氣管給藥法檢測甲醛對小鼠肺組織氧化損傷的研究

蒙 愛，任 帥，蔣 婕，陳 鳳，張立娜

（東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

甲醛在人們的日常生活及居住環(huán)境中引起越來越多的關(guān)注。因其用途廣泛，生產(chǎn)工藝簡單，在家庭裝修中使用于各種板制品中，是室內(nèi)裝修中主要的污染源之一［1］。當(dāng)甲醛在室內(nèi)達(dá)到一定濃度時(shí)，可引起眼部及咽喉不適、胸悶、頭暈等神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)。多項(xiàng)研究表明，甲醛對人體的皮膚黏膜具有強(qiáng)烈的刺激作用，且具有致敏、致突變的作用，對人及動物機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)產(chǎn)生損傷，尤其對呼吸系統(tǒng)損傷較大［2-3］。甲醛對實(shí)驗(yàn)動物機(jī)體損害的研究較多，所采用的方法大多都是將實(shí)驗(yàn)動物置于一定的密閉空間中，在該空間內(nèi)釋放一定濃度的甲醛氣體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。該種研究方法的優(yōu)點(diǎn)是可以模擬特定的居住環(huán)境，缺點(diǎn)是不能明確實(shí)驗(yàn)動物個(gè)體的甲醛吸入量。筆者以小鼠為研究對象，采用氣管給藥法，使液態(tài)甲醛直接進(jìn)入小鼠呼吸系統(tǒng)，在明確小鼠個(gè)體甲醛吸入量的基礎(chǔ)上，觀察給予不同劑量液體甲醛對小鼠肺組織的影響，以期為探明甲醛對人體及動物肺組織氧化損傷的分子機(jī)理提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

雄性成年BALB/c小鼠共30只，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，體重約20 g，稱重后隨機(jī)分成3組，分別為低劑量組、高劑量組和生理鹽水對照組。

1.2 主要試劑與儀器

組織勻漿機(jī)、酶標(biāo)儀。SP-A含量、SOD活力及MDA含量檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。染毒試劑為40%甲醛。HE切片制作使用的乙醇為分析純。

表1 甲醛對小鼠肺組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

圖1 吸入液態(tài)甲醛對小鼠肺組織結(jié)構(gòu)的影響（HE染色，100×）

1.3 試驗(yàn)方法

低劑量組：將原液用生理鹽水稀釋5 000倍后，每只小鼠給藥終濃度為 0.2 mg/（kg·BW），給藥終體積為16.5 μL；高劑量組：將原液用生理鹽水稀釋50倍后，每只小鼠給藥終濃度為20mg/（kg·BW），給藥終體積為16.5 μL；生理鹽水對照組：每只小鼠給予生理鹽水16.5 μL。

采用氣管直接注入的方式進(jìn)行染毒處理，按照設(shè)計(jì)的劑量每天對每只小鼠氣管給藥染毒1次，并在染毒后觀察死亡情況，確定沒有發(fā)生窒息及死亡現(xiàn)象后，連續(xù)染毒15 d。飼養(yǎng)期間給予正常飲水和飼料。各組小鼠連續(xù)飼養(yǎng)4周，采取折頸法處死。小鼠處死后，立即摘取其肺組織，肺左葉加入肺組織重量9倍的PBS溶液，放入組織勻漿機(jī)中冰浴勻漿5 min，取制備的組織勻漿液，按照試劑盒說明書測定氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)。采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測定小鼠肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A（SP-A）含量、肺組織SOD活力及MDA含量。肺右葉用4%多聚甲醛固定后，按照常規(guī)石蠟切片制作方法，逐步進(jìn)行脫水、透明、包埋、切片后進(jìn)行HE染色，制作成常規(guī)HE染色石蠟切片，在光鏡下進(jìn)行觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，使用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 19.0進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲醛對小鼠肺組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

