清氣化痰湯對哮喘小鼠肺組織TLR4和MUC5AC表達(dá)影響

陳 竹, 彭 玉,陶 瓊, 吳 敏, 羅貞清，李圣鉆

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是全球威脅公眾健康的常見慢性呼吸道疾病，其發(fā)病率呈逐年增高趨勢[1]。兒童是哮喘的高發(fā)人群，近年來我國0～14歲兒童哮喘患病率平均為3.02%，較十年前增加了53.3%[2]。迄今哮喘的發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，哮喘發(fā)作時痰液易生難消，成為中西醫(yī)治療中的難點(diǎn)。清氣化痰湯臨床運(yùn)用能有效緩解痰熱壅肺所致咳嗽、痰鳴諸癥。前期的研究[3]證實(shí)該方能抑制炎癥介質(zhì)的釋放，減少肺組織中炎性滲出，減輕肺組織損傷，但減少哮喘痰液生成的具體機(jī)制不明確。基于TLRs在哮喘的發(fā)生發(fā)展中起著較為重要的作用[4]，該實(shí)驗(yàn)通過對小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid,BALF)中多種炎性介質(zhì)的檢測、肺組織中TLR4基因和蛋白表達(dá)、黏蛋白MUC5AC基因和蛋白的表達(dá)觀察，探討清氣化痰湯對哮喘模型小鼠氣道黏液高分泌表達(dá)的干預(yù)機(jī)制，為臨床運(yùn)用清氣化痰湯治療小兒哮喘提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 BALB/c小鼠，雌性，4～6周齡，SPF級，合格證號SYXK(黔)2012-001，購自貴州省實(shí)驗(yàn)動物工程中心。

1.1.2清氣化痰湯制備 清氣化痰湯由膽南星、全瓜蔞、法夏、浙貝、枳殼、陳皮、茯苓、杏仁等10味中藥組成，用該方540 g克加水900 ml 煎煮，濾出藥液，藥渣加500 ml再煎煮濾出，合并兩次濾液濃縮至100 ml。

1.1.3試劑和試劑盒 2% Aluminium Hydroxide Gel Adjuvant購自美國Invivogen公司(Lot #5113)；卵清白蛋白(albumin from chicken egg white, OVA)購自美國Sigma公司(批號1001988500)；注射用地塞米松磷酸鈉購自馬鞍山豐原制藥有限公司(批號150512-1)；小鼠腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)(JEM-12)、白介素(interleukin，IL)-4(JEM-04)和IL-5(JEM-03)定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自安徽巧伊生物科技有限公司；小鼠IL-13定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自聯(lián)科生物科技有限公司(221341235)；動物組織總RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司(#03901)；Prime ScriptTMRT reagent Kit 和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ購自日本TaKaRa公司；兔抗TLR4多克隆抗體(BA1717)、兔抗MUC5AC多克隆抗體(BA3293)購自武漢博士德生物工程有限公司；GTVisionⅢ抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒購自基因科技(上海)有限公司(批號2015121601)。

1.2方法

1.2.1哮喘小鼠模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)文獻(xiàn)[5]的方法并予以改進(jìn)建立哮喘模型：第1、8、15天腹腔注射OVA及氫氧化鋁凝膠混合液0.2 ml(內(nèi)含OVA 60 μg及2.25 mg氫氧化鋁凝膠)致敏；第21天開始用5%OVA溶液8 ml行超聲霧化，每次30 min，連續(xù)霧化5 d進(jìn)行激發(fā)。實(shí)驗(yàn)分組，45只小鼠分為5組，每組9只：① 正常組(CON組)，用生理鹽水代替OVA進(jìn)行致敏和霧化，不給藥；② 哮喘組( MOD組)，按上述方法進(jìn)行致敏和激發(fā)，不給藥；③ 地塞米松組(TRE組)，按上述方法進(jìn)行致敏和激發(fā)，于每次激發(fā)前30 min腹腔注射地塞米松(0.5 mg/kg)；④ 清氣化痰湯治療組(X1組)，按上述方法進(jìn)行致敏和激發(fā)，于每次激發(fā)前30 min灌胃給予清氣化痰湯0.01 ml/g；⑤ 清氣化痰湯和地塞米松聯(lián)合治療組(X2組)，按上述方法進(jìn)行致敏和激發(fā)，于每次激發(fā)前30 min灌胃給予清氣化痰湯0.01 ml/g，腹腔注射地塞米松(0.25 mg/kg)。于治療后第6天處死小鼠3只/組，分別稱小鼠體重和肺組織重量并記錄；同時摘眼球取血并制備血清凍存于-20 ℃；從氣管注射無菌生理鹽水 0.5 ml入肺，抽吸3次后將抽出液體即BALF凍存于-20 ℃；取右下肺葉置于4%多聚甲醛中固定；余下肺組織凍存于-80 ℃。各組小鼠不再激發(fā)，隔天給予相應(yīng)藥物1次，持續(xù)5次后，處死小鼠，留存標(biāo)本及相應(yīng)檢查同前。

