椰心葉甲高毒力綠僵菌菌株篩選及分子鑒定

李 亞，黃貝芳，陳月銀，高 新，陳龍通，李錦鴻

（廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 湛江 524008）

椰心葉甲Brontispa longissima（Gesto）是熱帶地區(qū)的一種重要害蟲(chóng)，主要為害棕櫚科經(jīng)濟(jì)植物，如椰子Cocos nucifera、大王棕Roystonea regia、酒瓶椰子Hyophorbe lagenicaulis、檳榔Areca catechu、老人葵Washingtonia fi lifera、蒲葵Livistona chinensis、棕櫚Trachycarpus fortunei和魚(yú)尾葵Caryota ochlandra等，其中椰子是最主要的寄主植物［1-3］。由于椰心葉甲寄生性廣泛且破壞性強(qiáng)，我國(guó)在1992年將椰心葉甲列為植物檢疫二類危害性害蟲(chóng)［4］，其幼蟲(chóng)及成蟲(chóng)均群棲潛藏于卷折的心葉內(nèi)，沿箭葉葉軸縱向嚙食最幼嫩的心葉的表皮薄壁組織，在葉上留下與葉脈平行、褐色至深褐色的狹長(zhǎng)條紋，嚴(yán)重時(shí)可造成樹(shù)勢(shì)衰敗甚至整個(gè)植株死亡，嚴(yán)重制約了棕櫚科經(jīng)濟(jì)作物和苗木培育產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［5］。目前對(duì)椰心葉甲的防控多以化學(xué)農(nóng)藥防治為主，即對(duì)葉面進(jìn)行噴藥防治，盡管使用化學(xué)農(nóng)藥可取得較快的效果，但長(zhǎng)期依賴化學(xué)農(nóng)藥防治椰心葉甲，容易引起抗藥性問(wèn)題，農(nóng)藥大量使用既造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，又給人們的健康構(gòu)成極大威脅［6］。因此，開(kāi)發(fā)低毒、高效、無(wú)殘留、無(wú)公害和易生產(chǎn)的生物農(nóng)藥用來(lái)控制椰心葉甲的發(fā)生是當(dāng)前迫切需要的。

綠僵菌Metarhiziumspp.是一類廣譜性昆蟲(chóng)病原真菌，由于其寄生物種多、致病力強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)、致病周期短、靶標(biāo)性強(qiáng)、對(duì)人類和牲畜不會(huì)造成毒害以及環(huán)境友好的特點(diǎn)，目前在森林、農(nóng)作物以及公共衛(wèi)生害蟲(chóng)防控方面都進(jìn)行了應(yīng)用效果的評(píng)估［7-8］，如利用綠僵菌生防制劑成功防控華北大黑鰓金龜［9］、樟巢螟［8］、黃曲條跳甲［10］、二斑葉螨［11］等害蟲(chóng)，但目前利用該菌防控椰心葉甲的報(bào)道較少。本研究對(duì)受害椰心葉甲中具有高毒力的綠僵菌菌株進(jìn)行篩選和分子生物學(xué)鑒定，以期獲得高毒力綠僵菌菌株，旨在提供優(yōu)良菌株用于開(kāi)發(fā)防治棕櫚科植物蟲(chóng)害的菌劑，為椰心葉甲的生物防控提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

SDAY培養(yǎng)基：酵母浸出粉10 g，葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，加蒸餾水至1 000 mL；PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂1.7%，加蒸餾水至1 000 mL；PPDA培養(yǎng)基：在PDA 培養(yǎng)基中加入1%的蛋白胨。

