桔梗種子發(fā)育過程中外觀形態(tài)及生理生化的變化

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(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所， 吉林 長春 130112)

桔梗(Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.)屬于桔?？平酃俣嗄晟p子葉草本，是一種藥、食、賞兼用植物[1]。紫花桔梗為桔?？?Campanulaceae)桔梗屬(Platycodon)唯一的種，而白花桔梗為其一個變種[2-3]。桔梗為一個廣布種，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。目前對桔梗種子的研究主要集中在種子休眠、萌發(fā)及貯藏等方面，對種子發(fā)育特點的相關(guān)研究較少。

注：A為紫花桔梗種子；B為白花桔梗種子。圖1 桔梗種子發(fā)育過程中的形態(tài)變化

種子的發(fā)育過程是植物有機(jī)個體發(fā)育的最初階段，該階段是形成幼苗的必經(jīng)之路，不僅影響種子本身的特性，同時也直接關(guān)系到下一代的正常生長發(fā)育[4-5]。桔梗果實成熟后開裂，種子易落地，加之種子很小，若種子采收過晚，因成熟大量脫落，造成巨大的損失；若采收過早，其風(fēng)干后不飽滿，影響種子的質(zhì)量與品質(zhì)。本實驗以紫花桔梗和白花桔梗種子為材料，研究種子發(fā)育過程中的外觀形態(tài)特點及生理生化變化，以確定種子的適宜收獲期，為桔梗種子的發(fā)育生理研究及種子生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地點及樣品采集

紫花桔梗和白花桔梗種子采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所藥用植物資源圃。于桔梗盛花期進(jìn)行人工標(biāo)記，種子取樣時間為2016年8月至9月，每隔3 d采集1次種子，至果實成熟。獲得3～61 DAF紫花桔梗種子和3～58 DAF白花桔梗種子(其中25～61 DAF紫花桔梗種子和25～58 DAF白花桔梗種子用于發(fā)芽率、生理生化等指標(biāo)的測定)果實采收后密封待用。

1.2 測定項目及方法

1.2.1 種子形態(tài)觀測方法

通過目測和20倍解剖鏡觀測種子的外觀形態(tài)。

1.2.2 發(fā)芽率測定

將不同發(fā)育時期的桔梗種子放入鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，在25 ℃條件下光培養(yǎng)，每皿100粒，3次重復(fù)，統(tǒng)計發(fā)芽率。

1.2.3 種子含水量測定

稱取不同發(fā)育時期的種子0.5 g，3次重復(fù)，于恒溫(130℃±2℃)條件下烘4 h，測定種子的含水量。

1.2.4 相對電導(dǎo)率測定

參考張心慧[6]的方法，將30粒桔梗種子放入30 mL重蒸餾水中，在黑暗條件下，于25 ℃浸泡3 h，然后用DDS-11 A型電導(dǎo)率儀測定種子的電導(dǎo)率(A1)，隨后沸水浴1 h，最后測定其煮沸后的電導(dǎo)率(A2)。

相對電導(dǎo)率(%)=A1/A2×100%。

1.2.5 脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物及各種抗氧化酶的測定

丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶( SOD) 活性、過氧化物酶( POD) 活性及過氧化氫酶( CAT) 活性的測定參照王學(xué)奎[7]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel 2010軟件和DPS v 7.05統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、制圖以及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子發(fā)育過程中的形態(tài)變化

桔梗種子發(fā)育過程中的外觀形態(tài)變化明顯(圖1)。種子形狀有細(xì)卵形、長卵形、卵形。3 DAF與7 DAF種子分別為無色和粉紫色；10～25 DAF種子顏色經(jīng)歷了由淺紫色向紫色的轉(zhuǎn)變，在28 DAF開始變?yōu)獒u紫色；22 DAF紫花桔梗和19 DAF白花桔梗種子的頂端(略寬一端)開始具明顯的圓滑棱，共2～4支；31～46 DAF種子顏色經(jīng)歷了由醬紫色向深紫色的轉(zhuǎn)變；52～61 DAF紫花桔梗與49～58 DAF白花桔梗種子顏色變化依次為深紫色、黃褐色(或褐色)、黑色(或黑褐色、烏黑色等顏色)；種翅的厚度隨著發(fā)育進(jìn)程逐漸變薄，其顏色也由淺變深，55 DAF紫花桔梗和52 DAF白花桔梗種子的種翅顏色開始由無色變?yōu)榘迭S色或黃褐色，隨后變?yōu)樯詈稚蚝谏?1 DAF紫花桔梗和58 DAF白花桔梗種子表面具有與種子長軸平行的細(xì)長條紋理。說明白花桔梗種子的外觀形態(tài)變化先于紫花桔梗種子。

