生物三維打印細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織的精準(zhǔn)優(yōu)化

黃孟杰 羅 莉 王 玲,2* 徐銘恩,2*

1(杭州電子科技大學(xué)生命信息與儀器工程學(xué)院，杭州 310018) 2(浙江省醫(yī)學(xué)信息與生物三維打印重點實驗室，杭州 310018)

引言

生物三維打印[1-3]基于快速成型分層制造原理，可以將多種生物材料和細(xì)胞精準(zhǔn)定位組裝到設(shè)計位置，形成三維類組織，為制造非均質(zhì)、復(fù)雜結(jié)構(gòu)組織器官提供新的理論和技術(shù)。水凝膠具有良好的親水性、生物相容性、生物可降解性以及活細(xì)胞包裹能力，對于生物三維打印在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用極具吸引力[4-5]。生物三維打印和水凝膠的完美結(jié)合，為制造復(fù)雜結(jié)構(gòu)功能的組織器官提供了一種激動人心的解決方案。3D纖維沉積(fiber deposition, FD)和3D生物繪圖(bio-plotting, BP)技術(shù)均屬于生物三維打印技術(shù)，曾成功用于制造具有可復(fù)制形態(tài)特性的多孔水凝膠結(jié)構(gòu)[6]，例如，Wang等基于3D FD的生物3D打印技術(shù)，成功制造出可控孔形和孔尺寸分布的多孔水凝膠/肝細(xì)胞復(fù)合結(jié)構(gòu)，且打印結(jié)構(gòu)具有良好的可復(fù)制性[7]。

生物三維打印定制化支架的內(nèi)部結(jié)構(gòu)可以更好地仿生真實組織器官的三維微環(huán)境，滿足組織形成對幾何、機(jī)械、流體運輸?shù)鹊奶厥庖?，有利于體外培養(yǎng)時細(xì)胞生長、組織形成和功能重建。然而，由于水凝膠特有的溶脹特性及組成成分的多變性，打印后的結(jié)構(gòu)形態(tài)參數(shù)與設(shè)計值出現(xiàn)明顯差異。例如，He等的研究發(fā)現(xiàn)，水凝膠打印成形過程中相鄰層會出現(xiàn)坍塌和融合現(xiàn)象，從而引起z方向的累計誤差[8]。此外，Shim等基于3D BP技術(shù)制備水凝膠支架，發(fā)現(xiàn)單一成分水凝膠打印出的支架機(jī)械性能較差，會出現(xiàn)支架支撐的局部斷裂[9]。上述研究表明，實際打印與預(yù)先設(shè)計在結(jié)構(gòu)形態(tài)上存在顯著差異，而細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織的這些局部或整體的結(jié)構(gòu)差異會嚴(yán)重影響其機(jī)械、液體傳輸?shù)忍匦裕M(jìn)而影響類組織內(nèi)的細(xì)胞活性和功能。

現(xiàn)有的研究提出，通過優(yōu)化打印參數(shù)來提高打印精度和保持細(xì)胞活性。例如：Chang等的實驗發(fā)現(xiàn)，生物三維打印過程中點膠壓強(qiáng)和噴頭尺寸會影響細(xì)胞活性[10]；Billiet等進(jìn)一步系統(tǒng)研究各打印參數(shù)對打印結(jié)果的共同作用，具體到水凝膠的濃度、打印溫度、打印壓強(qiáng)、打印速度以及細(xì)胞濃度等，提出適用于其實驗水凝膠材料成型和細(xì)胞高活性的具體打印參數(shù)設(shè)置[11]。上述研究的重點在于如何同時保持打印結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和細(xì)胞的高活性，但如何打印出與設(shè)計盡量匹配的水凝膠制品仍舊是空白。批量打印工程化組織和打印制品的大規(guī)模應(yīng)用，不僅要求打印結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和細(xì)胞活性，更要求打印與設(shè)計的精準(zhǔn)匹配。按照預(yù)設(shè)結(jié)構(gòu)精準(zhǔn)制備細(xì)胞負(fù)載水凝膠支架，提高打印的可控性和保真度，對生物三維打印技術(shù)在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用具有重要意義。

