粉防己堿激活A(yù)kt/GSK-3b信號(hào)通路保護(hù)心肌I/R大鼠研究

張克清，戴珍，李彥萍

安陽(yáng)市中醫(yī)院心內(nèi)科，河南 安陽(yáng) 455000

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)是導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年超過(guò)2000萬(wàn)人死于冠心病，其中近一半死于急性心肌梗死(Acutemyocardial infarction，AMI)或心源性猝死[1]。AMI最有效的治療手段為及時(shí)疏通病變血管以恢復(fù)心肌組織的血流灌注，但隨之引發(fā)的心肌缺血/再灌注損傷(Ischemia/Reperfusion injury，I/R)成為臨床治療該病的難題，心肌I/R可導(dǎo)致心肌梗死面積進(jìn)一步擴(kuò)大，對(duì)遠(yuǎn)期預(yù)后造成很大影響[2]。蛋白激酶B/糖原合酶激酶-3b(Protein kinase B/Glycogen synthase kinase-3b，Akt/GSK-3b)通路是機(jī)體中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，廣泛參與細(xì)胞的增殖、存活、凋亡等生物學(xué)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，Akt磷酸化后可從胞膜上脫離，進(jìn)入胞質(zhì)與胞核中，調(diào)節(jié)GSK-3b、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、p70S6蛋白激酶(p70S6K)等的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮心肌保護(hù)功能[3～4]。粉防己堿是從中藥粉防己根部提取的生物堿，屬于雙芐基異喹啉衍生物。有關(guān)研究證實(shí)，粉防己堿具有抵抗心肌I/R的作用，但不清楚其具體保護(hù)機(jī)制[5]。故本研究通過(guò)建立心肌I/R大鼠模型，探究粉防己堿對(duì)I/R大鼠心肌梗塞面積、心臟功能及Akt/GSK-3b通路的影響，以期為AMI的治療尋求新的手段。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠180只，體質(zhì)量250～280 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXR(京)2015-0011。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 粉防己堿，分析標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。辛伐他汀膠囊(理舒達(dá))，規(guī)格：20mg，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20030103，購(gòu)自遠(yuǎn)大醫(yī)藥(中國(guó))有限公司。

1.3 試劑與儀器 水合氯醛(上?；瘜W(xué)試劑公司)；肌鈣蛋白T(Cardiac troponin T，cTnT)、肌酸激酶同工酶(Creatine kinase MB，CK-MB)、乳酸鹽脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒(北京中生北控生物科技有限公司)；氯化硝基四氮唑藍(lán)(Nitro Blue Tetrazolium Chloride，NBT)(上海前進(jìn)試劑廠)；組織蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；一抗兔抗鼠Akt、pAkt單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；一抗兔抗鼠GSK-3b、pGSK-3b多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG溶液、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)；TKR-200C小動(dòng)物呼吸機(jī)(江蘇省特力麻醉呼吸設(shè)備公司)；COBAS-FARAⅡ全自動(dòng)生化分析儀(瑞士Roche公司)；MICROM-HM340E病理組織切片機(jī)(德國(guó)Microm公司)；DY89-Ⅰ電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝科器研究所)；GE VividⅠ彩色多普勒超聲便攜機(jī)(GEHealthcare公司)。

1.4 分組與給藥處理 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為6組，包括假手術(shù)組、模型組、辛伐他汀組(陽(yáng)性藥組)以及粉防己堿低、中、高劑量組，每組30只。辛伐他汀組于造模前14天給予辛伐他汀2.0mg/(kg·d)，連續(xù)灌胃14天；粉防己堿低、中、高劑量組于造模前20min分別一次性腹腔注射給予粉防己堿1.5mg/kg、3.0mg/kg、6.0mg/kg；假手術(shù)組與模型組于造模前20min一次性腹腔注射給予等體積生理鹽水。

1.5 動(dòng)物模型制備 參考鄧宇珺等[6]方法建立心肌I/R大鼠模型。術(shù)前禁食不禁水12 h，用10%水合氯醛(0.3mL/100 g)腹腔麻醉大鼠，仰臥固定。檢測(cè)并記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖，頸、胸部備皮消毒，鈍性分離頸部皮膚暴露氣管，切開(kāi)氣管后立即行氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，條件設(shè)置95%O2、5%CO2、中等濕度的混合氣體以80次/min頻率進(jìn)行通氣；于3～4肋間鈍性開(kāi)胸暴露心臟，于左心耳與肺動(dòng)脈圓錐左側(cè)交界下方2～3mm處穿6/0號(hào)縫合線，進(jìn)針深1.5～2 mm、寬2～3 mm，并用“U形管”以壓管法活結(jié)結(jié)扎左冠脈前降支，肉眼可見(jiàn)心臟左室壁變暗變紫，同時(shí)心電圖顯示ST段明顯抬高(＞0.25mV)代表結(jié)扎成功。心肌缺血30min后，再灌注24 h，可見(jiàn)缺血區(qū)逐漸變紅，心電圖ST段降至0.15mV左右代表再灌注成功。假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎。

