除臭微生物單株及混合培養(yǎng)對生物量的影響

許麗娟，王 震，吳迎奔，陳 薇，尹紅梅，劉惠知

（湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009）

隨著城市化進程的加快、城市人口的高度集中，其生活垃圾也日益增多，我國人均年產(chǎn)垃圾量為450 kg左右，并且每年以不低于8%的速度增加［1］。且生活垃圾成分復雜，含有多種易于腐爛的有機物，這些有機物在堆放、轉(zhuǎn)運處理過程中會產(chǎn)生大量惡臭物質(zhì)，對周邊的環(huán)境造成極大危害，同時也嚴重威脅著周邊居民的身體健康［2］。

垃圾惡臭污染的產(chǎn)生是一個復雜的生化反應過程，且惡臭成分復雜，決不是一種有效菌就能夠徹底去除的。同時，每種微生物轉(zhuǎn)化、利用惡臭物質(zhì)的能力也有差異，要有效抑制惡臭物質(zhì)的產(chǎn)生，或者將產(chǎn)生的硫化氫等臭氣物質(zhì)盡快氧化成無臭物質(zhì)，必須要有幾種或多種微生物共同作用，形成優(yōu)勢混合菌群［3］。而微生物之間存在著協(xié)同、競爭、拮抗、捕食等作用，探討其具體關(guān)系有助于進一步開發(fā)微生物復合菌劑［4］，且據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，通過微生物的混合培養(yǎng)能使其生物量與生物代謝功能得到顯著提高。因此，微生物的混合培養(yǎng)及其協(xié)同作用也越來越受到人們的關(guān)注［5］。

本試驗將前期分離純化所得的除臭微生物（釀酒酵母和干酪乳桿菌）分別研究了單獨培養(yǎng)條件和混合培養(yǎng)條件，并對兩種方法培養(yǎng)出的活菌數(shù)進行比較，試圖了解它們相互作用的效果，以期為菌種的混合培養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌種：干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），均為本實驗室從垃圾填埋場分離篩選出的除臭微生物。

培養(yǎng)基：（1）MRS培養(yǎng)基：葡萄糖 2.0%，蛋白胨 1.0%，酵母膏0.5%，牛肉膏1.0%，無水乙酸鈉0.5%，檸檬酸氫二銨0.2%，K2HPO40.2%，MgSO40.058%， 硫 酸 錳 0.025%，pH 6.2～6.6。用于培養(yǎng)干酪乳桿菌。（2）PDA培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g，酵母膏10.0 g，蛋白胨10.0 g，蒸餾水1 L。用于培養(yǎng)釀酒酵母。（3）兩種菌株的混合培養(yǎng)用MRS培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1 釀酒酵母培養(yǎng)條件的優(yōu)化 （1）培養(yǎng)溫度：將釀酒酵母按1%接種量接于裝有100 mL PDA培養(yǎng)基裝量為500 mL的三角瓶中，分別置于20、25、30、35、40℃ 5個不同溫度，轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床培養(yǎng)24 h，計數(shù)活菌數(shù)。

（2）初始pH：調(diào)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，按1%的接種量進行接種，最佳溫度、180 r/min培養(yǎng)24 h，計數(shù)活菌數(shù)。

（3）接種量：在獲得最佳初始pH和培養(yǎng)溫度后，分別按1%、2%、3%、4%、5%的接種量進行接種，最佳溫度、180 r/min培養(yǎng)24 h，計數(shù)活菌數(shù)。

1.2.2 干酪乳桿菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化 （1）培養(yǎng)溫度的選擇：將干酪乳桿菌按5%接種量接于裝有200 mL MRS培養(yǎng)基容量為500 mL的三角瓶中，分別置于30、35、40、45、50℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，計數(shù)活菌數(shù)。

（2）初始pH的選擇：將干酪乳桿菌按5%接種量接于裝有200 mL MRS培養(yǎng)基、容量為500 mL的三角瓶中，將MRS培養(yǎng)基的pH分別調(diào)為4、5、6、7、8，置于35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，計數(shù)活菌數(shù)。

（3）接種量的選擇：將干酪乳桿菌分別按1%、3%、5%、7%、9%接種量接于裝有200 mL MRS培養(yǎng)基、容量為500 mL的三角瓶中，起始pH值為 6，置于35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，計數(shù)活菌數(shù)。

1.2.3 拮抗試驗 將干酪乳桿菌稀釋后取1mL稀釋液于滅菌的平皿中，倒入MRS培養(yǎng)基混勻待凝固后，再將釀酒酵母接于凝固的平板上，將平板倒置于35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 d后觀察實驗結(jié)果，判斷各自間有無抑制情況。若兩兩交叉點的菌株不生長或生長比較差，說明各菌間有拮抗作用；若兩兩交叉菌株生長良好，則說明各菌株可以共存、相互之間沒有拮抗作用，不發(fā)生拮抗反應的各菌株可以混合培養(yǎng)。

