不同雞品種BLEC1基因序列比較分析

張 莘，常國斌，鄭圣晗，王統(tǒng)苗，陳博雯，張 揚，王志秀，陳國宏

(揚州大學 動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009)

雞主要組織相容性復合體(MHC，Major histocompatibility complex)與機體多種疾病抗性和免疫系統(tǒng)關系密切[1-2]。BLEC1基因(C-type lectin-like receptor 1)位于雞MHC核心區(qū)域，編碼C型凝集素區(qū)域[3]，與CD69家族的激活抗原相關，最接近于人LLT1基因和小鼠Clr基因家族[4]，BLEC1基因RNA有廣泛的組織分布，并且脾細胞激活后顯著上調[5]。C型凝集素是免疫應答中具有多種功能的蛋白質[6-7]，BLEC1氨基酸序列與C型凝集素第Ⅴ組的受體有很大的同源性，C型凝集素第Ⅴ組的受體包括C型凝集素類似NK受體，許多C型凝集素類似NK受體能結合MHC Ⅰ類分子[3，8]，所以，BLEC1基因對于先天性免疫和抗病性有重要作用。有文獻報道，雞MHC具有1對凝集素樣受體基因，一個是NK受體，另一個是激活抗原，與人類和小鼠基因組的NK復合體(NKC)轉錄方向相反[5，9]。Bernot等[10]發(fā)現(xiàn)，類似MHC區(qū)域的Rfp-Y區(qū)域有許多凝集素類似物基因，且其中有幾個基因與BLEC1基因類似[11]，但是通過對雞的基因組序列分析，研究人員并沒有發(fā)現(xiàn)與BLEC1基因類似的基因[12]，BLEC1基因與雞抗病性的關系還不明晰。目前，國內外針對BLEC1基因的研究相對較少，而BLEC1基因在雞上的研究對其抗病育種有重要意義，同時雞肉又是我國的重要肉源之一。

本研究通過目標捕獲測序，篩選出BLEC1基因的Indels、SNPs位點以及對應氨基酸的變化，為了探究該基因在不同雞品種中的遺傳多樣性，對該基因進行系統(tǒng)聚類比對分析，希望可以為家禽抗病育種和免疫遺傳學提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究使用的26個雞品種分別是：紅色原雞(RJ)亞種、如皋雞(RC)、茶花雞(CH)、安卡雞(AK)、藏雞(ZC)、AA雞(AA)、白耳雞(BE)、仙居雞(XJ)、羅斯雞(RS)、綠殼蛋雞(GC)、SPF-來航雞(LH)、太湖雞(TH)、斗雞(DJ)、蕭山雞(XC)、溧陽雞(LC)、北京油雞(BY)、鹿苑雞(LY)、固始雞(GS)、雪山草雞(XS)、黑狼山雞(HL)、泰和烏骨雞(WG)、大骨雞(BB)、青腳麻雞(QJ)、文昌雞(WC)、廣西黃雞(GH)、隱性白羽雞(RW)26個雞品種中紅色原雞(RJ)亞種來自云南省野生動物救護中心，仙居雞(XJ)、茶花雞(CH)、北京油雞(BY)、鹿苑雞(LY)、蕭山雞(XC)、白耳雞(BE)、泰和烏骨雞(WG)、藏雞(ZC)、黑狼山雞(HL)、固始雞(GS)、斗雞(DJ)、大骨雞(BB)12個地方雞品種來自中國農業(yè)科學研究院家禽科學研究所國家地方禽種資源基因庫，其余雞品種均來自揚州大學動物科學與技術學院遺傳資源實驗室禽種資源基因庫。

1.2 DNA提取

每個雞品種翅靜脈采血1 mL，置于2 mL離心管中，離心管中盛有0.1 mL的肝素鈉抗凝劑，共收集10個樣本，用苯酚和氯仿法提取DNA，選擇完整性好(無拖尾現(xiàn)象)，OD值介于1.8～2.0的DNA樣品稀釋至50 ng/μL，4 ℃冷藏保存。

1.3 BLEC1基因序列分析與進化樹構建

將DNA樣品送深圳華大基因公司進行目標序列捕獲測序，獲得序列以NCBI(National Center of Biotechnology Information)中紅色原雞(Gallusgallus)為標準基因庫，并用MEGA 6軟件對26個雞種BLEC1基因序列進行對比分析，篩選BLEC1基因的SNPs位點和Indels位點，最后運用鄰接法(Neighbour joining)系統(tǒng)聚類分析26個雞品種構建進化樹(Phylogenetic tree)。