2.2 種子發(fā)育過程中含水量與發(fā)芽率的變化

紫花桔梗與白花桔梗種子經(jīng)歷了自然脫水，且在不同發(fā)育階段其脫水速率不同；其中34～46 DAF紫花桔梗種子與34～40 DAF、49～52 DAF白花桔梗種子含水量的下降速率明顯高于其他發(fā)育階段；至種子發(fā)育末期，紫花桔梗種子含水量下降了20.51%，白花桔梗種子含水量下降了15.70%(圖2)。

圖2 桔梗種子發(fā)育過程中含水量的變化

種子的發(fā)芽率隨著發(fā)育進(jìn)程呈上升的趨勢。紫花桔梗和白花桔梗種子均在28 DAF具有發(fā)芽能力，發(fā)芽率分別為24.33%、26.00%(圖3)，隨后種子萌發(fā)率不斷升高，最后分別達(dá)到72.33%、91.00%；其中34～37 DAF種子的發(fā)芽率明顯增加，前者發(fā)芽率由34.00%增至48.67%，增加了14.67%，后者由37.00%增至61.00%，增加了24.00%。在整個發(fā)育過程中，紫花桔梗種子的萌發(fā)率低于白花桔梗種子，而其含水量的變化則相反。

2.3 種子發(fā)育過程中相對電導(dǎo)率的變化

紫花桔梗與白花桔梗種子的相對電導(dǎo)率隨發(fā)育進(jìn)程呈下降趨勢(圖4)，分別由58.35%下降至29.70%，57.33%下降至29.26%；其中34～37 DAF種子的相對電導(dǎo)率下降明顯，分別由49.39%降至41.97%，43.73%降至40.58%，各下降了7.43%、3.15%。25～46 DAF白花桔梗種子的相對電導(dǎo)率明顯低于同發(fā)育時期的紫花桔梗種子，但兩者的下降速率幾乎相同，分別以平均每天0.97%與0.98%的速率下降；在種子發(fā)育后期，兩者的相對電導(dǎo)率差異不明顯。這一結(jié)果表明，隨著種子不斷成熟，膜的選擇透性逐漸增大，尤其是發(fā)育后期，種子細(xì)胞膜完整性趨于完善。

圖3 桔梗種子發(fā)育過程中發(fā)芽率的變化

圖4 桔梗種子發(fā)育過程中相對電導(dǎo)率的變化

2.4 種子發(fā)育過程中抗氧化酶活性的變化

2.4.1 過氧化氫酶(CAT)活性變化

在發(fā)育過程中，紫花桔梗與白花桔梗種子的CAT活性變化表現(xiàn)出“上升—下降”的趨勢(圖5)，25 DAF種子的CAT活性分別為19.41 U/mg、17.11 U/mg；隨著種子不斷發(fā)育，其CAT活性分別在55 DAF、43 DAF達(dá)到最高，各為45.15 U/mg、52.95 U/mg；此后兩者的CAT活性分別快速下降為11.89 U/mg、11.52 U/mg。在紫花桔梗與白花桔梗種子的發(fā)育后期，其CAT活性變化較小。

2.4.2 過氧化物酶(POD)活性變化

紫花桔梗與白花桔梗種子POD活性與CAT活性的變化類似，都呈單峰曲線變化；25 DAF種子的POD活性分別為19.00 U/mg、19.80 U/mg；活性峰值分別在55 DAF、46 DAF，POD活性分別為33.71 U/mg、46.58 U/mg，此后種子的POD活性快速下降，分別降為5.00 U/mg、8.83 U/mg(圖6)。發(fā)育后期的紫花桔梗與白花桔梗種子的POD活性變化較小。

圖5 桔梗種子發(fā)育過程中CAT活性的變化

圖6 桔梗種子發(fā)育過程中POD活性的變化

2.4.3 超氧化物歧化酶(SOD)活性變化

在紫花桔梗與白花桔梗種子發(fā)育過程中，其SOD活性呈“上升—下降—上升”的變化趨勢(圖7)；25 DAF種子的SOD活性分別為3 775.37 U/g、3 061.98 U/g。紫花桔梗種子SOD活性在40 DAF達(dá)到最高，為4 876.76 U/g；40～46 DAF種子的SOD活性逐漸降低，隨后又逐漸上升至4 407.35 U/g。白花桔梗種子在34 DAF上升至4 158.86 U/g，在40 DAF又快速下降至3 163.02 U/g，40～58 DAF種子的SOD活性不斷升高，最后高達(dá)4 771.65 U/g。這表明白花桔梗種子SOD活性變化的時間先于紫花桔梗種子。在發(fā)育后期，紫花桔梗與白花桔梗種子的SOD活性變化均較小。

