玉米雄穗發(fā)育早期耐旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)掘

吳永波，郝轉(zhuǎn)芳，王 楠，宋 潔，周躍恒，柳波娟，朱漢勇，邸 宏，王振華，李新海

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物科學(xué)研究所，北京 100081；3.文山州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，云南 文山 663000)

玉米(ZeamaysL.)作為重要的經(jīng)濟作物、飼料作物和工業(yè)原料，隨著社會經(jīng)濟發(fā)展對其需求量逐年上升[1-2]。干旱是影響玉米生長發(fā)育和產(chǎn)量的最主要非生物脅迫因素，全球氣候變暖趨勢加劇，對玉米生產(chǎn)影響日漸突出[3]。增強耐旱性是保證玉米穩(wěn)產(chǎn)的有效手段，然而，耐旱性是作物極難改良的性狀之一，其調(diào)控分子機制復(fù)雜，涉及基因眾多[4-5]。因此，不斷了解干旱脅迫應(yīng)答分子機制、發(fā)掘耐旱調(diào)控基因，對于改良玉米耐旱性、保持產(chǎn)量穩(wěn)定至關(guān)重要。玉米是典型的雌雄同株異花授粉植物，雄穗在生育過程中發(fā)揮重要作用；雄穗發(fā)育期新陳代謝活動劇烈，需水量較大[6]。干旱脅迫會引起雄穗生長遲緩且發(fā)育不良，從而導(dǎo)致花粉量減少和雌雄花期間隔(Anthesis and silking interval，ASI)延長，是導(dǎo)致玉米減產(chǎn)的重要因素。

耐旱性是受多個逆境基因表達和多條代謝通路共同調(diào)控的復(fù)雜數(shù)量性狀。一般而言，植物響應(yīng)干旱過程包括從信號感知到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，再到調(diào)節(jié)下游功能蛋白表達3個部分[7]。其中，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程連接著脅迫信號感知和應(yīng)答反應(yīng)，是耐旱調(diào)控的橋梁，在玉米耐旱調(diào)控中起到至關(guān)重要的作用。轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factors，TFs)通過與基因簇啟動子區(qū)相互作用，調(diào)控多種下游基因的表達，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑扮演重要的角色[8]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在擬南芥、水稻、小麥、玉米等作物中存在NAC、WRKY、MYB、bHLH、bZIP、AP2、DREB等多個調(diào)控作物耐旱相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族[9-12]。近年來，在玉米中證明了一些轉(zhuǎn)錄因子耐旱性功能，例如NAC111、SNAC1、bZIP72、WRKY58、WRKY33、ZmDREB2A等[13-18]。但是相對于水稻、擬南芥等作物來說，玉米中已知的耐旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子較少。

轉(zhuǎn)錄因子是一類響應(yīng)特定脅迫條件而差異表達的蛋白質(zhì)，遭受干旱脅迫后，響應(yīng)干旱脅迫的轉(zhuǎn)錄因子基因表達量會出現(xiàn)明顯變化。在轉(zhuǎn)錄組水平上檢測轉(zhuǎn)錄因子基因表達量的變化是研究轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)脅迫的重要手段。在轉(zhuǎn)錄組水平，發(fā)掘耐旱調(diào)控基因并預(yù)測耐旱調(diào)控機制方法很多，如SSH(Suppression subtractive hybridization)、ESTs(Expression sequence tags)cDNA microarrays等[19-26]。近年來，隨著高通量測序技術(shù)以及轉(zhuǎn)錄組研究的不斷發(fā)展和深入，RNA-Seq已經(jīng)成為研究復(fù)雜數(shù)量性狀的重要手段。通過RNA-Seq技術(shù)可以在全基因組水平上檢測基因表達譜。Wang等[27]采用RNA-Seq分析玉米株高調(diào)控相關(guān)基因。Zhao等[28]通過RNA-Seq方法在轉(zhuǎn)錄組水平上對抗莖腐病(Fusariumgraminearum)基因進行檢測。Li等[29]通過RNA-Seq技術(shù)分析玉米苗期葉片遭受干旱、高鹽、高溫、低溫等非生物脅迫前后轉(zhuǎn)錄組表達譜，發(fā)掘與非生物脅迫相關(guān)基因。

本研究通過RNA-Seq方法在轉(zhuǎn)錄組水平上對NAC、WRKY、MYB、bHLH、bZIP耐旱顯著相關(guān)的5個家族基因表達量進行分析；通過GO富集和功能注釋對差異表達基因進行功能分類，以篩選耐旱型材料以及干旱敏感型材料中響應(yīng)干旱脅迫的轉(zhuǎn)錄因子。