1.2.2肺組織TLR4和MUC5AC mRNA的檢測 采用Real-time PCR法，TLR4上游引物：5′-CAGCAAAGTCCCTGATGACA-3′；下游引物：5′-AGAGGTGGTGTAAGCCATGC-3′；MUC5AC上游引物：5′-ACACCGCTCTGATGTTCCTCACC-3′；下游引物：5′-ATGTCCTGGGTTGAAGGCTCGT-3′；GAPDH上游引物：5′-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3′；下游引物：5′-GCGGCACGTCAGATCCA-3′。每個樣品各取約20 mg肺組織，參照說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以2 μl cDNA為模板行Real-time PCR檢測。反應(yīng)條件：預(yù)變性(95 ℃，30 s)，PCR反應(yīng)(40個循環(huán)，95 ℃，5 s；52 ℃，30 s)。確定Real-time PCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線，記錄各組的Ct值。分別以GDPDH為內(nèi)參，計(jì)算各組樣本中MUC5AC、TLR4基因的表達(dá)量，并對表達(dá)量的比值(2-ΔΔCt)進(jìn)行分析。

1.2.3肺組織TLR4和MUC5AC蛋白的檢測 常規(guī)方法制備肺組織石蠟切片，采用免疫組化SP法進(jìn)行操作。陽性部位成棕褐色。采用Image-Pro Plus圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，取平均積分光密度值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.2.4血清及BALF中TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量檢測 根據(jù)試劑盒說明書方法進(jìn)行，根據(jù)檢測結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣品中指標(biāo)因子的含量，制作柱形圖。

2 結(jié)果

2.1小鼠肺組織TLR4和MUC5ACmRNA的表達(dá)qRT-PCR的結(jié)果顯示，MOD組肺組織TLR4基因在治療第5天或15天時較CON組上調(diào)，而治療TRE組、X1組和X2組可下調(diào)TLR4基因的表達(dá)；MOD組肺組織MUC5AC 基因表達(dá)在治療第5天或15天時均明顯增高，治療TRE組、X1組和X2組可下調(diào)MUC5AC基因的表達(dá)，見圖1。

圖1 清氣化痰湯對哮喘小鼠肺組織TLR4和MUC5AC mRNA表達(dá)的影響

2.2小鼠肺組織TLR4和MUC5AC蛋白的表達(dá)TLR4蛋白表達(dá)在上皮細(xì)胞表面，MUC5AC蛋白主要表達(dá)在支氣管上皮細(xì)胞，存在于胞質(zhì)內(nèi)，陽性染色表現(xiàn)為棕褐色顆粒。治療5 d或15 d后，MOD組肺組織TLR4蛋白表達(dá)強(qiáng)于TRE組、X1組和X2組，以TRE組和X2組顯著(P<0.01)(圖2)；MOD組肺組織MUC5AC 蛋白表達(dá)明顯高于CON組，而TRE組、X1組和X2組肺組織這兩種蛋白的表達(dá)均下調(diào)，以TRE組和X2組下調(diào)顯著(P<0.01)(圖3)。

圖2 清氣化痰湯對哮喘小鼠肺組織TLR4蛋白表達(dá)的影響 ×200

圖3 清氣化痰湯對哮喘小鼠肺組織MUC5AC蛋白表達(dá)的影響 ×200

2.3小鼠血清中TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量在治療后第5天和第15天時，MOD組血清的TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量均顯著高于CON組，TRE組和X2組的血清的TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量顯著下調(diào)，單獨(dú)應(yīng)用清氣化痰湯的X1組血清的TNF-α、IL-4、IL-5亦較MOD組的含量降低(P<0.05)。以上下調(diào)作用以清氣化痰湯和地塞米松聯(lián)用的X2組更為顯著(P<0.01)(圖4)。

2.4小鼠BALF中TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量在治療后第5天和第15天時，MOD組BALF中的TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量均較CON組明顯增高，TRE組和X2組的血清的TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量下調(diào)，單獨(dú)應(yīng)用清氣化痰湯的X1組血清的IL-5和IL-13亦較MOD組的含量降低(P<0.05)。以上下調(diào)作用以清氣化痰湯和地塞米松聯(lián)用的X2組更為顯著(P<0.01)(圖5)。