由表1可知，通過氣管給藥吸入不同劑量的甲醛溶液之后，小鼠肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A（SP-A）含量與生理鹽水對照組相比呈現(xiàn)劑量依賴性下降趨勢，高、低劑量組SP-A含量均顯著低于生理鹽水對照組（P<0.05），且高劑量組和低劑量組之間差異顯著（P<0.05）；小鼠肺組織SOD活力同樣呈現(xiàn)劑量依賴性下降趨勢，高、低劑量組肺組織SOD活力均顯著低于生理鹽水對照組 （P<0.05），高、低劑量組之間差異不顯著（P>0.05）；肺組織MDA含量與生理鹽水對照組相比呈劑量依賴性上升趨勢，高、低劑量組肺組織MDA含量均顯著高于生理鹽水對照組（P<0.05），且高劑量組和低劑量組之間差異顯著（P<0.05）。

2.2 甲醛對小鼠肺組織結(jié)構(gòu)的影響

由圖1A可見，生理鹽水對照組肺泡結(jié)構(gòu)完整；由圖1B、圖1C可見，低劑量組和高劑量組的肺泡間組織膨大，肺泡間質(zhì)細(xì)胞增多，且炎癥細(xì)胞增多，發(fā)生炎性浸潤。

3 討論

隨著人們環(huán)保意識的增強(qiáng)，甲醛污染問題也越來越突出，逐漸引起人們的重視，特別是家裝行業(yè)帶來的甲醛污染尤為突出。長時(shí)間處于甲醛污染物環(huán)境中會引起頭暈、頭痛、失眠和皮膚過敏等不同程度的神經(jīng)以及臟器反應(yīng)。甲醛經(jīng)呼吸進(jìn)入體內(nèi)后，會對臟器組織造成不同程度的損傷［4］。Green等［5］研究證明活性炭顆粒能將甲醛直接帶入呼吸道，且在呼吸道深部可以檢測到。該研究采用氣管染毒給藥方式，可以保證液體甲醛直達(dá)小鼠氣道深部，進(jìn)入肺組織后，液體甲醛會對肺部細(xì)胞的正常生理結(jié)構(gòu)造成損壞，進(jìn)而影響其代謝及氧化應(yīng)激反應(yīng)。與傳統(tǒng)的封閉廂式染毒方法相比，氣管染毒法能夠確保動物的吸入劑量是準(zhǔn)確、可控的，同時(shí)，氣管染毒法又可保證藥物從氣管吸入，直接到達(dá)氣管和肺部，便于觀察藥物對肺部的直接損傷，保證試驗(yàn)效果。通過試驗(yàn)結(jié)果可以看到，經(jīng)氣管染毒方法給予甲醛的小鼠肺組織發(fā)生明顯的炎性反應(yīng)，有大量炎性細(xì)胞浸潤，且引起肺泡內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。正常肺泡內(nèi)干燥、無液體，甲醛染毒會引起大量間質(zhì)細(xì)胞增生，分析原因可能是甲醛作為強(qiáng)氧化劑［6］，過量吸入可引起機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞損傷［7］。Dallas 等［8］研究表明甲醛可引起肺部巨噬細(xì)胞染色體斷裂，同時(shí)刺激皮質(zhì)激素的釋放，因此，可能導(dǎo)致肺毛細(xì)血管通透性增高，加速肺水腫的形成，激素含量測定的結(jié)果也間接驗(yàn)證了這一結(jié)果；同時(shí)，肺組織SP-A含量和SOD活力隨著染毒劑量的增加呈現(xiàn)下降趨勢。SOD作為生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，在清除自由基及防御中毒和腫瘤方面都有重要作用。MDA作為脂質(zhì)過氧化物的重要降解產(chǎn)物，可以反映機(jī)體過氧化的程度。小鼠肺臟MDA含量隨甲醛吸入劑量的升高而增加，提示隨著甲醛吸入劑量的升高，其氧化損傷程度增加，已經(jīng)超過了自身可以代償?shù)乃剑?-10］。下一步筆者將繼續(xù)探討氣管給藥劑量的安全范圍，從而為控制室內(nèi)甲醛污染提供試驗(yàn)依據(jù)。