1.6 血清cTnT含量及CK-MB、LDH活性測(cè)定 再灌注24 h后，于大鼠腹部主動(dòng)脈采血，4℃、3 000 r/min離心10min，取上清液，分裝后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎肊LISA試劑盒檢測(cè)血清cTnT含量，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)；采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清CK-MB、LDH活性。

1.7 NBT染色法測(cè)定心肌梗死面積 采血后，剖胸取出大鼠心臟，用生理鹽水洗去心腔殘余血液，除去非心肌組織如脂肪、血管等，沿冠狀溝將心房切除，稱量左心室濕重。沿房室溝方向?qū)⒆笮氖覚M切至4～5片，浸入NBT磷酸緩沖液中，37℃恒溫水浴染色，直至完全染色后取出。染色后，正常心肌組織呈紫黑色，梗死心肌組織無(wú)染色。將梗死心肌組織切下，稱重，計(jì)算心肌梗死面積。心肌梗死面積=梗死心肌組織重量/左心室重量×100%。

1.8 超聲檢測(cè)心臟功能 再灌注24 h后，超聲檢測(cè)大鼠心臟功能。用10%水合氯醛(0.3mL/100 g)腹腔麻醉大鼠，仰臥固定于超聲臺(tái)，用小動(dòng)物心臟彩色超聲心動(dòng)圖檢查儀測(cè)定大鼠的左室舒張末期內(nèi)徑(Left ventricular internal diameter at diastole，LVIDd)和左室收縮末期內(nèi)徑(Left ventricular internal diameter at systole，LVIDs)，并經(jīng)電腦軟件自動(dòng)算出左室射血分?jǐn)?shù)(Left ventricularejection fraction，EF)。

1.9 Western blot檢測(cè)心肌組織 Akt、pAkt、GSK-3b、pGSK-3b蛋白表達(dá) 取左室前壁心肌組織，剪成碎片，常規(guī)提取心肌組織蛋白，BCA法定量蛋白以調(diào)節(jié)濃度。每組取蛋白樣品50μg上樣；SDS-PAGE電泳；轉(zhuǎn)至NC膜，將膜置于含5%脫脂奶粉TBST中，避光封閉1 h；漂洗后，將膜置于一抗稀釋液(Akt稀釋比1∶1 000、pAkt稀釋比1∶2 000、GSK-3b稀釋比1∶500、pGSK-3b稀釋比1∶500)中，4℃孵育過(guò)夜；漂洗后，將膜置于二抗稀釋液(1∶1 000)中，室溫振蕩孵育1 h；漂洗后，滴加ECL發(fā)光液，曝光3次，選取重疊值。用Image pro plus7.0軟件分析蛋白雜交條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參蛋白。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究利用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用(±s)表示，t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用“率”描述，用χ2檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 I/R大鼠模型制備成功情況 I/R模型制備總成功率為67.33%，模型組19只合格，辛伐他汀組22只合格，粉防己堿小劑量組20只合格，粉防己堿中劑量組19只合格，粉防己堿高劑量組21只合格。

2.2 各組大鼠血清cTnT含量及CK-MB、LDH活性檢測(cè)結(jié)果比較 見(jiàn)表1。與假手術(shù)組比較，模型組血清cTnT含量及CK-MB、LDH活性均顯著升高(P＜0.05)；與模型組比較，粉防己堿中、高劑量組及辛伐他汀組血清cTnT含量及CK-MB、LDH活性均顯著降低(P＜0.05)，而粉防己堿低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；隨著粉防己堿給藥濃度的升高，血清cTnT含量及CK-MB、LDH活性逐漸降低，呈劑量依賴性(P＜0.05)。

2.3 各組大鼠心肌梗死面積檢測(cè)結(jié)果比較 見(jiàn)圖1，表2。NBT染色后正常心肌組織呈紫黑色；梗死心肌組織呈蒼白色，定量分析發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組心肌梗死面積顯著增大(P＜0.05)；與模型組比較，粉防己堿中、高劑量組及辛伐他汀組心肌梗死面積均顯著減小(P＜0.05)，而粉防己堿低劑量組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；隨著粉防己堿給藥濃度的升高，心肌梗死面積逐漸減小，呈劑量依賴性(P＜0.05)。