供試蟲(chóng)源采自海南省海口市椰子樹(shù)上，在室溫下用新鮮椰子心葉飼養(yǎng)1個(gè)月，待種群穩(wěn)定后選取各蟲(chóng)態(tài)的健康蟲(chóng)體進(jìn)行試驗(yàn)。進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)取健康蟲(chóng)體放入養(yǎng)蟲(chóng)盒中,并用新鮮椰子心葉飼養(yǎng)、備試，飼養(yǎng)溫度為 26～ 28℃ , 濕度為 70%～ 80%；經(jīng)人工飼養(yǎng)后分別挑選健康的、大小一致的成蟲(chóng)和齡期相同的幼蟲(chóng)進(jìn)行試驗(yàn)。參照周榮等［3］的方法，依據(jù)體長(zhǎng)和頭殼寬度，將幼蟲(chóng)分為2～3齡幼蟲(chóng)（體長(zhǎng)2.62～5.09 mm，頭寬0.53～0.91 mm）、四齡幼蟲(chóng)（體長(zhǎng)5.89～6.19 mm，頭寬1.15～1.19 mm）和五齡幼蟲(chóng)（體長(zhǎng)7.61～7.85 mm，頭寬1.30～ 1.32 mm）。

1.2 椰心葉甲僵蟲(chóng)來(lái)源及綠僵菌菌株分離純化

椰心葉甲僵蟲(chóng)采集地為發(fā)生椰心葉甲疫情嚴(yán)重的海南省各地，于2012—2016年從野外蟲(chóng)害發(fā)生嚴(yán)重地區(qū)采集自然感染蟲(chóng)生真菌的椰心葉甲僵蟲(chóng)并帶回實(shí)驗(yàn)室。

將椰心葉甲僵蟲(chóng)用70%乙醇消毒1 min，然后在0.1%氯化汞溶液中浸泡1 min，倒去氯化汞溶液后用無(wú)菌水沖洗；再挑取少許僵蟲(chóng)組織接種于SDAY培養(yǎng)基（分別加入終濃度為50 μg/mL的氯霉素和100 μg/mL的放線菌酮）平板上，將平板放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待蟲(chóng)體長(zhǎng)出菌落，從這些菌落中挑取少量菌絲體制片觀察，進(jìn)行初步鑒定。從鑒定為疑似綠僵菌的菌落邊緣挑取菌絲塊轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基平板繼續(xù)培養(yǎng)觀察，待培養(yǎng)至產(chǎn)生分生孢子時(shí)，取少量分生孢子粉用0.05% Tween 80溶液配成低濃度的孢子懸浮液，再用劃線培養(yǎng)法進(jìn)行純化。分別對(duì)純化的供試菌株進(jìn)行編號(hào)，其中HK1201、HK1202、HK1304菌株采自海南省海口市；LD1301、LD1302、LD1206菌株采自海南省樂(lè)東縣；DZ1307、DZ1401、DZ1403菌株采自海南省儋州市；DF1301、DF1303菌株采自海南省東方市；CM1501、CM1502、CM1601菌株采自海南省澄邁縣；WC1504、WC1603菌株采自海南省文昌市。

1.3 椰心葉甲高毒力綠僵菌菌株的篩選

將上述純化的菌株接種于PPDA培養(yǎng)基上，26℃下恒溫培養(yǎng)10 d，刮取孢子置于組織研磨器用含0.05% Tween 80的無(wú)菌水配制成濃度為1.0×108孢子/mL的懸浮液。取健康新鮮的椰子心葉，洗凈晾干后分別用上述純化的菌株的分生孢子懸浮液噴灑于椰子心葉上面至葉片濕潤(rùn)，晾干葉片后將其放入消毒養(yǎng)蟲(chóng)盒中，把選出的供試椰心葉甲成蟲(chóng)和四齡幼蟲(chóng)分別接至葉片上飼養(yǎng)，同時(shí)放置棉球保持濕度；對(duì)照為以噴灑0.05%的Tween 80滅菌水的椰子心葉飼養(yǎng)。試驗(yàn)設(shè)椰心葉甲成蟲(chóng)和四齡幼蟲(chóng)以及對(duì)照3個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)試蟲(chóng)20頭。處理后每天觀察1次，記錄死亡蟲(chóng)數(shù)，連續(xù)觀察15 d，記錄椰心葉甲死亡數(shù)量，計(jì)算死亡百分率。在觀察和記錄死亡蟲(chóng)數(shù)時(shí)，將死蟲(chóng)體揀出，置于預(yù)先放有若干濕棉球的無(wú)菌培養(yǎng)皿中進(jìn)行保濕培養(yǎng)，待蟲(chóng)體上長(zhǎng)出白色菌絲體和綠色孢子層時(shí)，挑取少量菌絲體制片，鏡檢觀察以確定蟲(chóng)體上長(zhǎng)出的菌是所接種的菌株。