生物三維打印細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織的精準(zhǔn)優(yōu)化控制，精確量化打印結(jié)構(gòu)與設(shè)計值的差異是優(yōu)化控制的基礎(chǔ)，需要定量表征打印細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織的結(jié)構(gòu)特征。傳統(tǒng)的掃描電鏡、光學(xué)顯微法很難獲得打印類組織的三維內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息，Micro-CT可以獲得打印類組織的三維內(nèi)部結(jié)構(gòu)，但是X射線對于高含水量水凝膠材料吸收對比度低，離子效應(yīng)也會傷害細(xì)胞，不適合細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織的在體成像和表征。光學(xué)相干層析成像(optical coherence tomography, OCT)[12]能夠?qū)崟r非侵入式地獲取樣品結(jié)構(gòu)的橫斷面圖像，成像分辨率可以達(dá)到1～15 μm，對高散射樣品的成像深度達(dá)到數(shù)毫米[13]。OCT依靠近紅外低相干光干涉成像，對細(xì)胞損傷低，高含水量樣品成像對比度高，已廣泛用于組織工程實時監(jiān)測研究[14]，本研究小組在前期的工作中也證實了OCT技術(shù)用于水凝膠支架定量表征和精準(zhǔn)控制的可行性[15-17]。

本研究提出基于OCT三維定量表征的細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織的精準(zhǔn)優(yōu)化打印方法，通過OCT三維定量表征迭代，降低設(shè)計與打印間的結(jié)構(gòu)差異，提高細(xì)胞負(fù)載水凝膠打印的精準(zhǔn)性和穩(wěn)定性。在研究中，設(shè)計和打印了10種不同孔隙結(jié)構(gòu)的細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織，采用自制的三維掃頻OCT系統(tǒng)，無損在線成像打印組織塊和定量評價孔隙尺寸(pore size, PS)、支撐尺寸(strut size, StS)、孔隙率(porosity, VP)、體表面積(surface area, SA)、孔體積(pore volume, PV)等關(guān)鍵結(jié)構(gòu)參數(shù)；通過不同時間段批次打印穩(wěn)定性評價和同一批次打印參數(shù)關(guān)聯(lián)耦合分析，獲得反饋控制打印的經(jīng)驗函數(shù)，結(jié)合打印參數(shù)優(yōu)化指導(dǎo)精準(zhǔn)打印；最后經(jīng)負(fù)載C3A細(xì)胞類組織內(nèi)的細(xì)胞活性分析，驗證反饋優(yōu)化打印的有效性。

1 材料和方法

1.1 生物3D打印平臺搭建

生物3D打印平臺在杭州捷諾飛生物科技股份有限公司的Bio-Architect?-Pro基礎(chǔ)上搭建，生物3D打印設(shè)備外觀和系統(tǒng)構(gòu)成如圖1所示。該設(shè)備由軟件系統(tǒng)和硬件系統(tǒng)兩部分構(gòu)成：軟件系統(tǒng)部分包括模型處理和設(shè)備控制， 能對模型的再編輯和分層處理以及控制溫度、氣壓、三軸運動；硬件系統(tǒng)部分包括控制系統(tǒng)和機(jī)械系統(tǒng)，其中控制系統(tǒng)包括溫度控制模塊、氣壓控制模塊和三軸運動控制器，機(jī)械系統(tǒng)部分包括終端執(zhí)行功能的打印噴頭、打印平臺、三軸運動模組、自動噴頭清潔、自動對高和平臺測高等部件。該設(shè)備可以對氣壓和溫度進(jìn)行精確調(diào)控，并能在打印過程中實時調(diào)控打印參數(shù)。

圖1 生物3D打印設(shè)備和系統(tǒng)構(gòu)成。(a)Regenovo公司生產(chǎn)的Bio-Architect?-Pro外觀；(b)系統(tǒng)構(gòu)成Fig.1 Biological 3D printing equipment and system constitution.(a) Bio-Architect?-Pro manufactured by Regenovo; (b) System architecture

1.2 OCT成像和表征

生物3D打印水凝膠支架的成像采用本團(tuán)隊之前開發(fā)的一套高速高分辨掃頻OCT系統(tǒng)[18]，系統(tǒng)實物和關(guān)鍵性能指標(biāo)如圖2和表1所示。

圖2 系統(tǒng)實物Fig.2 Physical picture

在成像過程中，細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織浸沒在培養(yǎng)液中，并密封在培養(yǎng)孔板內(nèi)，以確保細(xì)胞營養(yǎng)供應(yīng)和無菌干擾，每次成像在培養(yǎng)孔板上標(biāo)記成像的視場范圍。獲取的高分辨3D OCT圖像通過已論證的算法[15-17]，自動量化打印細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織的結(jié)構(gòu)參數(shù)，包括PS、StS、VP、SA、PV，并與設(shè)計值做比較，定量表征流程如圖3所示。