1 材料和方法

1.1 研究材料

本研究使用的耐旱型玉米自交系(Drought-tolerant line，DT)為鐵7922和X178；敏感型自交系(Drought-susceptible line，DS)為吉81162和丹340。自交系所屬類群和系譜如表1所示，材料耐旱性鑒定參見參考文獻[30]。4份玉米自交系材料均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。

表1 材料基本信息Tab.1 The information of maize inbred lines used in this study

注：耐旱性的評定是按照Hao 等[30]所述的選擇指數(shù)(SI)進行評價。選擇指數(shù)SI越高說明耐旱性越強。

Note：The evaluation of drought tolerance is according to the Hao et al selection index(SI). The higher the selection of the index SI，the stronger the drought tolerance.

1.2 玉米雄穗發(fā)育早期干旱脅迫處理及RNA-Seq分析

4份玉米自交系種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所溫室，盆栽處理，自然條件生長，每份自交系分別種植20盆。待自交系生長至雄穗發(fā)育前期，每份分別挑選出10株生長狀態(tài)良好、長勢一致的植株，其中，5株作干旱脅迫處理即停止?jié)菜?，另?株正常灌溉處理。處理5 d后，對干旱脅迫和正常灌溉下的土壤相對含水量、頂生葉葉綠素穩(wěn)態(tài)熒光值進行測定(德國Walz公司，Min-PAM)。剝?nèi)∮衩仔鬯霕悠罚?80 ℃保存。

提取樣品總RNA，使用IlluminaHiSeq 2000 Platform(Illumina，USA)對4份自交系2種水分條件下8個雄穗樣品進行RNA-Seq分析。采用規(guī)范化RPKM法(每百萬Reads中來自于某基因每千堿基的Reads數(shù))量化基因表達水平，獲得4份自交系2種水分處理，共8個樣品基因表達譜[31]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與GO功能分析

自Plant TFDB網(wǎng)站(http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)獲取NAC、WRKY、MYB、bHLH、bZIP 共5個轉(zhuǎn)錄因子家族基因的基本信息，分別從8個樣品基因表達譜中提取5個家族轉(zhuǎn)錄因子映射基因的表達量信息。構(gòu)建4份玉米自交系在2種水分條件下基因差異表達譜，篩選差異表達基因(Log2|fold change|≥1，P<0.01，F(xiàn)DR≤0.05，F(xiàn)DR≤0.01，F(xiàn)DR≤0.001)，對差異表達基因數(shù)、表達模式進行比較分析。

為了解差異表達基因功能，使用agriGO(http：//bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/)Singular EnrichmentAnalysis(SEA)工具進行Gene Ontology分析。以ZeamaysV5a為參考基因組背景，富集差異顯著的GO條目(FDR < 0.05)。使用PlantTFDB對生物學(xué)功能顯著富集GO term基因功能進行注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐旱表型分析

本研究使用耐旱型玉米自交系鐵7922、X178，敏感型自交系吉81162、丹340為材料。為了分析自交系遭受干旱脅迫后表型變化，對正常灌溉處理與干旱脅迫處理下自交系的土壤相對含水量和穩(wěn)態(tài)葉綠素?zé)晒庵颠M行測定，結(jié)果顯示(圖1)，正常灌溉處理下，土壤相對含水量維持在0.63 cm3/cm3左右，穩(wěn)態(tài)葉綠素?zé)晒庵底畲蟮氖荴178(0.50)，最小為丹340(0.32)，鐵7922和吉81162分別為0.33，0.39。相同條件下，干旱脅迫處理5 d后土壤相對含水量降至0.23 cm3/cm3左右，葉綠素穩(wěn)態(tài)熒光值最大的是X178(0.42)，最小的是吉81162(0.20)，鐵7922和丹340分別為0.27，0.22。與正常灌溉處理相比，干旱脅迫處理下材料土壤相對含水量平均下降39.5個百分點，穩(wěn)態(tài)葉綠素?zé)晒庵狄簿尸F(xiàn)下降趨勢。下降幅度較大的是敏感自交系吉81162、丹340，分別下調(diào)0.19，0.10；耐旱型自交系鐵7922和X178下降較小，分別為0.06和0.08。葉綠素穩(wěn)態(tài)熒光值是光合作用的指標(biāo)，反映光合作用的重要參數(shù)，干旱脅迫會對植物的光合作用造成影響，而受到脅迫以后耐旱型自交系適應(yīng)性較強，受到影響較??；敏感型自交系適應(yīng)性較差，受到影響較大。

4份玉米自交系材料干旱脅迫與正常灌溉處理5 d前后土壤相對含水量的變化，頂葉穩(wěn)態(tài)葉綠素?zé)晒庵档淖兓?。Before and after 5 days of drought stress of 4 maize inbred lines，the change of relative water content in the soil and chlorophyll fluorescence.

