響應(yīng)面法優(yōu)選酸棗種子萌發(fā)條件及其顯微結(jié)構(gòu)研究

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(河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院， 石家莊 050200)

酸棗種子即酸棗仁為鼠李科植物酸棗[ZiziphusjujubaMill.var.spinose(Bunge) Hu ex H.F.Chou]的干燥成熟種子[1]。其味酸、甘，性平，歸肝、心、膽經(jīng)，具有養(yǎng)心安神等作用，有較高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2]。主產(chǎn)于河北、山東、遼寧、陜西、河南等省。秋末冬初采收成熟果實(shí)，除去果肉和核殼，收集種子，曬干。目前酸棗仁在治療失眠等疾病使用量驟增，對酸棗仁的質(zhì)量要求更高，但市場上酸棗仁因產(chǎn)地、栽培、管理方法等因素不同導(dǎo)致其質(zhì)量參差不齊，因此，研究酸棗種子萌發(fā)條件，篩選優(yōu)質(zhì)種苗具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

本試驗(yàn)采用顯微鏡觀察酸棗種子不同萌發(fā)階段的石蠟切片，采用體式顯微鏡觀察酸棗種子發(fā)芽前、后的形態(tài)特征；并通過三因素三水平正交試驗(yàn)探究赤霉素濃度、溫度和光照時(shí)間對酸棗種子發(fā)芽的影響，為酸棗的種植栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

光照培養(yǎng)箱(MGC-450 BP上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；SZ 61型變焦體式顯微鏡、CX 41型顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；SQP型萬分之一電子天平(德國SARTORIUS公司)；Milli-Q超純水機(jī)(美國THERMO公司)。

1.2 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用的酸棗種子(河北邢州棗業(yè)有限公司提供)，經(jīng)河北省中藥鑒定專家孫寶惠教授鑒定為為鼠李科植物酸棗[ZiziphusjujubaMill.var.spinose(Bunge) Hu ex H.F.Chou]的干燥成熟種子。種子的百粒重為4.458 5 g，含水量為8.90%，種子吸水率為22.45%。TTC染色率為97.67%。

赤霉素(GA3)購于上海阿拉丁生化科技有限公司，水為自制純水。

發(fā)芽紙為2層經(jīng)過消毒的濾紙。

1.3 試驗(yàn)方法與設(shè)計(jì)

1.3.1 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)前對所采集到的種子按樣品編號進(jìn)行扦樣和凈度分析后，從每份樣品中分別取出25粒干凈種子充分混勻，用于種子的發(fā)芽試驗(yàn)。

取純凈的混合酸棗仁種子，經(jīng)浸種吸脹后，置紙上發(fā)芽床培養(yǎng)皿，每皿25粒，3次重復(fù)，在設(shè)定溫度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每日觀察記錄酸棗仁種子發(fā)芽狀態(tài)，保持培養(yǎng)皿溫度。發(fā)芽計(jì)數(shù)時(shí)間的設(shè)定根據(jù)適宜發(fā)芽條件下的發(fā)芽表現(xiàn)，確定初次計(jì)數(shù)和末次計(jì)數(shù)時(shí)間。以達(dá)到50%發(fā)芽率的天數(shù)為初次計(jì)數(shù)時(shí)間，以發(fā)芽率達(dá)到最高時(shí)，以后再無萌發(fā)種子出現(xiàn)時(shí)的天數(shù)為末次計(jì)數(shù)時(shí)間。發(fā)芽率以最終達(dá)到的正常幼苗百分率計(jì)。即：

發(fā)芽率(%)=發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%;

酸棗種子沒有休眠期，其干燥成熟種子于20 ℃，濕度90%，光照強(qiáng)度8 000 lx條件下，5～7 d即可萌發(fā)。種子萌發(fā)時(shí)首先可見胚根發(fā)育成的白色的根從種子發(fā)芽孔出萌出。隨后酸棗種子紅褐色的皮逐漸脫落，2片綠色的子葉逐漸伸展，為種子萌發(fā)提供營養(yǎng)。

1.3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Box-Behnken響應(yīng)面法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)[3]，以酸棗仁種子發(fā)芽率(Y)，選擇赤霉素濃度(A)、溫度(B)、光照時(shí)間(C)這3個(gè)因素，設(shè)計(jì)三因素三水平的中心組合，并采用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)與分析，因素水平見表1。

表1 因素水平

因素水平-101赤霉素濃度(mg/L)200500800溫度(℃)202530光照時(shí)間(h)81624

1.3.3 種子萌發(fā)過程解剖結(jié)構(gòu)觀察

酸棗種子在30 ℃的條件下，5 d左右即可萌發(fā)，本實(shí)驗(yàn)采用體式顯微鏡觀察并對比酸棗種子萌發(fā)前后的形態(tài)特征。采用顯微鏡觀察放大不同倍數(shù)的酸棗種子胚的形成與發(fā)育的石蠟切片，了解酸棗種子胚的發(fā)育過程。