1.3 C3A細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織打印

將配制好的明膠溶液和海藻酸鈉溶液按體積比1∶1混合均勻，加入重懸浮的C3A細(xì)胞懸液，制得細(xì)胞密度為6×106個/mL的混合物。將細(xì)胞-水凝膠混合物轉(zhuǎn)移到打印機(jī)配置的低溫墨盒中，選用210 μm噴頭，將墨盒置入成型室的低溫噴頭中。支架的設(shè)計采用以往類組織打印驗證可行的正交聯(lián)通立方體結(jié)構(gòu)設(shè)計[19]，結(jié)構(gòu)形狀不變，僅改變結(jié)構(gòu)體的PS，按照PS的不同，分別將設(shè)計和打印的結(jié)構(gòu)定義為po250、po300、po350、po400、po500、po600、po700、po800，立方體外形尺寸為10 mm×10 mm×2 mm。第一次試驗組，同一批次關(guān)聯(lián)測試打印po300、po400、po500、po600、po700、po800，每批重復(fù)打印5次。不同批次跨越6個月時間打印同一結(jié)構(gòu)po600，每批重復(fù)打印5次。打印參數(shù)設(shè)置如下：打印氣壓0.42 MPa，打印速度8 mm/s，噴頭溫度4℃，平臺溫度4℃，層高0.1 mm。待支架成型后，滴加5%無菌氯化鈣溶液適量，交聯(lián)固化30 s后，移除氯化鈣溶液，用無菌DPBS溶液洗滌支架，反復(fù)沖洗3遍，最后加入適量完全培養(yǎng)基，置于CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。第二次生產(chǎn)組要求打印出定制的孔尺寸為250和350 μm，分為兩組，控制組直接設(shè)置孔尺寸為250和350 μm，優(yōu)化組根據(jù)第一次試驗組的反饋設(shè)置打印結(jié)構(gòu)參數(shù)和工藝參數(shù)。

表1 OCT系統(tǒng)關(guān)鍵性能指標(biāo)Tab.1 Key performance indicators of OCT system

圖3 基于OCT的支架結(jié)構(gòu)表征流程Fig.3 General flow chart of the scaffold structure characterization based on OCT

1.4 打印C3A細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織結(jié)構(gòu)測試

對制備好的細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織常規(guī)培養(yǎng)1天，再通過自制的OCT系統(tǒng)進(jìn)行內(nèi)部結(jié)構(gòu)檢測分析。OCT檢測時，整個培養(yǎng)孔板的打印類組織保持密封，且整個孔板內(nèi)樣品的圖像采集時間不超過30 min，以盡量減少檢測對類組織的活性影響。分別對第一次試驗組同一批次打印的6種不同尺寸的細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織、不同批次打印的po600以及第二次生產(chǎn)實驗優(yōu)化組細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織進(jìn)行OCT成像和定量表征，分別隨機(jī)選擇5個打印出的樣本做結(jié)構(gòu)測試分析，比較各參數(shù)與設(shè)計值的統(tǒng)計差異；分析差異間的關(guān)聯(lián)性，測試迭代分析方法是否能顯著降低設(shè)計和打印結(jié)果的差異。

1.5 打印細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織生物活性測試

生物活性檢測實驗，是為了比較結(jié)構(gòu)控制優(yōu)化前后細(xì)胞存活特性上的差異。在制備完細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織后的第1、7和14 d，利用活、死細(xì)胞活力/毒性檢測試劑盒來檢測支架里細(xì)胞的存活率。將染色試劑加入細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織中，確保浸沒結(jié)構(gòu)體。將其在37℃黑暗環(huán)境下培養(yǎng)1 h后，吸出染色試劑，用無菌DPBS溶液反復(fù)洗滌支架3次，最后在熒光倒置顯微鏡下觀察。隨機(jī)選擇樣品(一組3個類組織樣品)5個不同位置并拍照熒光顯微圖，細(xì)胞存活率(cell viability,CV)的計算如下：

(1)

1.6 整體精準(zhǔn)優(yōu)化控制方法

基于OCT的細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織的精準(zhǔn)優(yōu)化打印方法，該方法包括設(shè)計、打印、成像、表征、分析、反饋的兩次閉環(huán)，基礎(chǔ)裝置是多參數(shù)可控的生物三維打印設(shè)備和打印類組織的OCT定量分析裝置，如圖4所示。第一次試驗閉環(huán)：設(shè)計適合細(xì)胞生長要求及組織成型機(jī)械要求的多孔支架結(jié)構(gòu)；通過多參數(shù)可控的生物三維打印裝備，將細(xì)胞/明膠/海藻酸納混合液按照設(shè)計結(jié)構(gòu)裝配成三維組織模型，實驗選用C3A細(xì)胞；利用OCT成像技術(shù)，定量表征分析支架的結(jié)構(gòu)參數(shù)，比較分析實際打印結(jié)果與預(yù)設(shè)參數(shù)的差異，并反饋給第二次生產(chǎn)閉環(huán)。第二次閉環(huán)：結(jié)合差異相關(guān)分析和三維打印工藝過程優(yōu)化，通過迭代方法降低打印支架與設(shè)計的形態(tài)差異，從而獲得定制化的打印結(jié)構(gòu)，最后進(jìn)行直接打印，與精準(zhǔn)定制打印類組織的生物活性對比，測試精準(zhǔn)打印的效果。