2.2 干旱脅迫下差異表達基因分析

對4份自交系2種水分條件下雄穗RNA-Seq表達譜中5個轉(zhuǎn)錄因子家族基因表達量進行分析(圖2)。干旱脅迫與正常灌溉處理下共檢測到502個基因表達量發(fā)生變化(FDR≤0.05，P<0.01)，表達量差異2倍以上的基因有287個(log2|fold change| ≥1)，其中，4份玉米自交系中分別檢測到108，132，118，71個(圖2-A)。

根據(jù)4份自交系的耐旱性不同，將自交系按照耐旱性分為耐旱與干旱敏感型2組，每組2個自交系相互驗證，對其差異表達基因數(shù)以及表達模式進行比較分析(圖2-B、C)。

發(fā)現(xiàn)耐旱型自交系鐵7922、X178中差異表達基因206個，2個自交系共有34個，干旱脅迫處理表達量上調(diào)基因106個，下調(diào)基因134個；干旱敏感型自交系吉81162和丹340中差異表達基因163個，2個自交系共有24個(圖2-C)。干旱脅迫處理下表達量上調(diào)基因73個，下調(diào)基因114個。對耐旱型和敏感型自交系中差異表達基因數(shù)進行分析發(fā)現(xiàn)，耐旱型自交系(DT)>干旱敏感型自交系(DS)。研究結(jié)果表明，受到干旱脅迫后，大部分轉(zhuǎn)錄因子基因呈現(xiàn)下調(diào)表達，部分呈現(xiàn)上調(diào)表達。敏感型玉米自交系中響應(yīng)基因相對較少且下調(diào)表達基因較多，耐旱型自交系中響應(yīng)基因相對較多且上調(diào)表達基因較多。

A.4份玉米自交系中的差異表達基因數(shù)目：FDR≤0.05，F(xiàn)DR≤0.01，F(xiàn)DR≤0.001 為3種FDR水平； B.表達模式進行分析：Log2|fold change|≥1上調(diào)表達，Log2|fold change|≤-1下調(diào)表達； C.287個差異表達基因在4份玉米自交系中存在情況。.Before and after 5 days of drought stress of 4 maize inbred lines，the change of relative water content in the soil and chlorophyll fluorescence.A. The number of differentially expressed genes in 4 maize inbred lines;three FDR levels of FDR≤0.05 FDR or less than 0.01 FDR or less than 0.001 were analyzed；B.The expression patterns,Log2|fold change|≥1 up-regulated expression，Log2|fold change|≤-1 down regulated expression；C.The existence of 287 differentially expressed genes in 4 maize inbred lines.

2.3 GO功能注釋和富集分析

為了解差異表達轉(zhuǎn)錄因子功能，對287個差異表達基因進行GO基因功能富集和注釋(Gene Ontology)。在生物學(xué)過程方面，主要參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄、生物合成、響應(yīng)刺激、多細胞生物學(xué)過程、器官發(fā)育、代謝過程、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。分子功能方面，主要有DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、特異性序列結(jié)合活性、蛋白質(zhì)聚合活性以及氨基酸結(jié)合活性。細胞組分方面，主要與細胞核、胞內(nèi)組分、細胞質(zhì)、膜整體構(gòu)架、細胞器組成相關(guān)(圖3)。

對差異表達基因生物學(xué)過程方面主要富集的 6個GO條目中各基因詳細功能進行分析。調(diào)控轉(zhuǎn)錄條目中功能基因162個，占差異表達基因數(shù)的56.45%，主要功能為調(diào)控轉(zhuǎn)錄。生物合成條目中功能基因113個，占差異表達基因的39.37%，與葉綠素、亞鐵血紅素、木質(zhì)素、脯氨酸、海藻糖、類黃酮等生物合成相關(guān)；響應(yīng)刺激條目中功能基因104個，占差異表達基因的36.23%，主要包括響應(yīng)脫落酸、乙烯、茉莉酸、水楊酸、赤霉素等植物激素，響應(yīng)水分虧損、高鹽、低溫、光照等非生物脅迫，真菌、細菌、病毒等生物脅迫。器官發(fā)育條目中功能基因47個，占差異表達基因的16.38%，主要參與調(diào)控胚胎、種子、花粉、氣孔、根、葉、葉脈等器官的發(fā)育。代謝過程條目中功能基因38個，占差異表達基因的13.24%，主要涉及脯氨酸、活性氧、赤霉素、花青素等代謝過程。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路條目中基因功能基因16個，占差異表達基因的5.57%，主要參與脫落酸、茉莉酸、水楊酸、赤霉素、葡萄糖、紅光/遠紅光等介導(dǎo)的信號通路。