表1各組大鼠血清cTnT含量及CK-MB、LDH活性檢測(cè)結(jié)果(±s)

表1各組大鼠血清cTnT含量及CK-MB、LDH活性檢測(cè)結(jié)果(±s)

與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別假手術(shù)組模型組粉防己堿低劑量組粉防己堿中劑量組粉防己堿高劑量組辛伐他汀組n 10 10 10 10 10 10 cTnT(ng/mL)0.83±0.08 1.62±0.17①1.48±0.15①1.34±0.20①②1.16±0.18①②1.12±0.22①②CK-MB(U/mL)752.46±104.24 1 053.37±215.32①891.65±164.77①862.42±126.83①②842.94±156.61②833.15±173.65②LDH(U/mL)1 119.48±213.56 1 594.62±315.22①1 458.34±205.36①1 332.45±212.98①②1 288.34±186.03②1 275.16±145.59②

圖1 各組大鼠心肌梗死情況

表2 各組大鼠心肌梗死面積檢測(cè)結(jié)果比較(±s)

表2 各組大鼠心肌梗死面積檢測(cè)結(jié)果比較(±s)

與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別假手術(shù)組模型組粉防己堿低劑量組粉防己堿中劑量組粉防己堿高劑量組辛伐他汀組n666666梗死面積比例(%)0 23.64± 4.29①18.57± 3.86①14.83± 4.10①②7.64± 0.89①②6.57± 1.27①②

2.4 各組大鼠心臟功能檢測(cè)結(jié)果比較 見(jiàn)圖2、表3。超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組心臟LVIDd、LVIDs均顯著增大(P＜0.05)；與模型組比較，粉防己堿低、中、高劑量組及辛伐他汀組心臟LVIDd、LVIDs均顯著減小(P＜0.05)；隨著粉防己堿給藥濃度的升高，心臟LVIDd、LVIDs逐漸減小，呈劑量依賴性(P＜0.05)。

2.5 各組大鼠心肌組織Akt、pAkt、GSK-3b、pGSK-3b蛋白表達(dá)結(jié)果比較 見(jiàn)圖3、表4。Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組心肌組織pAkt/Akt、pGSK-3b/GSK-3b比值顯著減小(P＜0.05)；與模型組比較，粉防己堿低、中、高劑量組及辛伐他汀組心肌組織pAkt/Akt、pGSK-3b/GSK-3b比值均顯著增加(P＜0.05)；隨著粉防己堿給藥濃度的升高，心肌組織pAkt/Akt、pGSK-3b/GSK-3b比值逐漸增加，呈劑量依賴性(P＜ 0.05)。

圖2 各組I/R大鼠心臟功能檢測(cè)結(jié)果

表3 各組大鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果(±s)

表3 各組大鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果(±s)

與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別假手術(shù)組模型組粉防己堿低劑量組粉防己堿中劑量組粉防己堿高劑量組辛伐他汀組n 8 8 8 8 8 8 LVIDd(cm)0.59±0.07 0.78± 0.04①0.66± 0.02①②0.61± 0.03①②0.56±0.02①②0.53±0.04②LVIDs(cm)0.36±0.05 0.47± 0.03①0.42± 0.02①②0.39± 0.02①②0.37± 0.02①②0.36± 0.03①②EF(%)77.72±12.51 49.24±8.67①53.06± 5.94①56.73±6.23 65.92± 3.55②72.65± 3.48②

圖3 各組大鼠心肌組織Akt、pAkt、GSK-3b、pGSK-3b蛋白表達(dá)結(jié)果比較

表4 各組大鼠心肌組織pAkt/Akt蛋白相對(duì)表達(dá)灰度值(±s)

表4 各組大鼠心肌組織pAkt/Akt蛋白相對(duì)表達(dá)灰度值(±s)

與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別假手術(shù)組模型組粉防己堿低劑量組粉防己堿中劑量組粉防己堿高劑量組辛伐他汀組n888888 pAkt/Akt 0.618±0.036 0.284± 0.043①0.436± 0.032①②0.784± 0.041①②0.967±0.048①②0.884± 0.044①②pGSK-3b/GSK-3b 0.638±0.037 0.312± 0.031①0.506± 0.034①②0.752± 0.039①②1.073± 0.048①②0.914± 0.042①②