1.2.4 混合培養(yǎng)對各菌生物量的影響 （1）培養(yǎng)溫度：將釀酒酵母和干酪乳桿菌分別按單獨培養(yǎng)時的最適接種量同時接入裝有200 mL MRS培養(yǎng)基、容量為500 mL的三角瓶中，起始pH值為 6，分別置于30、35、40℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，計數(shù)活菌數(shù)。

（2）初始pH：將釀酒酵母和干酪乳桿菌分別按單獨培養(yǎng)時的最適接種量同時接入裝有200 mL MRS培養(yǎng)基、容量為500 mL的三角瓶中，將MRS培養(yǎng)基的pH分別調(diào)為5、6、7，置于35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，計數(shù)活菌數(shù)。

1.2.5 酵母菌和乳酸菌的計數(shù) 酵母菌計數(shù)用采用平皿稀釋涂布計數(shù)法，乳酸菌采用傾注法［6］。

1.2.6 大鼠急性毒性試驗 試驗前對大鼠進行7 d喂養(yǎng)觀察，淘汰自然死亡大鼠。正式試驗時把健康大鼠隨機分為2組，每組體重為180～220 g，雌雄各10只。采用最大耐受劑量法，取混合菌劑給大鼠一次性經(jīng)口灌胃，每100 g灌胃體積為2 mL，測比重為0.982 g/mL，折合劑量為19.64 g/kg，灌胃后連續(xù)14 d觀察大鼠是否有中毒和死亡現(xiàn)象。試驗期間大鼠自由進食和飲水。試驗結(jié)束后，統(tǒng)計小鼠死亡數(shù)，計算半數(shù)致死量（LD50）及95%的可信限，并按《食品安全性毒理學評價程序》（GB19153.1-2003）急性毒性劑量分級標準對試驗結(jié)果進行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.1.1 培養(yǎng)溫度 不同溫度對釀酒酵母生長影響的結(jié)果見表1，從表1可以看出，該酵母在25～35℃內(nèi)生長良好，菌體數(shù)也較高，在30℃時菌體數(shù)達到最大，為1.14×108CFU/mL。低于或高于該溫度范圍，菌體長勢差，菌體數(shù)低，這可能是溫度較低時微生物生長緩慢、代謝活性差，因此菌體量少。高溫時，菌體代謝活動受到抑制，影響菌株的生長和繁殖，導致菌量少。因此，該菌株的最佳生長溫度為30℃。

2.1.2 初始pH 由表1可知，當培養(yǎng)基初始pH為7時，菌株長勢差，菌體數(shù)僅為0.63×108CFU/mL；而初始pH為5時，菌體生長好，活菌數(shù)達1.19×108CFU/mL；初始pH在3～4時，菌體生長依然旺盛，菌體數(shù)也高，說明該菌株在低pH值下也能很好地生長。

2.1.3 接種量 獲得最佳培養(yǎng)溫度及最佳初始pH值后，對菌株分別采用5個接種量（1%、2%、3%、4%、5%），180 r/min培養(yǎng)24 h，測定結(jié)果見表1，接種量為1%和2%時，菌體數(shù)相當，但隨著接種量的加大，活菌數(shù)出現(xiàn)下降趨勢。這可能是由于接種量加大，菌體生長過快，影響溶氧，衰老細胞增加，從而使活菌數(shù)降低。考慮到發(fā)酵成本，在后續(xù)試驗中選擇1%的接種量。

表1 釀酒酵母培養(yǎng)條件研究

2.2 干酪乳桿菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 培養(yǎng)溫度 培養(yǎng)溫度對干酪乳桿菌活菌數(shù)的影響如表2所示，培養(yǎng)溫度為35℃、40℃時，菌體生長良好，當培養(yǎng)溫度達50℃時，該菌基本不生長。

2.2.2 初始pH 不同起始pH的試驗結(jié)果表明，pH在6時，乳酸菌的活菌數(shù)最大，達29.12×108CFU/mL。

2.2.3 接種量 接種量對干酪乳桿菌活菌數(shù)的影響結(jié)果（表2）表明，接種量為1%時，菌體生長緩慢，但隨著接種量的加大，活菌數(shù)明顯增加。當接種量為9%時，菌體數(shù)沒有明顯變化，但試驗過程中發(fā)現(xiàn)隨著接種量的加大，可縮短菌體培養(yǎng)時間。