為篩選耐旱調(diào)控基因，對差異表達基因中耐旱功能(響應(yīng)脫落酸、乙烯、茉莉酸、水楊酸、赤霉素等植物激素刺激，參與其生物合成、代謝過程以及調(diào)控氣孔發(fā)育，響應(yīng)水分虧損脅迫)基因進行富集，獲得差異表達基因34個。其中，在2個耐旱自交系中共有且表達模式一致基因6個；2個敏感自交系中共有且表達模式一致基因3個，4個自交系中均檢測到差異表達基因1個，共篩選出10個基因為耐旱調(diào)控候選基因。

2.4 耐旱相關(guān)重要轉(zhuǎn)錄因子

在2個耐旱型自交系共有且表達模式一致基因6個，其中上調(diào)表達基因4個，下調(diào)表達基因2個?；蚬δ芤约霸?個耐旱自交系中的差異表達倍數(shù)如表2所示。

在2個敏感型(DS)自交系中共有且表達模式一致耐旱候選基因3個，且全部表現(xiàn)為下調(diào)表達，基因功能以及在2個敏感型自交系中的差異表達倍數(shù)如表3所示。

圖3 差異表達基因的基因功能注釋Fig.3 The GO gene function annotation of thedifferentially expressed genes

表2 耐旱型自交系中篩選出的候選基因Tab.2 Candidate genes detected in the drought-sensitive inbred lines

表3 敏感型自交系中篩選出的候選基因Tab.3 Candidate genes screened in the drought-sensitive inbred lines

在4個自交系2種水分條件下均檢測到耐旱候選基因GRMZM2G137046(ZmbZIP61)，該基因響應(yīng)脫落酸(ABA)和赤霉素(Gibberellin)，與擬南芥中(ATbZIP56)基因同源，在鐵7922、X178、吉81162、丹340自交系干旱脅迫與正常灌溉條件下，表達量差異倍數(shù)分別為2.97，-7.63，-2.99，-3.02。

3 討論與結(jié)論

玉米雄穗發(fā)育前期是花器官分化重要階段，遭受干旱脅迫會對玉米產(chǎn)量造成嚴重影響。轉(zhuǎn)錄因子能夠協(xié)調(diào)耐旱調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在調(diào)節(jié)植物耐旱性上具有重要作用[6]。大量轉(zhuǎn)錄因子基因響應(yīng)干旱脅迫，在轉(zhuǎn)錄組水平上呈現(xiàn)差異表達[7]。RNA-Seq技術(shù)是檢測基因轉(zhuǎn)錄水平變化的有力手段，具有檢測基因較多且重復(fù)性好的特點[32-34]。本研究以玉米雄穗為研究對象，從中檢測出5個轉(zhuǎn)錄因子家族中大量功能各異的轉(zhuǎn)錄因子在受到干旱脅迫后呈現(xiàn)差異表達，由于不同玉米自交系遺傳背景不同，導(dǎo)致差異表達基因不盡相同。為了發(fā)掘與玉米雄穗耐旱相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，篩選在耐旱自交系或敏感自交系中可以相互驗證(即在2個耐旱型自交系或2個敏感自交系中共有且表達模式一致)的耐旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因為耐旱候選基因。

3.1 調(diào)控氣孔發(fā)育與活動的轉(zhuǎn)錄因子

氣孔形態(tài)與活動在調(diào)節(jié)水分散失方面起到重要作用，是響應(yīng)干旱脅迫的關(guān)鍵組分?，F(xiàn)已證明，很多轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控氣孔發(fā)育與活動調(diào)控耐旱，例如AtWRKY1、AtWRKY53、AtMYB60等[35-37]。本研究篩選出與調(diào)控氣孔發(fā)育和活動相關(guān)基因GRMZM2G417164(bHLH82)在2個敏感性自交系中一致下調(diào)表達。Yang等[38]研究發(fā)現(xiàn)，其同源基因AT3G06120在擬南芥中通過調(diào)控氣孔發(fā)育調(diào)控旱性。所以，該基因可能通過調(diào)控氣孔發(fā)育，與雄穗耐旱性相關(guān)。

