火把花根對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟Angptl2和NF-κB表達(dá)的影響

方玲娜，盧 冰，張 莉，沈莉雯，沈鮮安，朱文華，嚴(yán) 言，唐楓燕，鐘 紹

(江蘇大學(xué)昆山醫(yī)院，江蘇 昆山 215300)

糖尿病腎病是常見的糖尿病慢性并發(fā)癥，多種細(xì)胞因子和炎癥因子參與其發(fā)病和發(fā)展[1]。血管生成素樣蛋白2(Angptl2)是血管生成素樣蛋白之一，在心臟、腎臟、脂肪等組織表達(dá)，能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞出芽[2]，與血管生成有關(guān)，且其參與炎癥反應(yīng)，是炎癥反應(yīng)通路中的遞質(zhì)[3]；而核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)是炎癥反應(yīng)通路中重要的調(diào)節(jié)因子?；鸢鸦ǜ哂锌寡?、抗免疫作用，本研究通過觀察火把花根對(duì)糖尿病腎病大鼠蛋白尿及腎臟組織中Angptl2和NF-κB的影響，探討了火把花根對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡Wistar雄性大鼠40只，體質(zhì)量(200±10)g，購(gòu)于常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(蘇)2011-0003。

1.2藥物及試劑和儀器 火把花根粉(陜西斯諾特生物技術(shù)有限公司)，厄貝沙坦片(安博維，Sanofi-anvitis公司，法國(guó))。鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司，美國(guó))，PAS染液試劑盒(南京建成科技公司)，一抗兔抗大鼠Angptl-2和兔抗大鼠NF-κB抗體(abcam公司，英國(guó))，二抗羊抗兔抗體(abcam公司，英國(guó))，倒置顯微鏡(Leica公司，德國(guó))，透視電鏡(JEOL公司，日本)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，從中隨機(jī)取10只作為正常組，其余大鼠空腹一次性腹腔注射STZ 55 mg/kg(溶于0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液，pH 4.4)制備糖尿病腎病模型，以尿蛋白試紙測(cè)尿蛋白()為造模成功。將造模成功的27只大鼠隨機(jī)分為安慰劑組、厄貝沙坦組和火把花根組，每組9只，室溫下標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，自由飲水，4周后，厄貝沙坦組和火把花根組分別灌胃厄貝沙坦50 mg/kg、火把花根4 g/kg(參照文獻(xiàn)[4]中給藥劑量)，正常組和安慰劑組灌胃等量蒸餾水，均1次/d，干預(yù)8周。

1.4標(biāo)本收集與指標(biāo)測(cè)定 將大鼠置于代謝籠內(nèi)留取24 h尿液，測(cè)定各組灌胃后每周尿蛋白水平。灌胃結(jié)束后處死大鼠，取腎臟。

1.4.1腎臟組織病理觀察 ①取部分腎臟組織經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋后切片，脫蠟，水洗后分別進(jìn)行PAS和HE染色，光鏡下觀察各組腎臟組織的病理改變。②取部分腎臟組織用5%戊二醛固定，常規(guī)脫水、包埋、切片，采用JEM1230透視電鏡觀察。

1.4.2腎臟組織中Angptl2和NF-κB表達(dá)檢測(cè)采用二步法，腎組織石蠟切片脫蠟水化，固定后通過3% H2O2/PBS滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS漂洗后浸入檸檬酸鹽緩沖液修復(fù)，5%BSA封閉，加入稀釋后一抗(稀釋比例1∶100)4 ℃過夜孵育，洗片后再加入稀釋后二抗(稀釋比例1∶1 000)37 ℃孵育1 h，DAB顯色后滴加蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。采用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)計(jì)算視野中Angptl2和NF-κB的光密度值，計(jì)算平均值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠尿蛋白水平比較 灌胃第1周，安慰劑組、厄貝沙坦組和火把花根組尿蛋白水平均明顯高于正常組(P均<0.05)。第2周厄貝沙坦組和火把花根組尿蛋白水平均開始下降，均明顯低于安慰劑組(P均<0.05)，但灌胃前4周厄貝沙坦組和火把花根組尿蛋白水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；第5周火把花根組尿蛋白水平明顯低于厄貝沙坦組(P<0.05)；第7周和第8周，厄貝沙坦組和火把花根組尿蛋白水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

2.2各組大鼠腎臟組織PAS染色表現(xiàn) 安慰劑組糖原顆粒沉著較多，厄貝沙坦組和火把花根組減少。見圖1～4。

2.3各組大鼠腎臟組織HE染色表現(xiàn) 安慰劑組腎小球體積肥大呈腫脹狀態(tài)，腎小囊腔狹窄，呈裂隙狀，腎小管上皮細(xì)胞排列紊亂、肥大；厄貝沙坦組基底膜輕度增厚，系膜基質(zhì)輕度增生；火把花根組僅見系膜基質(zhì)輕度增加。見圖5～8。

表1 各組大鼠每周尿蛋白水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與安慰組比較，P<0.05；③與厄貝沙坦組比較，P<0.05。

圖1 正常組大鼠腎臟組織PAS染色表現(xiàn)(×400)

圖2 安慰劑組大鼠腎臟組織PAS染色表現(xiàn)(×400)

圖3 厄貝沙坦組大鼠腎臟組織PAS染色表現(xiàn)(×400)