3 討論

AMI的發(fā)生主要是由于冠狀動(dòng)脈阻塞而引起的心肌缺血，40～60歲的中老年人易患心肌缺血。盡快恢復(fù)缺血心肌組織的血流供應(yīng)是臨床治療AMI的有效方法，但I(xiàn)/R所引起的心肌損傷嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。I/R易造成心肌超微結(jié)構(gòu)及代謝發(fā)生變化，反而擴(kuò)大了心肌梗死面積，并加劇了心臟功能障礙[7～8]。粉防己堿作為一種生物堿，具有多種生物學(xué)功能[9]。本研究通過(guò)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支成功建立了I/R大鼠模型，從血清心肌酶活性、心肌梗死面積、心臟功能等方面，探討了粉防己堿對(duì)大鼠I/R的影響以及相關(guān)機(jī)制。

I/R會(huì)破壞細(xì)胞膜脂質(zhì)雙份子層，增加胞膜透過(guò)性，進(jìn)而造成細(xì)胞中眾多酶CK-MB、LDH等進(jìn)入血液[10～11]。隨著心肌損傷程度加重，血清心肌酶及cTnT有一定程度的上升[12～14]。本研究結(jié)果顯示，模型組血清cTnT含量、CK-MB活性、LDH活性均顯著高于假手術(shù)組，提示I/R大鼠心肌組織出現(xiàn)損傷。經(jīng)粉防己堿治療后cTnT、CK-MB、LDH活性降低，說(shuō)明粉防己堿有助于保護(hù)I/R大鼠心肌細(xì)胞，減輕心肌細(xì)胞膜受損程度以及心肌酶的釋放。NBT染色發(fā)現(xiàn)，正常心肌組織呈紫黑色，梗死心肌組織呈蒼白色；經(jīng)定量分析發(fā)現(xiàn)，模型組心肌梗死面積較假手術(shù)組顯著增大，經(jīng)粉防己堿治療后心肌梗死面積顯著減小，說(shuō)明粉防己堿有助于減少I/R大鼠的心肌梗死面積。心肌梗死后會(huì)造成心臟功能下降，受損程度與心肌梗死面積呈正相關(guān)[15]。模型組心臟LVIDd、LVIDs較假手術(shù)組均顯著增大，經(jīng)粉防己堿治療后心臟LVIDd、LVIDs顯著減小，說(shuō)明粉防己堿能保護(hù)心肌I/R損傷后的心臟功能，與辛伐他汀效果相當(dāng)。

大量研究顯示，Akt/GSK-3b信號(hào)通路在拮抗心肌缺血梗死方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[16～18]。Akt作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它可協(xié)同磷脂酰肌醇依賴性蛋白激酶1/2促進(jìn)三磷酸磷脂酰肌醇與其自身結(jié)合，Akt由胞漿轉(zhuǎn)移至質(zhì)膜，同時(shí)Akt位點(diǎn)Ser473與Thr308發(fā)生磷酸化，Akt蛋白激酶活性開(kāi)啟，被激活的Akt可活化下游一系列蛋白，如GSK-3b。GSK-3也是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，為糖原合成代謝的關(guān)鍵限速酶。GSK-3包括GSK-3a和GSK-3b兩種亞型，GSK-3a定位于染色體19q13.2上，其編碼蛋白的分子量為51 kDa；GSK-3b定位于染色體3q13.3上，其編碼蛋白的分子量為47 kDa。GSK-3高度保守，其兩種亞型的同源性高達(dá)84%。GSK-3不僅參與糖原的合成，而且在細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)、分化、凋亡等方面發(fā)揮重要作用[19]。研究顯示GSK-3b是位于Akt通路下游的一個(gè)重要信號(hào)蛋白，Akt通路能夠使GSK-3b的ser9發(fā)生磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致GSK-3b失去活性激活下游的靶分子，減少心肌梗死面積，抑制心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮保護(hù)心臟功能[20]。本研究結(jié)果顯示，模型組心肌組織 Akt/pAk、pGSK-3b/GSK-3b比值顯著減小，經(jīng)粉防己堿治療后心肌組織pAkt/Akt、pGSK-3b/GSK-3b比值逐漸增加，說(shuō)明Akt/pAk、pGSK-3b/GSK-3b與I/R大鼠心肌損傷有關(guān)，且粉防己堿保護(hù)I/R大鼠心肌組織可能與激活A(yù)kt/GSK-3b信號(hào)通路有關(guān)。然而心肌I/R發(fā)生發(fā)展機(jī)制復(fù)雜，粉防己堿緩解心肌I/R的具體作用機(jī)理還需深入探究。