高膽紅素血癥及膽紅素腦病新生大鼠模型的建立與評價

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新生兒黃疸或高膽紅素血癥是一組由于膽紅素代謝異常在體內(nèi)積聚引起的可見皮膚或其他器官黃染，是新生兒期最常見的臨床問題，其發(fā)病率高達60%～85%[1]，并可致膽紅素腦病，但膽紅素腦病的神經(jīng)系統(tǒng)損害早期是可逆的。目前有效的預(yù)測方法是根據(jù)健康新生兒的小時膽紅素列線圖及個體化隨訪計劃結(jié)合頭顱核磁來判斷[2]。然而膽紅素神經(jīng)毒性的作用機制及環(huán)節(jié)尚不清楚，因此，建立合適的動物模型，對有效降低嚴(yán)重高膽紅素血癥的風(fēng)險，避免膽紅素腦病的發(fā)生及評估膽紅素腦病是至關(guān)重要的。本研究根據(jù)7 d齡新生SD大鼠，利用超微結(jié)構(gòu)下觀察發(fā)現(xiàn)其腦組織發(fā)育不完善[3]，血腦屏障的重要組成成分腦血管內(nèi)皮細(xì)胞[4]及星形膠質(zhì)細(xì)胞容易受到膽紅素的破壞等特點，腹腔注射不同劑量的膽紅素，并進行相關(guān)指標(biāo)測定和評價，建立穩(wěn)定的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇7 d齡清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，體重11 g～17 g，雌雄不限，由山西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2 藥品及試劑 晶體膽紅素(美國Sigma公司)，總膽紅素(南京建成生物工程研究所)，S-100 β試劑盒(武漢貝茵萊生物科技公司)，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率試劑盒(羅氏公司)。

1.3 主要儀器 電子天平，多功能全波長酶標(biāo)儀(Thermo)，石蠟包埋機(EG1150Hfc)，輪轉(zhuǎn)切片機(RM225)，顯微照相(OLYMPU BH-2)。

1.4 實驗方法

1.4.1 膽紅素的配制 避光稱取晶體膽紅素20 mg，溶于0.1 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉溶液中，并加入雙蒸水0.9 mL，用0.5 mol/L鹽酸滴定調(diào)至pH8.5，濃度為20 mg/mL，于1 h內(nèi)使用。

1.4.2 膽紅素腦病動物模型的建立 隨機將30只7 d齡SD大鼠分為5組：腹腔注射生理鹽水組(T0組)、腹腔注射50 mg/kg膽紅素組(T1組)、腹腔注射100 mg/kg膽紅素組(T2組)、腹腔注射150 mg/kg膽紅素組(T3組)、腹腔注射200 mg/kg膽紅素組(T4組)，室溫環(huán)境母鼠哺育。

1.4.3 測定指標(biāo)

1.4.3.1 實驗大鼠的一般狀況 包括精神情況、皮膚顏色、對外界刺激的反應(yīng)及體重。

1.4.3.2 血清總膽紅素及S-100β濃度 造模24 h后，麻醉并心臟取血0.5 mL～1.0 mL，按說明書用化學(xué)氧化酶標(biāo)法測膽紅素，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測S-100 β。

1.4.3.3 腦組織膽紅素及S-100β濃度 造模24 h后，麻醉并灌洗，取腦組織，左側(cè)腦組織于冰醋酸中制成10%勻漿，以等體積丙酮抽提，測定方法同血清測定法。

1.4.3.4 腦組織HE染色 右側(cè)腦組織保存于4%多聚甲醛，室溫固定24 h，包埋切片，染色，光鏡下觀察腦組織形態(tài)。

1.4.3.5 原位末端標(biāo)記(TUNEL)法測神經(jīng)細(xì)胞凋亡率 選取5個視野計細(xì)胞總數(shù)及陽性細(xì)胞數(shù)，計算凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況分析 實驗前，各組大鼠皮膚顏色紅潤，行為表現(xiàn)未見異常。造模24 h后，T0組皮膚紅潤，活動正常；T1組皮膚欠紅潤，活動稍遲緩；T2組及T3組皮膚黃染，皮膚彈性較差，活動次數(shù)減少，對外界刺激反應(yīng)遲鈍，伴翻滾及俯伏；T4組皮膚黃綠色，皮膚彈性差，對外界刺激無反應(yīng)甚至昏迷，體重出現(xiàn)負(fù)增長。

2.2 各組大鼠血清及腦組織總膽紅素及S-100 β水平比較(見表1) T1組T2組血清S-100 β水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠血清、腦組織總膽紅素及S-100 β水平比較(±s)

2.3 腦組織病理變化 T0組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)正常；T1組可見神經(jīng)元細(xì)胞有較輕的腫脹、變形；T2組和T3組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)紊亂，數(shù)量較少，細(xì)胞腫脹、變形明顯，部分細(xì)胞核染色質(zhì)致密濃縮，胞漿空化，可見膠質(zhì)細(xì)胞；T4組可見細(xì)胞壞死，神經(jīng)元數(shù)量少。詳見圖1。

圖1 各組HE染色腦組織病理變化

2.4 各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率 隨著膽紅素濃度的增加，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率漸增。詳見圖2。T0組少見細(xì)胞凋亡，其他各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率與T0組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；T3組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率與T4組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