圖4 火把花根組大鼠腎臟組織PAS染色表現(xiàn)(×400)

圖5 正常組大鼠腎臟組織HE染色表現(xiàn)(×400)

圖6 安慰劑組大鼠腎臟組織HE染色表現(xiàn)(×400)

圖7 厄貝沙坦組大鼠腎臟組織HE染色表現(xiàn)(×400)

圖8 火把花根組大鼠腎臟組織HE染色表現(xiàn)(×400)

2.4各組大鼠腎臟組織透視電鏡表現(xiàn) 安慰劑組大鼠腎小球毛細(xì)血管襻官腔擴(kuò)張明顯，基底膜呈階段性增厚，足細(xì)胞足突排列紊亂、增寬、節(jié)段性融合；厄貝沙坦組和火把花根組大鼠腎小球病變程度及范圍相對(duì)減輕。見圖9～12。

圖9 正常組大鼠腎臟組織透視電鏡表現(xiàn)(×1 700)

圖10 安慰劑組大鼠腎臟組織透視電鏡表現(xiàn)(×1 700)

圖11 厄貝沙坦組大鼠腎臟組織透視電鏡表現(xiàn)(×1 700)

圖12 火把花根組大鼠腎臟組織透視電鏡表現(xiàn)(×1 700)

2.5各組大鼠Angptl2和NF-κB表達(dá)水平 安慰劑組Angptl2和NF-κB表達(dá)水平均明顯高于正常組(P均<0.05)；厄貝沙坦組和火把花根組Angptl2和NF-κB表達(dá)水平均明顯低于安慰劑組(P均<0.05)。厄貝沙坦組和火把花根組Angptl2表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，火把花根組NF-κB表達(dá)水平明顯低于厄貝沙坦組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠Angptl2和NF-κB表達(dá)水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與安慰組比較，P<0.05；③與厄貝沙坦組比較，P<0.05。

3 討 論

糖尿病屬于中醫(yī)“消渴”范疇，消渴并發(fā)“水腫”“水病”和“尿濁”等與糖尿病腎病相近，并認(rèn)為“氣陰兩虛”是消渴腎病的重要病機(jī)[5]。中醫(yī)治療糖尿病腎病主要使用益氣滋陰、活血化瘀類藥物，常見的藥物有黃芪、雷公藤等?；鸢鸦ǜ欣坠賶A、雷公藤內(nèi)酯等多種成分，臨床上常用火把花根提取物治療自身免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、銀屑病[6-8]。王麗娟等[9]研究發(fā)現(xiàn)，火把花根能夠降低糖尿病腎病患者尿蛋白，可能與火把花根抑制TGF-β1、上調(diào)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，減輕腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化有關(guān)。

尿蛋白是糖尿病腎病發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，尿蛋白的發(fā)生與足細(xì)胞損傷、腎小球血流動(dòng)力學(xué)異常、腎小球肥大、系膜區(qū)基質(zhì)的擴(kuò)大等因素有關(guān)，足細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)的改變是尿蛋白發(fā)生的重要因素[10-11]。鄭敬民等[12]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病小鼠足細(xì)胞內(nèi)有Angptl2表達(dá)，提示足細(xì)胞產(chǎn)生分泌Angptl2。吳義超等[13]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者Angptl2表達(dá)增加；Angptl2參與足細(xì)胞損傷，且與尿白蛋白成正相關(guān)[14-16]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，火把花根有明顯降低糖尿病腎病大鼠尿蛋白的作用，在試驗(yàn)早期降低尿蛋白的作用較厄貝沙坦更為明顯，且隨著火把花根干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠尿蛋白呈線性下降；透視電鏡顯示安慰劑組足細(xì)胞足突排列紊亂、增寬，階段性融合，喪失正常結(jié)構(gòu)，厄貝沙坦組和火把花根組病變程度則相對(duì)減輕；免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，火把花根組大鼠腎臟組織中Angptl2表達(dá)水平明顯下降。提示火把花根可能通過抑制Angptl2表達(dá)保護(hù)足細(xì)胞，減少尿蛋白。

NF-κB存在于多種組織細(xì)胞中，是多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交叉點(diǎn)之一，它調(diào)控和參與機(jī)體應(yīng)激、炎癥反應(yīng)。NF-κB能夠調(diào)節(jié)包括足細(xì)胞在內(nèi)的多種腎臟組織細(xì)胞表達(dá)和分泌炎癥因子，而高血糖可激活NF-κB，從而上調(diào)IL-1β和TNF-α水平，在糖尿病腎病發(fā)生中起關(guān)鍵作用[17-18]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病大鼠腎臟組織中NF-κB表達(dá)增加，與周誼夏等[19]觀察結(jié)果相似；火把花根組中NF-κB表達(dá)明顯減少，并且低于厄貝沙坦組，提示火把花根可通過抑制NF-κB表達(dá)減輕腎臟組織的炎癥反應(yīng)，延緩糖尿病腎病的進(jìn)展，該作用可能較厄貝沙坦更為明顯。

綜上所述，火把花根能夠降低糖尿病腎病大鼠尿蛋白水平，具有治療糖尿病腎病的作用，該作用可能與其保護(hù)足細(xì)胞、抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)，其中的信號(hào)通路需要進(jìn)一步試驗(yàn)明確。