和胃反流康對(duì)膽汁反流性胃炎大鼠胃黏膜IKKβ表達(dá)的影響

李玉鋒，谷文文，王垂杰

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032

膽汁反流性胃炎(Bile Reflux Gastritis，BRG)是由于胃與十二指腸動(dòng)力功能低下、幽門結(jié)構(gòu)功能不全導(dǎo)致十二指腸內(nèi)容物反流入胃，損傷胃黏膜，使胃黏膜發(fā)生充血、水腫、糜爛等病理改變[1]。現(xiàn)在西醫(yī)對(duì)BRG的發(fā)病原因以及發(fā)病機(jī)制尚不明確[2]，治療方案多采用質(zhì)子泵抑制劑，促胃動(dòng)力藥以及黏膜保護(hù)劑。中醫(yī)普遍認(rèn)為BRG屬于“胃脘痛”“吐酸”“嘈雜”范疇，和胃反流康為王垂杰教授通過多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)的經(jīng)方，臨床上獲得了患者的一致認(rèn)可，該方劑主要功效為疏肝利膽，益氣健脾，和胃降逆。本實(shí)驗(yàn)旨在通過檢測(cè)和胃反流康對(duì)

BRG大鼠模型的治療結(jié)果，探討其對(duì)胃黏膜的修復(fù)作用機(jī)制，為以后臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 和胃反流康藥物組成：蒲公英20 g，柴胡、炒白術(shù)、香附各15 g，陳皮、白芍、半夏、枳殼、茯苓、甘草各10 g，黃連6 g。水煎為1.18 g/mL藥液備用。裕爾(磷酸鋁凝膠)，規(guī)格20 g/袋，華裕(無錫)制藥有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字：H19991100，使用前稀釋為濃度0.54 g/mL水溶液。以上藥物均購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥局。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，購于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001。

1.3 主要試劑 牛黃膽酸鈉、胰蛋白酶、卵磷脂(北京索萊寶科技有限公司)；兔單克隆抗體IKKβ(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.4 動(dòng)物分組 將40只大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。分別為空白組，模型組，磷酸鋁凝膠組，和胃反流康組。

1.5 模型制備 反流液由牛黃膽酸鈉2.5 g，胰酶1.5 g，卵磷脂0.25 g溶于100mL蒸餾水中制得，現(xiàn)配現(xiàn)用。從實(shí)驗(yàn)第1天開始，除空白組外，其余各組大鼠均按照1.5mL/100 g體質(zhì)量比灌胃反流液以建立BRG大鼠模型，空白組大鼠灌胃等量蒸餾水，每天1次，共進(jìn)行35天。

1.6 給藥方法 磷酸鋁凝膠組與和胃反流康組于造模第2周開始灌胃給藥，每天于灌胃反流液6 h后按1mL/100g給藥，1次。

1.7 取材及檢測(cè)指標(biāo) 末次給藥結(jié)束后24 h禁食不禁水，行斷頸處死，暴露腹部，迅速于無菌環(huán)境下取出胃部，沿胃大彎剪開，用生理鹽水清洗胃內(nèi)容物后剪取胃竇部組織。通過Western blot法測(cè)定胃黏膜上皮IKKβ 蛋白表達(dá)。RT-PCR法檢測(cè)胃黏膜IKKβmRNA表達(dá)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件，計(jì)量資料以(±s)表示，不滿足正態(tài)性時(shí)選擇秩和檢驗(yàn)，滿足正態(tài)性則組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齊者采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者采用DunnettT3檢驗(yàn)。結(jié)果以P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況 空白組大鼠一般狀態(tài)良好，毛發(fā)光澤，活動(dòng)靈敏，進(jìn)食正常，大便呈球狀。模型組大鼠毛發(fā)枯黃雜亂，嗜臥懶動(dòng)，進(jìn)食量減少，大便稀溏，體質(zhì)量減輕。和胃反流康組及磷酸鋁凝膠組在治療過程中，毛發(fā)漸漸恢復(fù)光澤，進(jìn)食量和進(jìn)水量逐漸增加，體質(zhì)量均逐漸回升，但和胃反流康組大鼠效果較明顯。

2.2 各組大鼠胃竇部胃黏膜組織IKKβ蛋白表達(dá)比較 見表1。與空白組比較，模型組大鼠胃黏膜組織IKKβ蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，和胃反流康組、磷酸鋁凝膠組大鼠胃黏膜組織IKKβ蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與磷酸鋁凝膠組比較，和胃反流康組無明顯差異(P＞0.05)。

2.3 各組大鼠胃竇部胃黏膜組織IKKβmRNA表達(dá)比較 見表2。與空白組比較，模型組大鼠IKKβmRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，磷酸鋁凝膠組及和胃反流康組大鼠IKKβmRNA表達(dá)均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。和胃反流康組與磷酸鋁凝膠組胃黏膜IKKβ基因表達(dá)水平相比較，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠胃竇部胃黏膜組織IKKβ蛋白表達(dá)比較(±s)

表1 各組大鼠胃竇部胃黏膜組織IKKβ蛋白表達(dá)比較(±s)