圖4 整體方法示意圖Fig.4 Schematic diagram of the whole method

圖5 6種不同PS細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織宏觀圖，線框為OCT成像范圍。(a)po300；(b)po400；(c)po500；(d)po600；(e)po700；(f)po800Fig.5 Macrographs of the 6 different geometries hydrogel scaffolds, OCT imaging range in the frame. (a)po300; (b)po400; (c)po500; (d)po600; (e)po700; (f)po800

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織的打印和OCT成像

基于生物3D打印平臺，可以成功制備預(yù)設(shè)的不同PS的細(xì)胞負(fù)載水凝膠支架，打印的C3A細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織浸沒在DMEM培養(yǎng)基溶液的立體照片如圖5所示。對比圖像，證實該打印系統(tǒng)能夠制備不同PS的三維支架，可以觀測到不同預(yù)設(shè)PS的類組織有明顯的孔隙結(jié)構(gòu)差異，PS較小的類組織塊(如po300、po400)表面有孔隙堵塞的現(xiàn)象，且孔隙形狀不是很規(guī)整，形狀發(fā)生些許變化，而po500～po800支架的孔隙形狀則規(guī)則許多。但是，立體照片不能給出打印類組織內(nèi)部的結(jié)構(gòu)特征。

圖6展示了打印類組織的OCT檢測序列。從OCT的橫截面圖像(XZ)可以看出，OCT成像技術(shù)對高含水量細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織的成像深度可達(dá)到2.0 mm，成像分辨率可以達(dá)到微米級，足夠分辨打印類組織的內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征。打印類組織的實體支撐部分在圖像中顯示為灰白色，而灰白部分中間夾雜著的黑色部分為類組織的孔隙區(qū)域。對比OCT圖像可以看出，po300和po400圖像的內(nèi)部較多地出現(xiàn)孔隙融合的情況(見圖6(a)、(b))，主要是由于水凝膠材料本身溶脹，引起打印精度下降。隨著預(yù)設(shè)尺寸的增大，可以明顯觀察到孔隙融合這種現(xiàn)象相應(yīng)減少(見圖6(c)～(f))。圖6(a)～(e)的OCT橫截面圖像中出現(xiàn)了細(xì)胞負(fù)載水凝膠區(qū)域部分缺失的現(xiàn)象，是預(yù)設(shè)的內(nèi)部橫向通道截面，這在二維顯微圖像中很難觀測到；從圖6(a)～(c)和(d)～(e)的對比也可以看出，在預(yù)設(shè)孔隙較小的時候，預(yù)設(shè)的內(nèi)部橫向通道更容易出現(xiàn)坍塌和堵塞，這是由于孔隙小時水凝膠溶脹引起的打印誤差比率更大。

圖6 6種不同PS細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織OCT-XZ序列圖。(a)po300；(b)po400；(c)po500；(d)po600；(e)po700；(f)po800Fig.6 OCT-XZ images of the 6 different geometries hydrogel scaffolds.(a)po300; (b)po400; (c)po500; (d)po600; (e)po700; (f)po800

圖7 6種不同PS細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織三維渲染圖。(a)po300；(b)po400；(c)po500；(d)po600；(e)po700；(f)po800Fig.7 3D rendering images of the 6 different geometries hydrogel scaffolds.(a)po300; (b)po400; (c)po500; (d)po600; (e)po700; (f)po800

OCT除了觀測打印類組織的二維內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征，還可以通過三維重建再現(xiàn)類組織的三維結(jié)構(gòu)特征。圖7為對應(yīng)的體繪制三維渲染，可以更清楚地觀測到類組織的立體顯微特征：圖7(b)～(c)、(f)可以觀測到打印過程流涎，導(dǎo)致在孔區(qū)域出現(xiàn)不規(guī)則細(xì)絲；(a)、(d)可以觀測到大面積的打印缺失；(e)可以觀測到正交的聯(lián)通通道。同時，3D OCT還可以通過圖像分割，分別得到打印類組織的內(nèi)部通道和實體支撐部分的分布信息(見圖8、9)，可以更方便地分析三維打印缺陷，便于第二次生產(chǎn)組的打印過程指導(dǎo)和工藝優(yōu)化。