2 結果與分析

2.1 BLEC1基因序列分析

為了探究我國地方雞種BLEC1基因中堿基序列，筆者查詢了NCBI中紅色原雞的堿基，并以此為參考序列，序列號為NC_006103.4。由圖1可知，紅色原雞的BLEC1基因位點118 439-122 492，共4 054 bp，外顯子5個，內含子4個。通過對比可知(表1)，在26個雞品種中BLEC1基因內含子上有59個Indels位點和45個SNPs位點，外顯子上有53個Indels位點和16個SNPs位點，由此可見BLEC1基因有較好的多態(tài)性。

2.2 不同雞品種中BLEC1基因SNPs位點統(tǒng)計分析

雞種測序所得的SNPs如表2所示，共發(fā)現(xiàn)14個SNPs，主要位于Exon1、Exon2、Exon5和內含子上，其中有5個SNPs位于外顯子上，其余SNPs均位于內含子中。且在外顯子中氨基酸有3個發(fā)生錯義突變，其余為同義突變。

圖1 NCBI中紅色原雞 BLEC1基因序列Fig.1 BLEC1 gene sequences in Gallus gallus

表1 BLEC1基因外顯子和內含子上SNPs和Indels分布情況Tab.1 Nucleotide variations in exons and introns of BLEC1 gene

表2 BLEC 1基因SNPs、氨基酸信息Tab.2 SNPs and amino acid information of BLEC 1 gene

表3顯示了各雞種BLEC1基因SNPs的分布情況，對BLEC1外顯子SNPs進行分析發(fā)現(xiàn)，SNP5存在于泰和烏骨雞、SPF-來航雞、北京油雞、太湖雞、紅色原雞亞種、青腳麻雞和鹿苑雞中，SNP1和SNP2只在雪山草雞和鹿苑雞中檢測到，安卡雞、SPF-來航雞和泰和烏骨雞的突變位點一致為SNP3，鹿苑雞和SPF-來航雞有3個SNPs位點，雪山草雞和泰和烏骨雞有2個SNPs位點，Exon2上的SNP4位點只在蕭山雞和SPF-來航雞中發(fā)現(xiàn)，國外雞品種中AA雞、羅斯雞和隱性白羽雞均沒有發(fā)現(xiàn)SNPs位點。隨后，筆者對該基因內含子進行分析，SNP10在固始雞、如皋雞、藏雞等10個雞品種中檢測到，蕭山雞、綠殼蛋雞、太湖雞等17個雞品種含有SNP14，SPF-來航雞內含子上有6個SNPs位點，在所有雞品種中最多，蕭山雞、安卡雞、SPF-來航雞和泰和烏骨雞的突變位點大體一致。其他雞品種，包括國外雞品種如羅斯雞和AA雞均沒有檢測到SNPs位點。鹿苑雞、蕭山雞、SPF-來航雞等雞種在外顯子的SNPs位點較多，且導致了氨基酸變化，抗性較好的雞種SNPs普遍多于抗性差的雞種，表明BLEC1基因的SNPs位點與雞種的抗病力密切相關。

2.3 不同雞品種中BLEC1基因Indels位點統(tǒng)計分析

在不同雞品種BLEC1基因的Indels分布中，BLEC1基因的插入缺失發(fā)生在Exon1和內含子中(表4)，12處插入缺失中有3處發(fā)生在外顯子上，且在雞種中廣泛存在(表5)，除黑狼山雞外，其余雞品種中均存在Indel1位點，同時Indel3存在于除雪山草雞和鹿苑雞外的所有雞種中，這些都導致BLEC1基因Exon1翻譯產物發(fā)生巨大的變化，而且在BLEC1內含子上，除蕭山雞外，其余雞品種都篩選出Indels位點，這些都表示BLEC1基因具有極高的多態(tài)性。

表3 不同雞品種 BLEC 1基因的SNPs分布情況Tab.3 SNPs distribution of BLEC 1 gene in different breeds

注：“+”表示存在；空白表示不存在。表5同。
Note：“+”Indicates existence;Blank indicates no existence.The same as Tab.5.