圖4 清氣化痰湯對哮喘小鼠血清中的TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子含量的影響

圖5 清氣化痰湯對哮喘小鼠BALF中的TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子含量的影響

3 討論

支氣管哮喘，是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征的異質(zhì)性疾病[6]，氣道黏液高分泌是其重要的病理特征。氣道黏液(mucus)由氣道杯狀細(xì)胞和黏膜下腺體分泌細(xì)胞生成，杯狀細(xì)胞是產(chǎn)生黏液的重要細(xì)胞，它將粘蛋白快速分泌到氣道的表面，使氣道內(nèi)持續(xù)過度分泌黏液，導(dǎo)致并加重呼吸道氣流阻塞，加速肺功能下降。同時，氣道儲留的黏液為細(xì)菌生長提供了良好培養(yǎng)基，易導(dǎo)致呼吸道感染的發(fā)生并難以控制[7]。MUC5AC是由杯狀細(xì)胞產(chǎn)生，氣道上皮MUC5AC蛋白的含量和MUC5AC mRNA代表氣道黏液分泌的程度。研究顯示哮喘氣道杯狀細(xì)胞增生明顯，同時肺組織中的MUC5AC蛋白的含量和MUC5AC mRNA也明顯升高，MUC5AC被認(rèn)為是哮喘氣道杯狀細(xì)胞增生和分泌亢進(jìn)的主要標(biāo)志，是影響哮喘病情發(fā)展及其預(yù)后的獨(dú)立危險因素[8-9]。

TLRs介導(dǎo)天然免疫并連接獲得性免疫，TLRs 基因多態(tài)性與哮喘個體的易感性和嚴(yán)重程度密切相關(guān)[10]，往往決定了個體對過敏原的敏感性[11]。TLRs在氣道炎癥的調(diào)節(jié)中有重要意義，其中TLR4承擔(dān)了重要作用。實(shí)驗(yàn)證明，TLR4主要分布在氣道上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞等[12]，能激發(fā)一系列信號通路，促進(jìn)炎癥的發(fā)生及加重[13]。研究[14]顯示，TLR4 基因多態(tài)性特征中TLR4/TRIF信號通路可激活NF-κB，導(dǎo)致炎癥因子如TNF-α、IL-4、IL-6等炎癥因子增加，上調(diào)粘蛋白基因轉(zhuǎn)錄或刺激氣道上皮杯狀細(xì)胞和黏膜下腺體細(xì)胞增生，使氣道黏液分泌增加，并引起嚴(yán)重的氣道炎癥和氣道重塑。

痰易生難消是目前治療哮喘的一個難點(diǎn)，中醫(yī)認(rèn)為痰伏儲于氣道是哮喘發(fā)生和加重的病理基礎(chǔ)。結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對哮喘因病機(jī)的認(rèn)識，推測哮喘“痰飲伏肺”的中醫(yī)病理特征與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)哮喘氣道炎癥、氣道黏液高分泌表達(dá)存在必然的聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，清氣化痰湯可在基因和蛋白水平下調(diào)TLR4的表達(dá)，使血清和BALF中的促炎因子TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13的含量均下調(diào)，提示清氣化痰湯可通過調(diào)節(jié)TLR4的表達(dá),干預(yù)哮喘小鼠的免疫應(yīng)答，繼而影響炎癥因子的釋放，減輕哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)。

同時，研究顯示MOD組肺組織TLR4、MUC5AC基因及蛋白的表達(dá)水平在治療第5天或第15天時較CON組上調(diào)，且隨哮喘時間延長而顯著增加，說明哮喘時氣道黏液存在高分泌，與文獻(xiàn)[15]報道一致，這與中醫(yī)認(rèn)為“夙痰伏于肺，遇觸即發(fā)”的病機(jī)有一致性。治療TRE組、X1組和X2組可下調(diào)MUC5AC基因的表達(dá)，說明清氣化痰湯可通過下調(diào)肺組織MUC5AC的基因和蛋白表達(dá)，緩解氣道黏液高分泌。

本研究結(jié)果表明，清氣化痰湯可能通過TLR4/ TRIF信號通路抑制NF-κB，下調(diào)TLR4和MUC5AC的表達(dá)以拮抗哮喘氣道炎癥反應(yīng)、減輕氣道黏液高分泌，從而有效緩解哮喘發(fā)作時痰液壅盛所致的痰多、咳嗽、喘息等癥。但研究顯示清氣化痰湯不論是在干預(yù)炎癥因子的釋放還是在減輕氣道黏液高分泌方面與地塞米松聯(lián)用時具有協(xié)同作用，其作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。

名老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)思想和臨床經(jīng)驗(yàn)是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的精髓，也是現(xiàn)代中醫(yī)文化傳承的重要內(nèi)容。很多名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方的臨床療效確切，但由于其作用機(jī)制未闡明，限制和束縛了臨床的廣泛運(yùn)用。探討清氣化痰湯多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的治療作用，研究其在減少氣道黏液生成，減輕氣道重塑的作用機(jī)制，不僅為名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，也為治療兒童哮喘提供了新的治療思路和手段。