1.4 高毒力綠僵菌菌株對(duì)椰心葉甲的致病力

選取上述試驗(yàn)中對(duì)椰心葉甲毒力較好的綠僵菌菌株，用含0.05% Tween 80的無(wú)菌水分別配制成含5.0×108、2.5×108、1.0×108、7.5×107、5.0×107孢子/mL的懸浮液，分別用上述試驗(yàn)方法對(duì)供試椰心葉甲四齡幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)進(jìn)行處理，對(duì)照用0.05% Tween 80無(wú)菌水處理供試椰心葉甲。根據(jù)各處理供試?yán)ハx(chóng)的死蟲(chóng)數(shù)，采用SPSS 11.0軟件對(duì)其進(jìn)行分析。綠僵菌對(duì)椰心葉甲的LT50計(jì)算根據(jù)線性回歸法進(jìn)行，其他數(shù)據(jù)的差異顯著性用ANOVA方差分析［12］。

1.5 高毒力綠僵菌菌株分子生物學(xué)鑒定

將上述試驗(yàn)中篩選到的高毒力綠僵菌菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)至產(chǎn)孢，分別收集孢子提取DNA作為PCR模板，依照Curran等［13］方法設(shè)計(jì)引物5’-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3’和5’-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3’，應(yīng)用PCR擴(kuò)增綠僵菌ITS序列，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)分析，利用MEGA4和ClustalX 1.8構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)椰心葉甲具有高毒力的綠僵菌菌株篩選

以濃度1.0×108孢子/mL懸浮液噴灑椰子心葉飼養(yǎng)的椰心葉甲成蟲(chóng)和四齡幼蟲(chóng)，供試的16株綠僵菌菌株對(duì)椰心葉甲成蟲(chóng)和四齡幼蟲(chóng)致病力的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出，供試菌株HK1304和CM1601對(duì)椰心葉甲的致病性較好，接菌后10 d椰心葉甲成蟲(chóng)和四齡幼蟲(chóng)死亡率均達(dá)到100%，其中CM1601菌株對(duì)成蟲(chóng)和四齡幼蟲(chóng)的LT50分別為4.1、3.9 d，HK1304菌株對(duì)成蟲(chóng)和四齡幼蟲(chóng)的LT50分別為4.4、4.2 d，因此取菌株CM1601和HK1304作為椰心葉甲高毒力株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

表1 不同分離株菌對(duì)椰心葉甲成蟲(chóng)和四齡幼蟲(chóng)的致病力

2.2 菌株CM1601和HK1304對(duì)椰心葉甲的致病力

用菌株CM1601和HK1304分別配制成5.0×107、7.5×107、1.0×108、2.5×108、5.0×108孢子/mL的孢子懸浮液噴灑葉片后測(cè)定對(duì)椰心葉甲的致病力，結(jié)果見(jiàn)圖l。從圖1可以看出，椰心葉甲四齡幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)的累計(jì)死亡率隨著菌株CM1601或HK1304孢子濃度的增加而上升。菌株CM1601在孢子濃度為1.0×108、2.5×108、5.0×108孢子/mL時(shí)對(duì)椰心葉甲四齡幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)致病力沒(méi)有顯著差異，但與濃度為5.0×107、7.5×107孢子/mL時(shí)有顯著差異（P=0.0387）；而菌株HK1304在孢子濃度為2.5×108孢子/mL、5.0×108孢子/mL時(shí)對(duì)椰心葉甲致病力沒(méi)有顯著差異，但與濃度為 5.0×107、7.5×107、1.0×108孢子/mL時(shí)有顯著差異（P=0.0274）。