圖8 6種不同PS細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織孔隙三維重建圖。(a)po300；(b)po400；(c)po500；(d)po600；(e)po700；(f)po800Fig.8 3D pore reconstruction images of the 6 different geometries hydrogel scaffolds.(a)po300;(b)po400; (c)po500; (d)po600; (e)po700; (f)po800

圖9 6種不同PS細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織水凝膠支撐三維重建圖。(a)po300；(b)po400；(c)po500；(d)po600；(e)po700；(f)po800Fig.9 3D strut reconstruction images of the 6 different geometries hydrogel scaffolds.(a)po300; (b)po400; (c)po500; (d)po600; (e)po700; (f)po800

2.2 細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織的打印可控性和穩(wěn)定性

2.2.1批內(nèi)打印的可控性

通過迭代降低打印與預(yù)設(shè)的差異，首先需要確定生物三維打印系統(tǒng)和工藝是否具有可控性和穩(wěn)定性。本研究通過同一批次PS均勻遞增的類組織的打印和量化分析，確定打印的可控性。實驗設(shè)計了po300、po400、po500、po600、po700、po800共6組水凝膠類組織，并各自重復(fù)打印5次，隨后根據(jù)3D OCT成像和圖3提到的量化分析算法，獲得和統(tǒng)計6組類組織包括PS、StS、 VP、 SA、 PV在內(nèi)的結(jié)構(gòu)參數(shù)。從表2中的方差來看，同一時間打印細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織，具有較好的打印穩(wěn)定性。相比二維顯微圖像，3D OCT不僅可以得到表面的孔隙和支撐信息，也可以得到三維體信息，如VP、SA、PV。

同時，本研究比較了實際打印類組織的結(jié)構(gòu)參數(shù)與預(yù)設(shè)值之間的差異，如圖10所示?？梢钥闯觯琍S、StS、VP、SA、PV的差值區(qū)間分別為28%～40%，32%～38%，14%～38%，18%～30%，13%～38%，表明實際打印與預(yù)設(shè)之間存在明顯差異。

表2 PS、StS、VP、SA和PV的平均值和方差Tab.2 The average and variance of PS, StS, VP, SA, PV

圖10 5個量化參數(shù)的對比分析(圖中以百分比表示的數(shù)據(jù)為實際打印與預(yù)設(shè)打印的差值/預(yù)設(shè)打印值)。(a)平均實體StS；(b)平均PS；(c)平均VP；(d)平均SA；(e)平均PVFig.10 Average PS, StS, PV, SA and PV calculated using OCT image analysis and compared to the respective designed geometries(The data in the pictures are the ratio of the difference between the actual print and the preset print to the preset print value).(a)StS; (b)PS; (c)VP; (d)SA; (e)PV

為了進(jìn)一步確定是否可以用量化的打印結(jié)構(gòu)參數(shù)迭代優(yōu)化指導(dǎo)第二次打印，筆者分析了實際打印的結(jié)構(gòu)參數(shù)與預(yù)設(shè)變量間的關(guān)聯(lián)性，以均勻變化的預(yù)設(shè)PS為自變量，基于量化的打印結(jié)構(gòu)特征統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析，分別將實際測得的PS、VP、SA和PV與預(yù)設(shè)PS做最小二乘函數(shù)擬合分析，分析結(jié)果如圖11所示。其中，(a)～(d)分別展示了支架的實際PS、VP、SA、PV與預(yù)設(shè)PS值的相關(guān)性，經(jīng)驗相關(guān)分析結(jié)果呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)性，證實了根據(jù)第一次閉環(huán)實驗總結(jié)出的經(jīng)驗相關(guān)函數(shù)可以作為第二次閉環(huán)實驗中打印的輸入函數(shù)，用來反饋調(diào)整第二次打印細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織的設(shè)計與制備。

圖11 實際結(jié)構(gòu)尺寸與預(yù)設(shè)PS的相關(guān)函數(shù)分析。(a)實際PS與預(yù)設(shè)PS；(b)實際VP與預(yù)設(shè)PS；(c)實際SA與預(yù)設(shè)PS；(d)實際PV預(yù)設(shè)PSFig.11 Function analysis of actual structure size and preset PS. (a) as-produced PS; (b) as-produced VP; (c) as-produced SA; (d) as-produced PV