石蠟切片的制作：1) 選取4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的酸棗種子，并加入FAA固定液(70%乙醇、冰醋酸、甲醛體積比為18∶1∶1)，放置于4 ℃的冰箱中，固定24 h以上。2) 將浸泡好的切片經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋處理后，使用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片，切片完成后在50 ℃恒溫水浴箱上進(jìn)行展片。3) 依次用梯度濃度的二甲苯、無水乙醇、蒸餾水對切片進(jìn)行脫蠟處理，并對酸棗種子切片進(jìn)行番紅-固綠染色劑染色。4) 切片染色后，進(jìn)行透明、封片、烘片處理，在顯微鏡下觀察和照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子萌發(fā)過程單因素影響

2.1.1 赤霉素濃度對種子萌發(fā)的影響[4]

在相同天數(shù)下，固定光照時(shí)間16 h和溫度25 ℃，選擇不同赤霉素濃度(0，200，500，800 mg/L)對酸棗種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)影響，結(jié)果見表2。赤霉素濃度為0 mg/L時(shí)，酸棗種子的發(fā)芽率為28%，隨著赤霉素濃度的升高，酸棗種子的發(fā)芽率隨之增加，其最適濃度為500 mg/L。超過500 mg/L時(shí)，赤霉素將抑制種子萌發(fā)。

表2 赤霉素濃度對酸棗種子發(fā)芽率的影響

赤霉素濃度(mg/L)0200500800發(fā)芽率(%)283665.3354.67

2.1.2 溫度對種子萌發(fā)的影響

在相同天數(shù)下，固定光照時(shí)間16 h和赤霉素濃度500 mg/L，選擇不同溫度(15，20，25，30 ℃)對酸棗種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)影響，結(jié)果見表3。溫度為15 ℃時(shí)，酸棗種子的發(fā)芽率為23%，隨著溫度的升高，酸棗種子的發(fā)芽率隨之增加，30 ℃時(shí)，種子發(fā)芽率可達(dá)98.6%，溫度繼續(xù)增加則會抑制種子萌發(fā)，甚至?xí)捎跍囟冗^高導(dǎo)致種子死亡。

表3 溫度對酸棗種子發(fā)芽率的影響

溫度(℃)1520253035發(fā)芽率(%)21.335665.3382.6753.33

2.1.3 光照時(shí)間對種子萌發(fā)的影響

在相同天數(shù)下，固定溫度25 ℃和赤霉素濃度500 mg/L，選擇不同光照時(shí)間(光照8 h/黑暗16 h、光照16 h/黑暗8 h、全光照)對酸棗種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)影響，結(jié)果見表4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著光照時(shí)間延長，酸棗種子發(fā)芽率明顯增加。

表6 方差分析

平方和自由度均方F值p值顯著性模型2198.929244.3213.69<0.0001**A5.8515.853.130.1203B373.601373.60199.84<0.0001**C353.381353.38189.03<0.0001**AB196.141196.14104.92<0.0001**AC65.37165.3734.970.0006**BC113.851113.8560.900.0001**A21007.8011007.80539.07<0.0001**B2115.461115.4664.760.0001**C23.1213.121.670.2371殘差13.0971.87失擬項(xiàng)10.6333.545.780.0617純誤差2.4540.61總和2212.0016R2=0.9941;R2Adj=0.9865

注：“*”表示差異顯著(p<0.05),“**”表示差異極顯著(p<0.01)。

圖1 各因素交互作用對酸棗種子發(fā)芽率的影響

表4 光照時(shí)間對酸棗種子發(fā)芽率的影響

光照時(shí)間(h)81624發(fā)芽率(%)42.6765.3372

2.2 種子萌發(fā)過程多因素影響

利用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì)，以赤霉素濃度、溫度、光照時(shí)間為響應(yīng)變量，發(fā)芽率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果如表5所示，對表5數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，建立提取工藝參數(shù)回歸模型[5]?；貧w方程為：Y=65.9-0.85A+6.83B+6.65C-7.00AB-4.04AC-5.34BC-15.47A2+5.24B2-0.86C2。

對于所得的回歸方程進(jìn)行的分析和檢驗(yàn)結(jié)果如表6所示。從表6可知試驗(yàn)?zāi)Ｐ蚿<0.05，說明所選的模型顯著。失擬項(xiàng)p為0.061 7>0.05，即失擬項(xiàng)差異不顯著，表明該二次回歸模型能夠顯著擬合赤霉素濃度、溫度、光照時(shí)間對于酸棗仁發(fā)芽率的影響?；貧w方程各項(xiàng)方差分析中F檢驗(yàn)可以判斷自變量對因變量的影響，一次項(xiàng)B、C對發(fā)芽率的影響達(dá)到極顯著水平(p<0.01)；模型中的二次項(xiàng)AB、AC、BC、A2、B2對發(fā)芽率的影響達(dá)到極顯著水平(p<0.01)。

表5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

ABC發(fā)芽率(%)100065.33211053.333-10162.67400065.335-1-1044.00610154.50700065.338-11070.679-10-140.001000066.671101180.001201-178.67131-1054.67140-1176.001510-148.00160-1-153.331700066.67

