基于cas9/gRNA創(chuàng)制毛果楊PtrFLA31/34突變體

位 珍 程玉祥 夏德安

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱 150040)

束狀阿拉伯半乳聚糖蛋白(fasciclin-like arabinogalactan proteins，F(xiàn)LA)是阿拉伯半乳聚糖蛋白(arabinogalactan proteins，AGPs)的一個(gè)亞家族，在植物根、莖、種子生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用。同時(shí)擁有fasciclin結(jié)構(gòu)域和AGP-like糖基化區(qū)域的氨基酸特征序列，被認(rèn)為是FLA家族成員,fasciclin結(jié)構(gòu)域約有110個(gè)氨基酸，但其分子功能還不清楚[1]。根據(jù)結(jié)構(gòu)域的不同，F(xiàn)LA被分成4個(gè)亞類(A-D)，其中A類包含一個(gè)fasciclin結(jié)構(gòu)域，其兩邊有AGP糖基化區(qū)域[2]。一些研究表明這個(gè)亞類FLA介入植物次生細(xì)胞壁功能：楊樹(shù)PopFLA1-10表達(dá)水平被受到的張力及壓力調(diào)控[3]；擬南芥AtFLA11和AtFLA12參與次生壁沉積[4～6]，AtFLA11/12雙突變體莖硬度和韌性均降低且微纖絲角增加[7]；百日菊Z(yǔ)eFLA11特異性表達(dá)在其木質(zhì)部組織[8]；過(guò)表達(dá)桉樹(shù)FLA導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞壁糖含量中木糖和果糖比例發(fā)生變化[9]。然而，樹(shù)木FLA基因敲除的表型，卻是值得關(guān)注或探究的。

樹(shù)木遺傳雜合度高、多伴進(jìn)行異交，傳統(tǒng)的基因突變方法或策略很難應(yīng)用于林木，導(dǎo)致無(wú)林木純合突變體應(yīng)用于其基因功能鑒定。Cas9/gRNA基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)，通過(guò)單鏈導(dǎo)向RNA(single guide RNA,gRNA)來(lái)識(shí)別目標(biāo)DNA序列，引導(dǎo)核酸酶Cas9剪切目標(biāo)DNA雙鏈、產(chǎn)生核酸編輯[10]，這一技術(shù)恰好避開(kāi)了傳統(tǒng)方法制作林木純合突變體所遇的障礙。目前，Cas9/gRNA已經(jīng)應(yīng)用于擬南芥、大豆、煙草、玉米等植物基因組編輯[11～14]，然而模式木本植物—毛果楊中該技術(shù)應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究中我們通過(guò)生物信息學(xué)方法識(shí)別毛果楊PtrFLA基因家族，進(jìn)化樹(shù)分析表明PtrFLA31和PtrFLA34屬于FLA的A亞族，且共同位列在進(jìn)化樹(shù)的一個(gè)小分支上?；贑as9/gRNA技術(shù)，我們制備出PtrFLA31/34雙基因突變體材料，為進(jìn)一步鑒定該基因功能奠定前提。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

溫室里栽培的3個(gè)月的毛果楊(Populustrichocarpa)幼樹(shù)用于基因表達(dá)分析，1個(gè)月的無(wú)菌組培幼苗用于遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

植物總RNA提取試劑pBIOZOL Reagent(Bioflux)，植物基因組DNA快速提取試劑(Bioteke)，cDNA合成用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA eraser(Takara)，高保真DNA聚合酶為KOD-Plus(Toyobo),膠內(nèi)DNA采用Silica Bead DNA Gel Extrction Kit(Thermo Scientific)回收。質(zhì)粒采用E.A.N.A Plasmid Mini Kit(Omega)提取，基因引物合成以及DNA測(cè)序由Invitrogen公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 毛果楊PtrFLAs家族成員識(shí)別

分別以21個(gè)擬南芥FLA家族成員氨基酸序列，在毛果楊基因組數(shù)據(jù)庫(kù)Phytozome 12.0中進(jìn)行同源性檢索，并結(jié)合fasciclin和fasciclin-like關(guān)鍵詞檢索，去除重復(fù)基因后對(duì)所有潛在的FLA成員用SMART[15]確認(rèn)存在fasciclin結(jié)構(gòu)域(SM00554)。對(duì)識(shí)別出的FLA家族成員，用SignalP 4.1[16]預(yù)測(cè)成員N端是否有信號(hào)肽，手動(dòng)分析AGP-like糖基化區(qū)域。用MEGA軟件構(gòu)建擬南芥和毛果楊FLA家族成員的進(jìn)化樹(shù)。

1.2.2植物總RNA分離、總cDNA合成和基因組DNA提取

各個(gè)組織莖節(jié)的總RNA提取參照試劑盒提取步驟進(jìn)行，植物總RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)一步合成cDNA，基因組DNA提取采用一步法提取。