2.2.2批間打印的穩(wěn)定性

為了確定打印系統(tǒng)的穩(wěn)定性，測試了不同時間同樣設(shè)計的細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織的打印差異。po600在6個月的時間里打印了6次，每次至少打印5個類組織樣品，打印參數(shù)設(shè)置一致；經(jīng)過3D OCT成像、量化表征和統(tǒng)計分析，得出6個月、6個時間點該設(shè)計實際打印的PS差別不大，統(tǒng)計出最大值和最小值之間的差異僅為11 μm，StS、VP、SA、PV的變化均無顯著性差異，符合本實驗對生物三維打印系統(tǒng)穩(wěn)定性的要求。

2.3 驗證迭代分析指導(dǎo)打印的結(jié)構(gòu)優(yōu)化有效性

圖12 迭代改進(jìn)后類組織的OCT-XY橫截面圖像。(a)po250；(b)po350Fig.12 The second OCT-XY image of scaffold structures after interactive analysis.(a)po250; (b)po350

為了驗證本研究提出的迭代分析和反饋指導(dǎo)的優(yōu)化打印方法是否能有效地根據(jù)定制的形態(tài)結(jié)構(gòu)制備出細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織，期望平均PS為250和350 μm的類組織被重新設(shè)計。以第一次閉環(huán)實驗中制備的類組織結(jié)構(gòu)差異為輸入，結(jié)合圖11的迭代分析，為了得到實際PS為250和350 μm的類組織，第二次打印類組織的PS需要分別設(shè)置為390和540 μm。同時，根據(jù)圖6～9的OCT成像和重建結(jié)果，結(jié)合之前的打印工藝測試經(jīng)驗，將打印參數(shù)設(shè)置為：打印氣壓0.43 MPa，打印速度8.5 mm/s，噴頭溫度為5℃，平臺溫度4℃，層高0.1 mm，兩組類組織在新的參數(shù)下各自重復(fù)打印5次。待再次打印制備完成后，對兩組共10個類組織樣品做OCT圖像采集，經(jīng)過圖像處理后統(tǒng)計計算的OCT-XY橫截面的成像結(jié)果和三維重建圖如圖12、13所示。

圖13 迭代改進(jìn)后類組織的三維重建圖。(a)po250；(b)po350Fig.13 The 3D reconstruction image of scaffold structures after interactive analysis.(a)po250; (b)po350

觀察分析po250和po350細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織的OCT-XY圖像和三維重建圖，可以看到細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織整體的完整性，同時也可以看到打印類組織孔隙通道基本聯(lián)通，支撐柱體高度一致且無明顯粘連。相比而言，po250仍有部分孔變形的問題，但基本沒有孔隙堵塞和孔融合的問題(見圖12(a)、13(a))。po350的結(jié)構(gòu)形貌更好地保持了設(shè)計的結(jié)構(gòu)特征(見圖12(b)、13(b))，保持了方形的孔道結(jié)構(gòu)特征，這從另一個側(cè)面驗證了大孔隙結(jié)構(gòu)更容易控制打印精度。進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)參數(shù)量化表征以及與預(yù)設(shè)值的對比分析結(jié)果如圖14所示。可以看出，與預(yù)設(shè)值的結(jié)構(gòu)差異已控制在7%以下，極大提高了打印的準(zhǔn)確性和保真度。

圖14 迭代改進(jìn)后類組織的結(jié)構(gòu)參數(shù)對比分析(圖中以百分比表示的數(shù)據(jù)為實際打印與預(yù)設(shè)打印的差值/預(yù)設(shè)打印值)。(a)PS；(b)StS；(c)VP；(d)PV；(e)SAFig.14 Calculated from OCT images compared to the respective values calculated from the empirical correlation functions (The data in the pictures are the ratio of the difference between the actual print and the preset print to the preset print value). (a)PS; (b)StS; (c)VP; (d)PV; (e)SA

2.4 直接打印和優(yōu)化打印細(xì)胞活性對比

為了測試優(yōu)化打印是否有利于類組織的生物活性重建，本研究比較了同樣預(yù)設(shè)PS直接打印和優(yōu)化打印后的類組織內(nèi)細(xì)胞活性隨時間的變化情況。圖15給出po250、po350直接打印和優(yōu)化打印細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織打印后體外培養(yǎng)7、14 d的細(xì)胞活性染色的顯微圖像，其中，綠色熒光是被染色的活細(xì)胞，紅色熒光是被染色的死細(xì)胞。由圖15的對比可以看出，直接打印組圖中的紅色熒光較多，即死細(xì)胞數(shù)目多，而優(yōu)化打印組圖中的紅色熒光部分明顯比同行的直接打印組的少，證明直接打印細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織不利于細(xì)胞活性的維持。