3.2 響應(yīng)水分虧損脅迫的轉(zhuǎn)錄因子

響應(yīng)水分虧損是響應(yīng)干旱脅迫的直接表現(xiàn)，本研究在WRKY家族中篩選出2個候選基因GRMZM2G449681(WRKY92)和GRMZM2G018721(WRKY48)，均具有響應(yīng)水分虧損功能，2個基因在擬南芥中的同源基因分別為AT5G07100(AtWRKY26)和AT1G69310(AtWRKY54)。前人研究發(fā)現(xiàn)，AtWRKY26響應(yīng)非生物脅迫，AtWRKY54在葉片衰老上起到負向調(diào)控作用，2個基因可能在雄穗耐旱性調(diào)控中起到重要作用[39-40]。

3.3 植物激素相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子

近年來，脫落酸、生長素、乙烯、茉莉酸、水楊酸、赤霉素等多種植物激素被證明與植物耐旱顯著相關(guān)，其中研究最多的是“逆境激素”脫落酸(ABA)[41]。

本研究中篩選出的候選基因中與ABA相關(guān)的有GRMZM2G014653 (NAC109)、GRMZM2G159547 (MYB48)、GRMZM2G137046 (ZmbZIP61)。其中，GRMZM2G014653(NAC109)參與ABA信號通路并起負向調(diào)節(jié)作用，在2個耐旱自交系受到干旱脅迫后表達量顯著上升，該基因?qū)儆贜AC家族中與耐旱顯著相關(guān)的SNAC亞家族[9]。Thatcher等[42]發(fā)現(xiàn)，擬南芥中同源基因AT1G01720(AtNAC002)通過可變剪切方式響應(yīng)干旱脅迫。GRMZM2G159547(MYB48)響應(yīng)ABA、植物生長素、茉莉酸等植物激素，在耐旱自交系干旱脅迫后表達量一致上升，Wang等[43]研究發(fā)現(xiàn)，ZmMYB48在轉(zhuǎn)基因擬南芥中過表達會增強擬南芥耐旱性，進一步證明該基因參與雄穗耐旱調(diào)控。GRMZM2G137046(ZmbZIP61)屬于bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族，響應(yīng)ABA和赤霉素刺激，本研究在4個玉米自交系中均顯著差異表達。目前，沒有研究表明該基因與耐逆相關(guān)，但是本研究在玉米雄穗中檢測到該基因一致響應(yīng)干旱脅迫，且其功能與ABA、赤霉素等植物激素相關(guān)，可能是一個參與雄穗耐旱調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子。

除了檢測到一些轉(zhuǎn)錄因子與ABA密切相關(guān)以外，還檢測出與植物生長素、乙烯、茉莉酸、水楊酸代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在雄穗受到干旱脅迫后顯著差異表達，包括響應(yīng)茉莉酸乙烯赤霉素水楊酸的GRMZM2G047626(MYB6)；響應(yīng)乙烯、植物生長素的GRMZM2G057027 (MYB p2)；響應(yīng)乙烯、水楊酸的GRMZM2G139688(MYB138)；以及屬于SNAC亞家族中的響應(yīng)茉莉酸NAC家族轉(zhuǎn)錄因子GRMZM2G179885(NAC132)。GRMZM2G139688(MYB138)擬南芥中的同源基因AT3G11440(AtMYB60)在干旱脅迫下調(diào)控氣孔活動和根系生長相關(guān)[37]。sNAC家族GRMZM2G179885(NAC132)的水稻同源基因LOC_Os07g37920(OsNAC10)增強了水稻的耐旱性和產(chǎn)量[44]。

雄穗發(fā)育早期干旱脅迫是造成玉米產(chǎn)量虧損的重要因素，轉(zhuǎn)錄因子在耐旱性調(diào)控中起到重要作用。本研究采用RNA-Seq技術(shù)在轉(zhuǎn)錄組水平上檢測耐旱型自交系和敏感型自交系干旱脅迫與五大耐逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子家族(NAC、MYB、bHLH、bZIP、WRKY)基因表達譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，287個轉(zhuǎn)錄因子在干旱脅迫后表達量差異顯著(P<0.01, FDR<0.05)。篩選出在耐旱型或干旱敏感型自交系中表達穩(wěn)定的雄穗發(fā)育早期耐旱候選基因10個。