表4 BLEC 1基因Indels信息Tab.4 Indels information of BLEC gene

注：D和I分別代表堿基缺失和插入；“/”后面表示缺失或插入的序列。
Note：D and I represent base deletions and insertions，respectively； “/” after that are the sequence of deletions and insertions.

表5 不同雞品種BLEC 1基因的Indels分布情況Tab.5 Indels distribution of BLEC 1 gene in different breeds

2.4 不同雞品種中BLEC1基因系統(tǒng)聚類分析

將不同雞品種的BLEC1基因用MEGA 6軟件運用鄰接法構建NJ(Neighbour-joining)進化樹，如圖2所示，樹枝的長度代表了樹的距離，樹枝上顯示Bootstrap 1 000個循環(huán)設置的置信度。由圖2可知，26個雞品種大致分為3類，其中，安卡雞、SPF-來航雞和泰和烏骨雞聚為一類；蕭山雞單獨為一類；其余雞種聚為一類。我國地方雞品種中，BLEC1基因具有豐富的遺傳多樣性，不同雞品種的抗病性和免疫能力可能存在差異。

圖2 不同雞種NJ系統(tǒng)進化樹(Bootstrap=1000)Fig.2 NJ phylogenetic tree of differentbreeds(Bootstrap = 1000)

3 討論

BLEC1基因是迄今為止描述的任何非哺乳動物C型凝集素與特定哺乳動物NKC編碼受體序列同一性最接近的基因，且BLEC1基因和BNK基因與特定的哺乳動物NKC編碼受體的相關性比其他雞C型凝集素更密切[5]，在迄今為止研究的任何哺乳動物的MHC中沒有鑒定到C型凝集素基因，表明BLEC1基因可能與雞的先天免疫性能有一定的關聯(lián)。本研究結果表明，在BLEC1基因的5個外顯子中，SNPs主要存在于Exon1、Exon2、Exon5，Exon3和Exon4沒有堿基突變，同時5個存在于外顯子的SNPs位點中有3個導致氨基酸發(fā)生錯義突變，可能導致單元型之間的功能能力差異以支持免疫影響疾病易感性的反應，這與Shiina等[12]的研究結果一致。寧官保等[13]研究表明，BLEC1基因的表達與雞馬立克病(MD)耐受性有著密切的關系，又有研究表明，我國許多地方家禽品種擁有較強的抗病性狀和免疫能力，且對馬立克氏病的抗性較高[14]，本研究中，SNPs位點基本集中在鹿苑雞、雪山草雞、SPF-來航雞等抗病性強的雞種上，所以，這些SNPs位點可能與雞的抗病性有關。國外雞品種中AA雞和羅斯雞不存在任何突變位點，這可能與其為國外雞種起源不同且抗病性差有關。同時在Exon1上存在多個插入缺失位點，表明BLEC1基因多態(tài)性主要集中于Exon1，Indel1存在于除黑狼山雞以外的所有雞種中，所以，Indel1可以作為雞免疫特性的候選標記。基因中內含子并不參與蛋白質的編碼，但是有研究表明，內含子對蛋白質的調控和編碼序列有重要作用[15-17]。26個雞品種中BLEC1基因的內含子上有45個SNPs位點和59個Indels位點，可能與該基因的表達調控有關。以上這些都顯示出BLEC1基因具有較高的多態(tài)性，可能和雞的抗病性有關。

有研究報道，中國地方雞種的雜合度值明顯高于其他蛋雞、肉雞等商業(yè)品系及歐洲地區(qū)的部分地方雞種[18-20]。從NJ進化樹中可以看出，安卡雞、SPF-來航雞和泰和烏骨雞聚為一類，在這3個雞種都含有SNP3和SNP9，且這2個位點不存在于其他雞種中；蕭山雞自成一類可能是因為其在1999年被確認滅絕[21]，且在本試驗中只有蕭山雞未篩選出Indels位點，所以BLEC1基因上的Indels位點影響了基因的表達調控；在剩余雞種中，鹿苑雞和青腳麻雞有極高的同源性，這2種雞都具有適應性廣、抗病性強的特性，所以聚類在一起，在陳穎等[22]的研究結果中，茶花雞、藏雞、仙居雞、白耳雞聚在一類，這與本研究結果相同。我國地方雞品種BLEC1基因具有遺傳多樣性，且與雞種的抗病性有關，但是雞BLEC1基因與疾病間具體的關聯(lián)機制還需進一步研究探討。