圖15 迭代改進(jìn)前后類組織內(nèi)的細(xì)胞熒光顯微圖(左為迭代改進(jìn)前，右為迭代改進(jìn)后；上為第7 d，下為第14 d)。(a)po250；(b)po350Fig.15 The cell fluorescence microscopy image of C3A cell in the scaffold structures after interactive analysis (the left for before iterative improvement, the right for after iterative improvement; the top is the 7th day, the bottom is the 14th day.).(a)po250; (b)po350

量化分析po250、 po350直接打印和優(yōu)化打印體外培養(yǎng)1、7、14 d的細(xì)胞活性情況，如圖16所示。po250直接打印體外培養(yǎng)1、7、14 d的細(xì)胞活性分別為91.0±2.22%、85.5±1.70%、83.4±3.76%，對應(yīng)的優(yōu)化打印的細(xì)胞活性分別為92.1±2.78%、95.0±1.03%、96.1±2.79%；po350直接打印體外培養(yǎng)1、7、14 d的細(xì)胞活性分別為90.3±4.00%、92.6±1.65%、91.6±1.57%，對應(yīng)優(yōu)化打印的細(xì)胞活性分別為91.2±2.45%、96.0±0.83%、95.6±2.85%?？梢钥闯?，直接打印和優(yōu)化打印在打印后體外培養(yǎng)的初始時段差別不大，但隨著時間的推移，定制化的結(jié)構(gòu)更有利于細(xì)胞活性的維持。同時，本研究比較了優(yōu)化打印定制化的po250和po350的細(xì)胞活性結(jié)果，可以看出PS大小對細(xì)胞存活率存在一定影響，大的孔隙更有利于細(xì)胞的存活。

圖16 優(yōu)化控制前后細(xì)胞存活率的對比分析。(a)po250；(b)po350Fig.16 Comparison of cell viability in the scaffold structures after interactive analysis.(a)po250; (b)po350

3 討論

本團(tuán)隊之前的研究證實了利用OCT定量表征反饋指導(dǎo)水凝膠精準(zhǔn)打印的可行性[17]，本研究進(jìn)一步證實基于OCT精準(zhǔn)打印細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織的可行性。細(xì)胞負(fù)載在水凝膠內(nèi)對打印和成像都提出了挑戰(zhàn)，成像需要盡量避免對打印類組織活性的影響。OCT可以在非接觸正常培養(yǎng)條件下對打印類組織直接成像，成像深度可以達(dá)到2 mm，與打印類組織的厚度匹配，分辨率可以達(dá)到10 μm，具有傳統(tǒng)成像方式無法比擬的優(yōu)勢[19-20]，且3D OCT圖像自動定量分析可以方便地獲得打印內(nèi)組織不同層面的信息和整體的立體結(jié)構(gòu)信息(見圖6～9)。

打印時既要控制結(jié)構(gòu)穩(wěn)定也需要保持細(xì)胞活性，以往的研究和本團(tuán)隊積累的打印工藝經(jīng)驗可以較好地平衡打印結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和細(xì)胞活性要求[21]，但依然無法做到精準(zhǔn)打印出預(yù)設(shè)的類組織特性，結(jié)構(gòu)對打印類組織的細(xì)胞表達(dá)、組織形成和功能重建的影響難以預(yù)估，從而無法將三維打印結(jié)構(gòu)控制的優(yōu)勢發(fā)揮到極致。本研究對細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織的精準(zhǔn)打印進(jìn)行嘗試，實驗證實包括兩次閉環(huán)的反饋代優(yōu)化就可以有效地將打印類組織的結(jié)構(gòu)特征控制在期望值附近。

第一次閉環(huán)屬于實驗組，用于測試打印系統(tǒng)的穩(wěn)定性和可控性，需要將可能的結(jié)構(gòu)特征變化盡量涵蓋，PS是打印結(jié)構(gòu)特征的基本變量，對打印結(jié)構(gòu)的其他幾何參數(shù)具有較大的連帶效應(yīng)，同時對類組織細(xì)胞動態(tài)和功能重建影響較大，第一次實驗組的PS選擇從300～800 μm連續(xù)變化，涵蓋組織工程常用的PS，也考慮到細(xì)胞活性和增殖對PS的要求。第二次閉環(huán)屬于生產(chǎn)組，其打印參數(shù)設(shè)置需要根據(jù)第一次的打印缺陷分析進(jìn)行優(yōu)化，水凝膠濃度、打印氣壓、噴頭設(shè)計、打印噴頭溫度、平臺溫度、打印速度和細(xì)胞密度等因素對打印結(jié)構(gòu)完整性和細(xì)胞活性具有聯(lián)動效果，系統(tǒng)全面的打印工藝優(yōu)化有利于第二次類組織生產(chǎn)制備的成功，本團(tuán)隊在大量水凝膠打印制備實驗中積累了打印工藝經(jīng)驗[22-23]。

