòu)建SOX7過表達細胞株，本實驗結(jié)果證實過表達SOX7后膽囊癌GBC-SD細胞活性顯著下降。為了更進一步的了解其對細胞增殖和凋亡的影響，我們采用了Edu細胞熒光染色與Hoechst 33342細胞染色分別檢測細胞增殖和凋亡的情況。結(jié)果表明，過表達SOX7基因之后，GBC-SD細胞的增殖顯著被抑制，同時，細胞凋亡卻顯著增加。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相一致，證實在膽囊癌中，SOX7基因發(fā)揮抑癌基因功能。

在腫瘤細胞中，PTEN/Akt信號通路廣泛參與了細胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移等多個過程[8-10]。已有研究表明，SOX家族基因與PTEN信號通路的抑制有一定的關(guān)聯(lián)[6]。而有研究報道PTEN/Akt通路在膽囊癌細胞的增殖、凋亡中發(fā)揮重要作用[11-12]。據(jù)此，我們推測PTEN/Akt細胞信號通路可能參與SOX7對膽囊癌細胞生物學特性的影響。通過Western blot實驗，我們首次證實過表達SOX7促使GBC-SD細胞PTEN蛋白表達增加，降低Akt蛋白的磷酸化。上述結(jié)果說明，SOX7基因能夠通過調(diào)節(jié)PTEN/Akt信號通路影響膽囊癌細胞的生物學特性。

綜上所述，過表達SOX7能夠抑制膽囊癌細胞增殖，促進細胞凋亡，PTEN/Akt通路的抑制可能參與該過程。本研究的結(jié)果證明過表達SOX7基因能夠抑制膽囊癌細胞增殖，促進其凋亡，為膽囊癌的臨床治療提供參考。