注：A為未萌發(fā)的酸棗種子；B為萌發(fā)的酸棗種子。圖2 酸棗種子萌發(fā)

注：(a 1-a 4橫切片2.0×；b 1-b 4縱切片2.0×；c 1-c 4橫切片10.0×；d 1-d 4縱切片10.0×)①胚根；②胚軸；③胚芽；④子葉；⑤胚乳圖3 酸棗種子萌發(fā)過程切片

采用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件分析酸棗仁發(fā)芽率實(shí)驗(yàn)中各因素兩兩交互作用對酸棗仁發(fā)芽率的影響繪制響應(yīng)面圖，如圖1所示。圖中兩因素交互作用，響應(yīng)面越陡峭，對發(fā)芽率的影響越大，反之則對發(fā)芽率的影響越小。圖1 A和圖1 B中，響應(yīng)面坡度陡峭，表明赤霉素濃度與光照時(shí)間、溫度的交互作用影響酸棗仁發(fā)芽率較強(qiáng)。圖1 C中，響應(yīng)面坡度平緩，表明光照時(shí)間與溫度對于酸棗仁發(fā)芽率的交互影響相對較弱。 這與方差分析的結(jié)果基本保持一致。根據(jù)模型預(yù)測，酸棗仁發(fā)芽率的最大值為80.20%，最佳試驗(yàn)條件為：赤霉素濃度480 mg/L、溫度30 ℃、光照時(shí)間24 h。

2.3 種子的形態(tài)與結(jié)構(gòu)

成熟的酸棗種子呈扁圓形或扁橢圓形，長5～9 cm，寬5～7 cm，厚約3 mm，表面紫紅色或紫褐色，平滑有光澤，中間有1條隆起的總線紋。一端凹陷，可見線形種臍；另端有細(xì)小突起的合點(diǎn)。種子發(fā)芽時(shí)，白色的胚根從合點(diǎn)長出，一段時(shí)間后形成根，如圖2所示。

2.4 胚的形成與發(fā)育

通過觀察不同生長發(fā)育時(shí)期的酸棗種子的橫切片與縱切片可以發(fā)現(xiàn)酸棗種子由種皮、胚和胚乳3個(gè)部分構(gòu)成，如圖3所示。種皮由外種皮與內(nèi)種皮構(gòu)成，內(nèi)種皮緊貼胚乳。胚占據(jù)種子體積約4/5，由胚芽、胚軸、胚根、子葉四部分構(gòu)成[6]。其中子葉2片呈卵圓形，大小相等，相互對稱，如圖3(c-3)所示；胚芽著生于2片子葉中間的凹陷部位，胚芽原基略微突起，如圖3(c-4)所示；胚軸連接著胚芽與胚根，同時(shí)與子葉相連，如圖3(d-4)所示；胚根由染色較深的分生細(xì)胞構(gòu)成，呈近橢圓形，如圖3(d-2)所示。胚乳占據(jù)種子體積約1/5，內(nèi)含淀粉粒等提供營養(yǎng)的物質(zhì)，如圖3(a-4)所示。

3 結(jié)果與討論

酸棗種子在赤霉素濃度480 mg/L、溫度30 ℃、光照時(shí)間24 h的環(huán)境下發(fā)芽率最佳。在酸棗種子的胚中，胚根部分的細(xì)胞通過吸收子葉與胚乳提供的營養(yǎng)率先發(fā)育，伸長生長，突破種皮以吸收充足的水分。胚軸與胚芽處的細(xì)胞同時(shí)也進(jìn)行著緩慢的分裂與分化。在種子生長發(fā)育的過程中，明顯可見子葉與胚乳的萎縮，即能量的消耗。最終胚根發(fā)育成酸棗的根，胚軸發(fā)育成酸棗的根莖連接處，胚芽則發(fā)育成酸棗的莖、葉等器官。

赤霉素濃度、溫度和光照時(shí)間3種因素共同影響酸棗種子的發(fā)芽。赤霉素濃度較低時(shí)，可促使酸棗種子的發(fā)芽率提高；當(dāng)濃度較高時(shí)，則會抑制酸棗種子萌發(fā)[7]。所以選擇合適的赤霉素濃度至關(guān)重要。溫度對發(fā)芽率影響也較大，過高的溫度會增強(qiáng)酸棗種子的呼吸作用，種子中儲藏的營養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗，導(dǎo)致發(fā)芽率下降。故選擇合適的溫度也是酸棗種子萌發(fā)的關(guān)鍵[8]。光照條件對于某些寄生植物的初生吸器的分化形成產(chǎn)生方向性的引導(dǎo)作用[9]。但對于酸棗種子的萌發(fā)影響并不明顯。本實(shí)驗(yàn)中，赤霉素濃度、溫度、光照時(shí)間均對酸棗種子發(fā)芽率產(chǎn)生較大影響。但由于全天候的光照條件在室外環(huán)境下較難實(shí)現(xiàn)，所以在育苗時(shí)可適當(dāng)延長光照時(shí)間。