2.4.4 丙二醛(MDA)含量變化

紫花桔梗與白花桔梗種子的MDA含量隨發(fā)育進(jìn)程表現(xiàn)出“上升—下降”的變化趨勢(圖8)，25 DAF種子的MDA含量分別為17.98 nmol/mg、18.37 nmol/mg；隨著種子不斷發(fā)育，其MDA含量分別在52 DAF、46 DAF達(dá)到最大，各為48.22 nmol/mg、93.29 nmol/mg；隨后快速下降，分別降低至5.32 nmol/mg、10.76 nmol/mg，即種子發(fā)育末期的MDA含量最低。

圖7 桔梗種子發(fā)育過程中SOD活性的變化

圖8 桔梗種子發(fā)育過程中MDA含量的變化

3 結(jié)論與討論

種子產(chǎn)量的高低、品質(zhì)的好壞與種子的收獲期密切相關(guān)。研究認(rèn)為種子形態(tài)指標(biāo)、生理生化指標(biāo)等都可被作為種子適宜采收期的判定指標(biāo)[8]。有研究表明，大豆種子的含水量可作為其生理收獲期的一個準(zhǔn)確指標(biāo)[8-9]；沙蔥種子的顏色變?yōu)楹谏珪r，可作為確定種子適宜采收期準(zhǔn)確快捷的指標(biāo)[8]。本項研究中，28 DAF種子開始具有萌發(fā)能力，且此時種子顏色開始轉(zhuǎn)變?yōu)獒u紫色。34～37 DAF種子的顏色經(jīng)歷了由醬紫色向深紫色的轉(zhuǎn)變，其發(fā)芽率、含水量、相對電導(dǎo)率也相應(yīng)地發(fā)生了明顯變化。61 DAF紫花桔梗與58 DAF白花桔梗種子的顏色為黑色、烏黑色、黑褐色或深褐色，且種子表面出現(xiàn)與種子長軸平行的細(xì)長條紋理，此時種子含水量與相對電導(dǎo)率達(dá)到最低，發(fā)芽率達(dá)到最高，即此時的形態(tài)特征可作為桔梗種子適宜采收期的判定指標(biāo)。

種子在脫水過程中會產(chǎn)生活性氧(AOS)[10]，而SOD、POD 和 CAT 是生命活動中具有協(xié)同作用的保護(hù)酶[11]，其不僅可以抵御AOS對細(xì)胞造成的傷害，還在種子發(fā)育過程中獲得脫水耐性，對抵抗不良環(huán)境的影響等方面具有重要作用[12-13]。其中，SOD 主要的功能是催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)生成過氧化氫(H2O2)[14]；POD、CAT可消除H2O2的脅迫作用，有效保護(hù)膜結(jié)構(gòu)[11,14-15]。本研究結(jié)果顯示，種子發(fā)育過程中POD與CAT呈先升后降的變化，這與閆曉娜等[11]和顏世超等[16]的研究結(jié)果一致。種子的POD與CAT活性升高，有利于清除體內(nèi)的氧自由基，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整。在種子發(fā)育后期，SOD活性逐漸上升，POD與CAT活性卻逐漸降至最低，可能是SOD在清除AOS過程中積累的H2O2抑制了POD與CAT的活性[11]。

MDA是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物。本研究表明，在桔梗種子自然脫水過程中，MDA含量呈“上升-下降”的趨勢，這與小麥[17]、沙蔥[8]、玉米胚[18]種子脫水時MDA含量的變化類似。種子含水量下降會引起生物體內(nèi)發(fā)生過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致MDA含量的增加；隨著種子不斷發(fā)育成熟，脂質(zhì)過氧化作用降低，則MDA含量不斷下降。

CAT、POD、MDA 3個指標(biāo)均呈單峰曲線變化。三者在40～58 DAF紫花桔梗種子、34～55 DAF白花桔梗種子中發(fā)生了明顯的變化，說明此階段種子內(nèi)生理代謝活動異?；钴S，且白花桔梗種子內(nèi)CAT、POD、MDA變化的時間先于紫花桔梗種子；此發(fā)育時期內(nèi)種子的顏色經(jīng)歷了深紫色、黃褐色(或褐色)、黑色(或黑褐色、深褐色等顏色)的明顯變化，種翅亦由無色變?yōu)榘迭S色或黑褐色等顏色。

綜上所述，種子在發(fā)育進(jìn)程中，外觀形態(tài)變化與生理生化變化有密切聯(lián)系，且白花桔梗種子外觀形態(tài)與生理生化變化的時間提前于紫花桔梗種子。種子發(fā)育后期的生理生化反應(yīng)趨于穩(wěn)定，且此時種子的發(fā)芽率逐漸增至最高。因此，建議紫花桔梗種子在61 DAF左右采收 ，白花桔梗種子在58 DAF左右采收。適宜時間采收的種子不僅有利于下一季播種，而且可為種質(zhì)資源保存提供適宜的種子材料，延長種子的貯藏壽命，對于中藥材生產(chǎn)實踐及種質(zhì)資源持續(xù)利用均具有重要的理論和現(xiàn)實意義。