三角楓天然四倍體變異的鑒定

安 凱，豐 震，喬 謙，任紅劍

（山東農(nóng)業(yè)大學林學院，山東 泰安271018）

三角楓（Acer buergerianum Miq.）為槭樹科槭樹屬落葉喬木，是我國自然分布的優(yōu)良鄉(xiāng)土槭樹。三角楓適應性強，耐干旱瘠薄，也耐一定的水濕，且稍耐蔭，根萌性強，我國種植范圍極廣；另外，三角楓是一種材質(zhì)好、用途廣的速生闊葉林木，其木材堅實、紋理直、刨面光澤、色紋美觀，具有重要的經(jīng)濟價值[1]。三角楓也是重要的色葉樹種和森林風景林資源[2]。當前國內(nèi)關于三角楓的研究較少，主要多集中在園林應用方面，尤其是在育種方面國內(nèi)研究較少[3]。多倍體作為培育新品種的重要親本材料，對于三角楓多倍體的發(fā)現(xiàn)在種質(zhì)資源方面具有重要意義。

流式細胞儀能夠定量測定某一細胞中DNA、RNA含量，在植物育種方面，可以快速準確鑒定植物倍性，相比染色體計數(shù)和組型分析等傳統(tǒng)方法，流式細胞儀檢測不受植物取材部位和時期限制[4-7]，更加簡單方便，同時精度更高。

多倍化是植物進化變異的一種自然現(xiàn)象，也是植物育種的重要手段[8]。多倍體植物常表現(xiàn)出莖粗、葉大、葉厚、抗性強等特點，尤其在生長速度、遺傳品質(zhì)、抗逆性等方面具有顯著優(yōu)勢。多倍體產(chǎn)生后可以增加遺傳進化的多樣性，也可以為新品種的培育和研究提供重要材料。多倍體鑒定的方法主要有形態(tài)學鑒定、生理生化指標鑒定、細胞學鑒定、流式細胞儀鑒定和染色體計數(shù)等，各種鑒定方法經(jīng)常綜合應用，相互印證[9-14]。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料三角楓實生苗、三角楓1號無性系、2號無性系均取自山東農(nóng)業(yè)大學林學院園林實訓基地的槭屬資源圃。三角楓1號無性系和2號無性系是課題組選育的三角楓新品系，其選育方法為：在三角楓的1年生播種育苗群體中，發(fā)現(xiàn)兩株生長較快的超級苗，以普通三角楓實生苗為砧木，通過嫁接繁殖培育成了三角楓1號無性系和2號無性系。

1.2 試驗方法

1.2.1 流式細胞儀鑒定

取三角楓實生苗、1號無性系、2號無性系正常葉片，洗凈去除中脈后稱取葉片20mg置于培養(yǎng)皿中，加入新鮮裂解液①（配方見表1）200uL，再向樣品中加入裂解液②600uL，用雙城刀片將葉片切碎，處理3～5min。吸取1mL切好的樣品經(jīng)300木尼龍網(wǎng)過濾到1.5mL離心管中，加入1mg/mL碘化丙啶溶液，使碘化丙啶溶液最終濃度為0.1mg/mL，處理5min，隨即上機檢測。儀器使用加拿大Handyem公司HPC-150個人型流式細胞儀。每個測試樣品設置三個重復，每次最少收集9000個細胞。

表1 裂解液配方

1.2.2 形態(tài)學及氣孔掃描電子顯微觀察

外觀形態(tài)對比：按照槭屬DUS測試指南分別測量兩種三角楓葉片長度、葉片寬度、葉面積、葉柄長度、葉柄寬度、葉片厚度、葉裂角度、樹高、胸徑。

氣孔掃描電子顯微觀察：取新鮮葉片，室溫下至于氯仿中進行脫蠟處理，用磷酸緩沖液沖洗干凈，用刀片切成10mm×10mm大小，在4℃戊二醛固定液中過夜，用磷酸緩沖液多次沖洗；在50%、70%、85%、95%、100%乙醇中梯度脫水后干燥，放入樣品杯，鍍膜后在掃描電鏡下觀察拍照。取10個視野測氣孔長度和寬度，計算各指標平均值，并統(tǒng)計氣孔密度。

1.2.3 石蠟切片制作

取新鮮葉片，在FAA固定液中固定24小時，充分用水沖洗，除去遺留在組織內(nèi)的固定液及結(jié)晶沉淀；將葉片切成小塊，使用85%、95%、100%乙醇進行徹底脫水；脫水完成后用二甲苯進行透明處理，以替換出植物組織內(nèi)的酒精；然后進行浸蠟、包埋處理；將處理好的材料切片，切片厚度控制在8μm～20μm之內(nèi)；用粘片劑將蠟片牢附在載玻片上，之后進行脫蠟并使用番紅和固綠進行染色；最后將切片固封。在顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel和SPSS 22軟件進行進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 流式細胞儀結(jié)果分析

三角楓1號無性系葉片單細胞DNA含量的峰值在2e5處左右，分布如圖1所示，二倍體三角楓與2號無性系峰值在1e5左右。由此我們可以看出，三角楓1號無性系葉片單細胞DNA含量是二倍體的2倍，2號無性系與二倍體葉片單細胞DNA含量相同。