2.3 菌株CM1601和HK1304的分子鑒定

對(duì)菌株CM1601和HK1304的rDNA-ITS序列測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)分析，結(jié)果（圖2）表明，菌株CM1601的rDNA-ITS序列（GenBank 收錄號(hào)：MH547100）與金龜子綠僵菌M. anisopliae的該序列相似性達(dá)100%，菌株HK1304的rDNA-ITS序列（GenBank 收錄號(hào)：MH547101）與金龜子綠僵菌蝗變種M. anisopliae var. acridum的該序列相似性達(dá)100%。將測(cè)得兩菌株的rDNA-ITS序列與Genbank中已有的其他種株該序列一起應(yīng)用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明菌株CM1601與金龜子綠僵菌聚在一起成為一個(gè)分支，菌株HK1304和金龜子綠僵菌蝗變種聚在一起成為分支。

圖1 菌株CM1601和HK1304對(duì)椰心葉甲的致病力

3 結(jié)論與討論

野外采集椰心葉甲僵蟲(chóng)是分離綠僵菌的第一步，選擇合適的采集地點(diǎn)和合理的采集時(shí)間是能否成功分離到綠僵菌的關(guān)鍵因素，通常需要選擇椰心葉甲為害嚴(yán)重的地方及溫濕度適宜的時(shí)間采集，這樣受綠僵菌感染死亡的蟲(chóng)體出現(xiàn)的幾率相對(duì)較大［14］。本研究采集椰心葉甲僵蟲(chóng)的地點(diǎn)主要選擇?？凇①僦?、樂(lè)東、東方、澄邁和文昌等椰心葉甲為害嚴(yán)重的地區(qū)，選擇采集僵蟲(chóng)的時(shí)間是雨后2～3 d，因?yàn)橛旰蟓h(huán)境濕度的增加，有利于自然環(huán)境中的綠僵菌感染椰心葉甲，也有利于感染的僵蟲(chóng)體上長(zhǎng)出菌絲體后易于判斷。本研究挑選長(zhǎng)出菌絲體的椰心葉甲僵蟲(chóng)分離綠僵菌，結(jié)果從采集的僵蟲(chóng)中分離到16株不同地理來(lái)源的疑似綠僵菌菌株。

圖2 基于菌株CM1601和HK1304的rDNA-ITS序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)

昆蟲(chóng)病原真菌是昆蟲(chóng)病原微生物中最大的類群之一，是有害昆蟲(chóng)生物控制的潛力生物資源，而其對(duì)有害昆蟲(chóng)致病力強(qiáng)弱是衡量昆蟲(chóng)病原真菌生防潛力的重要指標(biāo)［15］。本研究測(cè)定16株疑似綠僵菌菌株對(duì)椰心葉甲成蟲(chóng)和四齡幼蟲(chóng)的致病力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1.0×108/mL孢子/mL濃度處理不同菌株對(duì)椰心葉甲的毒力差異較大，其對(duì)成蟲(chóng)和四齡幼蟲(chóng)的累計(jì)死亡率范圍分別為70.29%～98.18%和73.25%～100%。從中篩選得到2株高致病力菌株CM1601和HK1304。用不同濃度的孢子對(duì)椰心葉甲進(jìn)行詳細(xì)的毒力測(cè)定，結(jié)果顯示，椰心葉甲四齡幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)的累計(jì)死亡率隨著菌株孢子濃度的增加而上升，但當(dāng)CM1601菌株濃度上升到1.0×108孢子/mL或HK1304菌株濃度上升到2.5×108孢子/mL，菌株對(duì)椰心葉甲的致病力達(dá)到峰值，再增加孢子濃度不會(huì)增加其致病力，表明如果菌株CM1601和HK1304作為生防菌用于防治椰心葉甲，其噴灑葉片的最適孢子濃度分別為1.0×108孢子/mL和2.5×108孢子/mL。椰心葉甲1齡幼蟲(chóng)蟲(chóng)體很小，發(fā)育歷期短，且噴菌后自然死亡率很高，所以本試驗(yàn)剔除了1 齡幼蟲(chóng)；2～3齡幼蟲(chóng)在噴菌后還會(huì)繼續(xù)蛻皮，而幼蟲(chóng)的蛻皮對(duì)蟲(chóng)生真菌感染幼蟲(chóng)有一定的抵御作用，因此用2～3齡幼蟲(chóng)測(cè)定綠僵菌毒力與實(shí)踐中有較大誤差；4～5齡幼蟲(chóng)對(duì)綠僵菌具有較好的敏感性，作為綠僵菌毒力測(cè)試的試驗(yàn)蟲(chóng)體較為合適；此外，成蟲(chóng)是評(píng)價(jià)綠僵菌毒力強(qiáng)弱的指標(biāo)之一［16-17］。因此，本研究選用4幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)成為綠僵菌毒力試驗(yàn)的測(cè)試蟲(chóng)體，用于評(píng)價(jià)不同菌株對(duì)椰心葉甲致病力強(qiáng)弱。