圖2 各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡陽性表達(×400)

表2 各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率(±s)%

3 討 論

高膽紅素血癥是新生兒期最常見的臨床病癥之一，主要由于膽紅素的產(chǎn)生及消除不平衡所致。Hachiya等[5]認(rèn)為膽紅素通過DNA氧化損傷影響膽紅素腦病急性期殼核及蒼白球，增加中腦、腦橋和延髓，尤其是紋狀體和海馬區(qū)血管密度，增加血管內(nèi)皮生長因子及受體-2、白蛋白外滲入腦實質(zhì)，同時誘導(dǎo)基底節(jié)、中樞和外周聽覺及視覺通路、海馬、間腦、MIC核、中腦、小腦和小腦蚓部的神經(jīng)元損傷及膠質(zhì)細(xì)胞增生[6]，但膽紅素腦病神經(jīng)損傷機制尚不清楚，無有效的治療藥物，仍有較高死亡率。為有效的治療和預(yù)防膽紅素腦病，需建立簡便可行、成功率高且具有良好模擬性的動物模型。

目前國內(nèi)外存在多種高膽紅素的動物模型。①基因突變(缺陷)模型。純合子Gunn大鼠，編碼葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的基因缺陷使游離膽紅素不能轉(zhuǎn)化為結(jié)合膽紅素，但膽紅素的濃度達不到膽紅素腦病的程度且基因突變存在潛在的影響[7]。②膽紅素經(jīng)靜脈或延髓注入。有研究顯示腦干中可見膽紅素結(jié)晶，但膽紅素在體內(nèi)存留時間短，不能模擬持續(xù)損害的過程且操作性差[8-9]。③皮下或腹腔注射鹽酸苯肼，通過溶血建立模型，但化學(xué)藥物同時損傷紅細(xì)胞及免疫系統(tǒng)[10]。

以腹腔注射膽紅素增加膽紅素來源，腸肝循環(huán)結(jié)合血漿白蛋白聯(lián)結(jié)膽紅素能力不足及肝細(xì)胞處理能力差的特點，模擬新生兒黃疸發(fā)生條件。本研究結(jié)果顯示：隨著大鼠血清和腦組織中膽紅素濃度的升高，大鼠的一般情況變差，表現(xiàn)為皮膚黃染加重，彈性變差，活動次數(shù)減少，對外界刺激反應(yīng)變差，體重增長幅度變小。此結(jié)果與李水冰等[11]的研究結(jié)果相符合。T3組與T4組血清及腦組織S-100 β水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，與Silva等[12]的研究結(jié)果一致。S-100 β是EF手型的鈣離子結(jié)合蛋白之一，是星形膠質(zhì)細(xì)胞增生標(biāo)志物。在細(xì)胞內(nèi)，低生理量的S-100 β 3.5倍增加，刺激細(xì)胞增殖、遷移，抑制細(xì)胞分化和凋亡，參與大腦、軟骨和骨骼肌的發(fā)育和修復(fù)；然而，神經(jīng)炎癥及脫髓鞘損傷后，S-100β釋放增加，通過細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)通路氧化應(yīng)激，激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)(呈劑量依賴性)增加近端啟動子的轉(zhuǎn)錄活性和增強內(nèi)源性晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)表達，暴露星形膠質(zhì)細(xì)胞Toll樣受體2(TLR2)、一氧化氮合酶(NOS)和白介素-1β(IL-1β)，從而加重組織損傷[13-16]。非結(jié)合膽紅素(UCB)誘導(dǎo)星型膠質(zhì)細(xì)胞白介素1(IL-1)、腫瘤壞死因子(TNF)等炎癥因子表達，降低少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(OPC)的生存分化及髓鞘形成[17-18]。目前多數(shù)研究認(rèn)為神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥與星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化有關(guān)[19]，不能單獨應(yīng)用血清膽紅素峰值來預(yù)測患兒預(yù)后(神經(jīng)性耳聾、智商、語言發(fā)育等)，這與不同神經(jīng)細(xì)胞對膽紅素的敏感程度不一有關(guān)。本實驗結(jié)果顯示：T3組與T4組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，推測凋亡是膽紅素誘發(fā)細(xì)胞早期損傷的重要方式，而后期的神經(jīng)改變則以突觸的神經(jīng)元缺失及壞死為主。

本實驗中7 d齡大鼠腹腔注射50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg和200 mg/kg膽紅素均可成功建立高膽紅素血癥模型，結(jié)合大鼠一般情況、血清及腦組織S-100 β含量、神經(jīng)細(xì)胞凋亡率及腦組織HE染色等，進一步認(rèn)為大鼠腹腔注射100 mg/kg和150 mg/kg膽紅素可復(fù)制出穩(wěn)定膽紅素腦病的模型，腹腔注射150 mg/kg膽紅素更適合膠質(zhì)細(xì)胞損傷研究。采用腹腔注射膽紅素的方法造模，重復(fù)性好，簡單易行且經(jīng)濟，進而治療高膽紅素血癥，預(yù)防膽紅素腦損傷，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減少神經(jīng)細(xì)胞損傷。