與空白組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別空白組模型組磷酸鋁凝膠組和胃反流康組n 10 10 10 10 IKKβ蛋白0.418±0.029 0.723± 0.108①0.568±0.050②0.393± 0.058②

表2 各組大鼠胃竇部胃黏膜組織IKKβmRNA表達(dá)比較(±s)

表2 各組大鼠胃竇部胃黏膜組織IKKβmRNA表達(dá)比較(±s)

與空白組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01

組 別空白組模型組磷酸鋁凝膠組和胃反流康組n 10 10 10 10 IKKβmRNA 1.000±0.000 3.755± 0.608①1.899± 0.265②1.336± 0.084②

3 討論

BRG在中醫(yī)范疇里歸屬于胃脘痛、嘈雜、泛酸。王耘[3]認(rèn)為本病是肝胃郁熱之邪灼傷胃絡(luò)；《靈樞·四時(shí)氣》論述：“邪在膽，逆在胃，膽液泄則口苦，胃氣逆則嘔苦”?！稄埵厢t(yī)通》提出：“邪在膽經(jīng)，木善上乘于胃，吐則逆而膽汁上溢，所以嘔苦也?！庇纱丝梢?，肝膽氣機(jī)上逆，導(dǎo)致反流發(fā)生。

和胃反流康含有11味中草藥，柴胡功效和解表里，疏肝理氣，《本草綱目》中提到“柴胡宣暢氣血引清氣上行”，研究表明柴胡還具有緩解疼痛的作用[4]。香附理氣止痛，有研究表明香附揮發(fā)油能夠減輕小鼠胃內(nèi)燒灼痛[5]，香附柴胡二者共為君藥，相輔相成，共同緩解胃痛。香附還能夠增強(qiáng)胃動(dòng)力減少膽汁反流[6]；陳皮、枳殼二者來自同科不同種不同藥用部位，為臨床常用配伍，有理氣調(diào)中的功效，《本草匯言》謂“陳皮可理氣散寒，寬中行滯，健運(yùn)脾胃，暢利臟腑，為脾胃之圣藥?！薄度杖A子本草》介紹枳殼“健脾開胃，調(diào)五臟，下氣，止嘔逆?！背窗仔g(shù)、茯苓益氣健脾化濕，與柴胡為伍，具有抑木扶土之功效，與陳皮、枳殼共為臣藥。黃連擅清中焦肝膽郁熱，《本草綱目》“黃連去心火及中焦?jié)駸帷?，蒲公英清熱解毒，二者同為佐藥。半夏和胃降逆，《本草求真》：“半夏辛溫，能于脾中滌痰除垢，痰去而脾自健，故云能以健脾也?！卑咨逐B(yǎng)血柔肝，緩急止痛，甘草調(diào)和諸藥，諸藥相伍，以達(dá)疏肝利膽，益氣健脾，和胃降逆之功效。

IKK是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，由Ramana KV等[7]從胞漿中提取的高分子量絲氨酸特異性蛋白激酶復(fù)合物。IKK復(fù)合物(亦名IκB激酶復(fù)合體)包括 IKKα、IKKβ和 IKKγ ，其中IKKα和IKKβ是催化亞基，IKKγ是調(diào)節(jié)亞基[8]。在靜息狀態(tài)下，IKK處于無活性狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到病原微生物、應(yīng)激等刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的一部分上游激酶活化，繼而細(xì)胞內(nèi)IKK磷酸化被激活。目前研究發(fā)現(xiàn)IκB蛋白家族主要包括7 個(gè)成員，在哺乳動(dòng)物中起重要作用的為 IκBα ，IκBβ 和 IκBε[9]。IκBα是NF-κB活化過程中最強(qiáng)的負(fù)反饋因子[10]，NF-κB的活化發(fā)生和關(guān)閉都由IκBα保證，大部分的外界刺激因素都是通過IκBα的降解迅速而短暫地活化NF-κB。IκBα一旦缺失，則會(huì)顯著推遲已活化的NF-κB信號(hào)通路的終止。但是，IκBβ和IκBε卻能夠緩沖系統(tǒng)活化的波動(dòng)趨勢(shì)，使NF-κB保持一個(gè)相對(duì)較長(zhǎng)的響應(yīng)時(shí)間[11]。在經(jīng)典的NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，IKKα并不是必需的，而IKKβ的活化則起到了至關(guān)重要的作用[12]。IKKβ是促炎性細(xì)胞因子刺激誘導(dǎo)激活NF-κB的主要激酶[13]，IKKβ的缺失會(huì)嚴(yán)重影響NF-κB的活化。IKKβ 在NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用[14]。

鐘國新等[15]曾通過穴位埋線對(duì)慢性萎縮性胃炎模型大鼠的治療總結(jié)提出：在IKKβ/NF-κB通路中，IKKβ活化被抑制，則IκB降解也被抑制，這樣能夠有效減少NF-κB活化，從而減輕胃黏膜損傷。本實(shí)驗(yàn)中，BRG大鼠的胃黏膜組織IKKβ表達(dá)明顯降低，可以合理推測(cè)和胃反流康可能通過下調(diào)IKKβ基因的表達(dá)，來抑制各種促炎因子基因的表達(dá)，以減輕各種炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，從而起到保護(hù)胃黏膜的作用。