從OCT成像結(jié)果(見圖6～9)可以看出，打印類組織平均PS低于400 μm時制備的可控性較低，更容易出現(xiàn)孔堵塞等打印缺陷。這種打印可控性降低的問題在其他文獻(xiàn)中也有報道，主要受限于水凝膠材料本身的溶脹特性，無論是國外的商用生物三維打印機(jī)Bioplotter(Envisiontec, Germany)，還是研究機(jī)構(gòu)自制的實驗室生物三維打印機(jī)，都能觀測到打印可控性與預(yù)設(shè)的平均PS有關(guān)。例如，Billiet等[11]發(fā)現(xiàn)，即使打印參數(shù)做過最優(yōu)配置，當(dāng)預(yù)設(shè)PS低于600 μm時，甲基丙烯酰胺修飾明膠的濃度若低于10%(W/V)支架會發(fā)生整體坍塌，若濃度低于20%(W/V)會引起局部坍塌；能夠打印出互相連通的通道結(jié)構(gòu)的實際PS在500 μm左右，過大的PS并不利于細(xì)胞間的信號傳遞和組織形成。本研究通過迭代的優(yōu)化打印方法可以將預(yù)設(shè)PS的實際打印值控制在300 μm附近。250～350 μm的PS更有利于類組織養(yǎng)料、廢物的運輸以及細(xì)胞自身的遷移活動，也有利于類組織內(nèi)部血管形成[24]。

除了打印過程的影響，預(yù)設(shè)類組織的幾何結(jié)構(gòu)特征也會影響打印后細(xì)胞的活性表達(dá)。從直接打印組和優(yōu)化組的細(xì)胞活性對比分析可以看出(見圖16)，在打印參數(shù)最優(yōu)化配置的情況下，直接打印和優(yōu)化打印類組織的初始細(xì)胞活性并沒有顯著差異，而在打印后體外培養(yǎng)7、14 d優(yōu)化打印的優(yōu)勢凸顯，證實了打印結(jié)構(gòu)精準(zhǔn)匹配預(yù)設(shè)的重要性。由圖16的細(xì)胞活性顯微圖可以看出，隨時間推移，優(yōu)化打印po250的細(xì)胞增殖可能完全覆蓋本身聯(lián)通的通道，相比而言優(yōu)化打印po350的搭橋聯(lián)通通道現(xiàn)象較少，這從側(cè)面證實了預(yù)設(shè)打印對細(xì)胞功能表達(dá)、組織結(jié)構(gòu)和功能重建的重要性。

盡管本研究提出的優(yōu)化打印方法有利于制備出定制特性的多孔細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織，但仍然存在一定的限制。目前的預(yù)設(shè)打印結(jié)構(gòu)是均勻結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)特征分析基于同一樣品所有成像范圍的統(tǒng)計分析，對于非均質(zhì)結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)打印優(yōu)化，需要通過局部單元核的量化反饋進(jìn)行分析，前面提到3D標(biāo)記的自動量化表征算法可以處理非均質(zhì)結(jié)構(gòu)的量化表征難題，進(jìn)一步的研究將會試驗非均質(zhì)結(jié)構(gòu)精準(zhǔn)打印方案。

4 結(jié)論

本研究提出了基于OCT的細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織精準(zhǔn)優(yōu)化打印方法。三維OCT圖像數(shù)據(jù)分析表明，細(xì)胞負(fù)載水凝膠類組織的結(jié)構(gòu)參數(shù)在設(shè)計與打印結(jié)果間有較大差異；不同批次的數(shù)據(jù)證實該生物三維打印技術(shù)的穩(wěn)定性；根據(jù)表征圖像量化分析的結(jié)果，獲得實際打印物的PS、VP、SA和PV與設(shè)計PS間的相關(guān)經(jīng)驗公式，基于迭代分析反饋指導(dǎo)第二次打印，得到滿足設(shè)計要求的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

該反饋精準(zhǔn)優(yōu)化打印方法能夠精準(zhǔn)控制生物三維打印制品，結(jié)合OCT技術(shù)的發(fā)展，為組織工程支架優(yōu)化設(shè)計、生物三維打印過程控制、生物三維打印組織工程與再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用等提供具有潛力的精準(zhǔn)化工具。