2.2 掃描電鏡觀察

圖1 葉片DNA含量比較

三角楓1號無性系和2號無性系氣孔比較如圖2所示。從表2中可以看出，三角楓1號無性系氣孔長95.42μm、寬53.27μm明顯大于2號無性系長 68.89μm 和寬 31.79μm，差異顯著（圖 2-C,2-D）。由圖2-A、2-B可以明顯看到三角楓1號無性系氣孔密度小于2號無性系；經(jīng)計算三角楓1號無性系單位面積氣孔數(shù)51.15個，顯著低于2號無性系單位面積氣孔數(shù)。三角楓1號無性系葉下表皮細胞明顯大于2號無性系，且更凸起。三角楓1號、2號在電鏡觀察前均使用氯仿進行除蠟處理，三角楓1號仍殘存較多蠟質(zhì)，2號表面蠟質(zhì)完全脫掉；從圖2-A、2-C中可以清楚觀察到三角楓1號無性系葉片下表皮蠟質(zhì)層的存在，表層蠟質(zhì)膜被有機溶劑嚴重侵蝕，布滿絲狀網(wǎng)紋，梯度脫水所用的酒精等溶劑也可以溶解葉片表皮的蠟質(zhì)成分[15]。

2.3 形態(tài)學對比

三角楓1號無性系枝干挺拔，小枝細瘦，當年生枝條綠色。三角楓2號無性系，枝干扭曲（圖2-E,2-F）。兩者的葉片形態(tài)學對照比較結(jié)果如表3所示（圖2-G,2-H）。三角楓1號無性系在葉片長度、葉片寬度、葉片厚度、葉柄粗細均大于2號無性系和三角楓實生苗，葉柄長度2號與三角楓實生苗差別較小，略長于1號。其中葉片長度、葉片寬度、葉柄粗細、樹高、胸徑差異顯著。

2.4 葉片解剖結(jié)構(gòu)比較

比較兩種三角楓無性系的葉片解剖結(jié)構(gòu)（圖2-I,2-J），三角楓1號無性系上表皮細胞排列規(guī)則，柵欄組織較厚；柵欄組織和海綿組織排列緊密，角質(zhì)層較厚。三角楓2號無性系柵欄組織較薄且排列無規(guī)則，海綿組織排列松散，角質(zhì)層較薄。下表皮細胞和保衛(wèi)細胞三角楓1號無性系明顯大于2號無性系。

3 討論與結(jié)論

自然發(fā)生多倍體在植物界中普遍存在，是植物進化的重要途徑之一。植物中被認可度較高的多倍體形成機制主要是體細胞加倍和配子不減數(shù)兩類。多倍體在發(fā)展農(nóng)作物新品種中有很大作用，如無籽西瓜、良種小黑麥等，都體現(xiàn)了多倍體的優(yōu)良特性。多倍體育種在林業(yè)中也具有巨大潛力，但是目前培育成的品種還較少。通過多倍體育種可以得到生長速度快、品質(zhì)優(yōu)良的品種，大大縮短培育時間，提高自身價值。本次試驗所用材料三角楓1號無性系為自然變異，相比人工誘導，自然多倍體經(jīng)過長時間的適應和選擇，在長勢和抗逆性方面優(yōu)于人工誘導多倍體，更具有利用價值[16]。

多倍體的形態(tài)和生理效應，在很大程度上有賴于原來二倍體基因型的性質(zhì)。相對二倍體來說，多倍體在在植物形態(tài)上都有所改變，生長量增加、葉面積增大、葉片厚度變厚、氣孔變大、氣孔密度減小等。多倍體由于體細胞的增大，細胞表面積相應縮小，在生理特性方面也常常與二倍體不同；多倍體常表現(xiàn)出含水量較多，滲透壓低，代謝強度較低，生育期較長。但是個別器官和整株的最后大小，不僅受細胞原有大小的影響，還受細胞伸長長度和細胞數(shù)目的影響。多倍體對細胞的伸長和細胞的分裂都可能不產(chǎn)生影響，植物的多倍體其染色體增加的倍數(shù)存在一定的范圍，超出此范圍，植物的生長可能會受到染色體的增多而受到抑制，還可能由于染色體的極度增加而引起核力學上的困難和其它的不平衡，最終形成障礙[17]。因此，單從形態(tài)學參數(shù)上來確定是否是多倍體，存在較大誤差，還需要進一步進行倍性鑒定。Zhang X Y對紫薇的研究中，從形態(tài)學角度鑒定為多倍體的植物，通過流式細胞儀檢測，只有50%為多倍體。同時在人工誘導多倍體的形成中，存在著大量的嵌合體。在相同脫蠟處理下，三角楓1號葉片殘存大量破損蠟質(zhì)層，2號葉片表面蠟質(zhì)完全脫掉，因此我們推測蠟質(zhì)殘留可能與兩種無性系間抗逆性或蠟質(zhì)層成分有關，這需要深入的研究進行驗證。

表2 葉片氣孔特征比較

表3 形態(tài)學比較

圖2 三角楓無性系氣孔及形態(tài)特征比較

本試驗通過流式細胞儀檢測，三角楓1號無性系葉片單細胞DNA含量是二倍體的兩倍，2號無性系葉片單細胞DNA含量與二倍體相同；三角楓1號無性系的氣孔長度比2號無性系大38.51%，氣孔密度比2號無性系小33.57%；三角楓1號無性系在胸徑、樹高、葉厚、葉片大小、保衛(wèi)細胞大小等方面均顯著大于2號無性系。因此，三角楓1號無性系是四倍體，三角楓2號無性系是二倍體。