1.2.3 植物靶基因編輯載體構(gòu)建

用高保真DNA聚合酶KOD-plus擴(kuò)增PtrFLA31/34靶位點(diǎn)的gRNA片段，片段膠內(nèi)回收后在核酸內(nèi)切酶BsaⅠ和高濃度DNA連接酶作用下，連接到植物基因編輯載體pHSE401[17]。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，經(jīng)Kana抗性篩選后得到含pHSE401-gRNA重組質(zhì)粒菌液，DNA測(cè)序確認(rèn)重組質(zhì)粒正確。提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌，用于毛果楊遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 毛果楊遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株鑒定

取25～35 d生長(zhǎng)狀況良好的毛果楊作為遺傳轉(zhuǎn)化材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行毛果楊轉(zhuǎn)基因[18]。取轉(zhuǎn)基因植株的少量葉片，提取基因組DNA后用作模板，用DT1-F0/DT2-R0和zCas-U/D引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定轉(zhuǎn)入的gRNA和Cas9基因。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)靶基因位點(diǎn)編輯鑒定

取轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA作模板，以FLA31-U/D及FLA34-U/D引物，進(jìn)行覆蓋靶位點(diǎn)片段的PCR擴(kuò)增。片段從膠內(nèi)回收后連接到pMD18-T載體，將連接產(chǎn)物取3 μL轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌，氨芐抗性篩選獲得陽(yáng)性菌液進(jìn)行插入DNA的測(cè)序。與野生型比對(duì)測(cè)序結(jié)果，統(tǒng)計(jì)靶基因位點(diǎn)編輯情況，所用引物及序列(表1)。

表1 所用引物及序列

表2 毛果楊FLA家族成員

圖1 毛果楊和擬南芥FLA基因進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of FLAs from Arabidopsis thaliana and P.trichocarpa

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹(shù)FLA家族識(shí)別

用生物信息學(xué)方法我們從毛果楊基因組上鑒定出46個(gè)FLA家族成員(表2)，命名為PtrFLA1到PtrFLA46。在這46個(gè)PtrFLA家族成員中，其推測(cè)氨基酸長(zhǎng)度從214到466個(gè)。39個(gè)PtrFLA成員預(yù)測(cè)有信號(hào)肽，38個(gè)成員有1個(gè)Fas結(jié)構(gòu)域，8個(gè)成員有2個(gè)Fas結(jié)構(gòu)域。

為了分析PtrFLA家族成員的同源關(guān)系，構(gòu)建了21個(gè)擬南芥AtFLA和46個(gè)毛果楊PtrFLA進(jìn)化樹(shù)(圖1)。進(jìn)化樹(shù)表明毛果楊FLA家族成員分處在4個(gè)亞類上(A、B、C和D)，其中A亞類包含了毛果楊FLA家族的大多數(shù)成員(27個(gè))，比另外3個(gè)亞類(分別為6、6、7個(gè))的總數(shù)還多。此外，擬南芥A亞類FLA卻只有6個(gè)成員，暗示這些基因可能參與木本植物高度發(fā)達(dá)的次生生長(zhǎng)相關(guān)。

2.2 PtrFLA31和PtrFLA34基因組織轉(zhuǎn)錄表達(dá)

提取野生型毛果楊木質(zhì)部、韌皮部、根、頂芽、葉柄、幼葉、老葉以及第1至10莖節(jié)的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成了總cDNA。在用Actin2內(nèi)標(biāo)基因?qū)Ω鹘M織總cDNA定量后，PtrFLA31和PtrFLA34基因半定量RT-PCR結(jié)果表明，PtrFLA31和PtrFLA34均在木質(zhì)部高豐度轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在韌皮部也有一定量的表達(dá)水平，而根、頂芽、葉柄、幼葉和老葉內(nèi)幾乎不表達(dá)(圖2)。此外，第1、2莖節(jié)中PtrFLA31和PtrFLA34轉(zhuǎn)錄量極低，從第3至6節(jié)轉(zhuǎn)錄量表達(dá)逐漸增加，第7至10節(jié)維持在較高的表達(dá)水平(圖2)。

圖2 PtrFLA31和PtrFLA34的組織表達(dá)分析 1～10. 第1～10莖間Fig.2 Analysis of PtrFLA31 and PtrFLA34 gene expression in Populus 1-10. Internodes 1-10

2.3 PtrFLA3/34基因Cas9/gRNA載體構(gòu)建

PtrFLA31和PtrFLA34在進(jìn)化樹(shù)的一個(gè)小分支，且兩者氨基酸序列一致性達(dá)86.9%，顯示這兩個(gè)基因功能可能存在冗余。為了鑒定其敲除的功能，我們采用Cas9/gRNA編輯技術(shù)敲除PtrFLA31/34基因。先設(shè)計(jì)2個(gè)PtrFLA31/34基因特異靶位點(diǎn)的gRNA(圖3a)，T1-PtrFLA31/34(gRNA)針對(duì)PtrFLA31/34基因，而T1-PtrFLA34(gRNA)僅針對(duì)PtrFLA34。經(jīng)PCR擴(kuò)增出含這2個(gè)gRNA的片段，在酶切后連接到植物基因編輯載體pHSE401(圖3b)。將構(gòu)建的pHSE401-PtrFLA31/34(gRNA)載體進(jìn)行DNA測(cè)序，確認(rèn)Cas9/gRNA載體構(gòu)建成功。