表2 干酪乳桿菌培養(yǎng)條件研究

2.3 拮抗試驗

拮抗試驗是鑒定菌株間能否共存的方法，釀酒酵母和干酪乳桿菌的拮抗試驗表明它們之間無拮抗反應發(fā)生，各菌種可以混合培養(yǎng)。

2.4 混合培養(yǎng)對各菌生物量的影響

2.4.1 培養(yǎng)溫度 釀酒酵母和干酪乳桿菌都有各自的最適生長溫度，我們研究了混合培養(yǎng)時兩菌共同的最適生長溫度，結(jié)果（圖1）表明，當培養(yǎng)溫度為30℃時，干酪乳桿菌長勢差；當培養(yǎng)溫度為40℃時，雖然干酪乳桿菌長勢好，但是釀酒酵母基本不生長；當混合培養(yǎng)溫度為35℃時，無論是兩者的單菌數(shù)還是總菌數(shù)表現(xiàn)為最高，因此混合培養(yǎng)溫度以35℃為佳。

圖1 培養(yǎng)溫度對釀酒酵母菌和干酪乳桿菌混合培養(yǎng)菌群生物量的影響

2.4.2 初始pH 兩菌混合培養(yǎng)的初始pH試驗結(jié)果（圖2）表明，培養(yǎng)基的起始pH為6是最佳的，無論是釀酒酵母菌還是干酪乳桿菌，其活菌數(shù)都是最高的，分別達1.69×108、34.04×108CFU/mL。

圖2 初始pH對釀酒酵母菌和干酪乳桿菌混合培養(yǎng)菌群生物量的影響

2.5 大鼠急性毒性試驗

灌胃后大鼠無明顯中毒表現(xiàn)，觀察14 d無死亡。觀察期末處死全部動物進行大體解剖，肝、腎、脾、胃、腸、心、肺等主要臟器未見肉眼可見的異常改變。MTD結(jié)果見表3，由表3可知，混合培養(yǎng)菌劑對雌、雄性大鼠的最大耐受劑量（MTD）均大于19.64 g/kg，根據(jù)GB15193.3-2003中的急性毒性分級標準，屬無毒級。

表3 混合培養(yǎng)菌劑對大鼠的經(jīng)口急性毒性試驗結(jié)果

3 結(jié)論與討論

微生物共培養(yǎng)技術(shù)也稱微生物混合培養(yǎng)或混合發(fā)酵，是指利用兩種或兩種以上的微生物同時或先后加入培養(yǎng)，進而有效提高資源利用率并獲得較高產(chǎn)量的發(fā)酵方法。與單一菌株發(fā)酵相比較，這種幾種微生物共同培養(yǎng)來完成純種微生物難以完成的生物反應過程，還可以讓共發(fā)酵獲得意外的效果［7］。在長期的生產(chǎn)實踐中，人們發(fā)現(xiàn)很多重要的生化過程僅僅依靠單個微生物菌株是不能完成或是只能微弱進行，而必須由兩種或多種微生物共同培養(yǎng)來完成的［8］。

前期研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母菌和干酪乳桿菌的生長習性相近，因此本研究采用混合培養(yǎng)，且將其與純種培養(yǎng)進行了比較研究。試驗結(jié)果表明，無論是釀酒酵母菌還是干酪乳桿菌，混合培養(yǎng)的活菌數(shù)都優(yōu)于單個純種發(fā)酵，且較單個純種發(fā)酵的活菌總數(shù)相比，混合培養(yǎng)方式的活菌總數(shù)提高了8.90%。這可能是酵母的生長產(chǎn)生了許多生長因子，如維生素、可溶性氮化合物等可供乳桿菌生長所需要，而乳酸菌創(chuàng)造的酸性環(huán)境對酵母菌的增殖有促進作用［9］。與單一菌種發(fā)酵相比，混合培養(yǎng)方式不但提高了活菌數(shù)，而且還減少了發(fā)酵后再混配的環(huán)節(jié)，減少了染菌幾率，有效地保證了菌劑質(zhì)量；而且混合培養(yǎng)還提高了原材料、設(shè)備和能源的利用率，從而降低菌劑的生產(chǎn)成本［10］?；旌暇鷦┑拇笫蠹毙远拘栽囼灡砻髟摼鷦┦前踩珶o毒的。

本研究中混合發(fā)酵試驗所用的培養(yǎng)基為乳酸菌用培養(yǎng)基，有可能影響釀酒酵母菌的生長，因此，還需要對混合發(fā)酵培養(yǎng)基的具體成分及含量作進一步探討優(yōu)化，同時混合培養(yǎng)時各菌之間的相互影響機制也有待進一步研究。