Weiland等［18］利用分子生物學(xué)方法對(duì)綠僵菌屬真菌分類進(jìn)行了系統(tǒng)研究，測(cè)定了100 余株綠僵菌屬菌株的ITS序列，發(fā)現(xiàn)用該序列進(jìn)行比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析可以作為綠僵菌屬菌株分類的可靠依據(jù)。例如，申劍飛等［19］通過(guò)對(duì)綠僵菌屬菌株的ITS1-5.8S、rRNA-ITS2 區(qū)域進(jìn)行序列克隆和比對(duì)分析，分別鑒定了平沙綠僵菌M.pingshaense和貴州綠僵菌M. guizhouense。本研究通過(guò)對(duì)綠僵菌ITS序列和建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分析，鑒定菌株CM1601和HK1304分別為金龜子綠僵菌和金龜子綠僵菌蝗變種。篩選出2株毒力較高的綠僵菌屬菌株CM1601和HK1304在毒力試驗(yàn)中與其他菌株相比較有明顯的差異性，但在野外防治椰心葉甲的潛力如何，還有待進(jìn)一步的大田試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

利用綠僵菌生防制劑作為生物農(nóng)藥防控椰心葉甲是未來(lái)該害蟲(chóng)生物防治的發(fā)展方向，因此分離鑒定對(duì)椰心葉甲成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)具有高致病力的綠僵菌菌株具有重要的價(jià)值和較大的應(yīng)用潛能。本研究在椰心葉甲為害嚴(yán)重的地區(qū)及溫濕度適宜的時(shí)間采集椰心葉甲僵蟲(chóng)，從長(zhǎng)出菌絲體的僵蟲(chóng)上分離到綠僵菌16株疑似綠僵菌。用椰心葉甲成蟲(chóng)和4齡幼蟲(chóng)作為試驗(yàn)對(duì)象對(duì)上述分離的疑似綠僵菌菌株進(jìn)行致病力測(cè)定，發(fā)現(xiàn)用濃度1.0×108孢子/mL的懸浮液噴灑椰心葉甲取食的椰子心葉后均能對(duì)椰心葉甲致病，其中菌株CM1601和HK1304對(duì)椰心葉甲成蟲(chóng)和4齡幼蟲(chóng)致病力最高，其LT50均在4.5 d以下，表明其對(duì)椰心葉甲具有高毒力，可以作為昆蟲(chóng)病原真菌在實(shí)際生產(chǎn)中防控椰心葉甲。進(jìn)一步用菌株CM1601和HK1304分別配制成梯度濃度的孢子懸浮液噴灑葉片后測(cè)定對(duì)椰心葉甲的致病力，表明椰心葉甲的累計(jì)死亡率隨著孢子濃度的增加而上升，菌株CM1601和HK1304作為生防菌用于防治椰心葉甲最佳濃度為1.0×108、2.5×108孢子/mL。通過(guò)ITS序列測(cè)定及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，鑒定菌株CM1601和HK1304分別為金龜子綠僵菌和金龜子綠僵菌蝗變種。本研究分離的金龜子綠僵菌CM1601和金龜子綠僵菌蝗變種HK1304均對(duì)椰心葉甲成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)具有較強(qiáng)的致病力，是具有潛在應(yīng)用價(jià)值的優(yōu)良菌株，在后續(xù)研究中還應(yīng)進(jìn)一步深入研究生態(tài)環(huán)境因子與綠僵菌毒力之間的關(guān)系，明確綠僵菌對(duì)椰心葉甲的致毒機(jī)理，為綠僵菌作為有害昆蟲(chóng)椰心葉甲生物控制的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。