圖3 pHSE401-PtrFLA31/34(gRNA)載體構(gòu)建 a.靶點(diǎn)位置及序列；b.CRISPR/Cas9植物基因編輯載體Fig.3 Construction of pHSE401-PtrFLA31/34(gRNA)a. Position and sequence of target site； b. Physical map of CRISPR/Cas9 vectors

2.4 pHSE401-PtrFLA3/34(gRNA)轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)及分子鑒定

選擇生長(zhǎng)至一個(gè)月的無(wú)菌組培幼苗(圖4a①)，切取第2至4莖節(jié)成1 cm莖段，農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化后莖段暗室培養(yǎng)48 h(圖4a②)，脫菌清洗后放入選擇培養(yǎng)基(圖4a③)，培養(yǎng)30 d后愈傷組織分化出抗性芽(圖4a④)，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)(圖4a⑤)，等抗性芽長(zhǎng)至3～5 cm盆栽到土壤中(圖4a⑥)。實(shí)驗(yàn)得到3棵轉(zhuǎn)基因植株(L1、L2和L3)，分別提取這三棵轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA，PCR擴(kuò)增Cas9和gRNA這2個(gè)目標(biāo)基因，結(jié)果表明該基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入到毛果楊基因組上(圖4b)。

圖4 轉(zhuǎn)pHSE401-PtrFLA31/34(gRNA)基因楊樹(shù)制備及分子鑒定 a.楊樹(shù)轉(zhuǎn)基因過(guò)程簡(jiǎn)圖：①毛果楊無(wú)菌組培幼苗；②轉(zhuǎn)化后48 h共培養(yǎng)莖段；③轉(zhuǎn)化后篩選培養(yǎng)基的莖段；④長(zhǎng)出轉(zhuǎn)基因抗性芽的莖段(箭頭所示)；⑤抗性植株的生根；⑥轉(zhuǎn)基因植株盆栽 b.轉(zhuǎn)基因植株分子鑒定Fig.4 Transformation of pHSE401-PtrFLA31/34(gRNA) in Populus and its molecular determination a. Transgenic process of pHSE401-PtrFLA31/34(gRNA) in Populus: ①Young plantlets of tissue culture; ②Cocultured stem segments after transformation; ③The stem segments in selective medium; ④Hygromycin-resistant shoots(arrows); ⑤Hygromycin-resistant plants on rooting medium; ⑥Transgenic plants on soil b.Molecular determination of transgenic plants

圖5 PtrFLA31/34基因編輯分析 a.PtrFLA31和PtrFLA34的編輯情況；b.PtrFLA31和PtrFLA34基因編輯后推測(cè)氨基酸Fig.5 Analysis of PtrFLA31/34 gene editing in transgenic Populus a. PtrFLA31 and PtrFLA34 gene editing identified from the cloned PCR fragments; b. The presumed amino acids of PtrFLA31 and PtrFLA34 after editing

2.5 PtrFLA31/34基因靶位點(diǎn)編輯分析

PtrFLA31/34基因位點(diǎn)編輯結(jié)果如圖5a所示，對(duì)于T1-PtrFLA31/34(gRNA)，L1和L3轉(zhuǎn)基因植株P(guān)trFLA31基因靶位點(diǎn)被編輯、減少1個(gè)T堿基，L2中PtrFLA31靶位點(diǎn)減少2個(gè)T堿基。PtrFLA34靶位點(diǎn)在L1和L2中也被編輯減少1個(gè)T堿基，而L3中PtrFLA34呈現(xiàn)雙等位編輯，分別增加和減少1個(gè)T。對(duì)于T2-PtrFLA34(gRNA)，L1和L2植株體內(nèi)PtrFLA34靶位點(diǎn)分別被減少199和20個(gè)堿基，而L3植株體內(nèi)PtrFLA34靶位點(diǎn)未被編輯。分析PtrFLA31/34基因兩個(gè)靶位點(diǎn)編輯后的序列，推測(cè)其氨基酸結(jié)果如圖5b所示，因移碼而產(chǎn)生目標(biāo)基因編碼的終止子提前出現(xiàn)，導(dǎo)致了L1、L2和L3體內(nèi)PtrFLA31和PtrFLA34均被敲除，形成了fla31/34雙基因突變體。

3 討論

隨著植物基因組資源增多，多個(gè)植物FLA基因家族被識(shí)別報(bào)道，如：擬南芥、水稻和棉花分別有21、24和19個(gè)FLA基因[2,19～20]。我們從毛果楊中識(shí)別出46個(gè)PtrFLA基因(表1)，基因數(shù)量明顯比已報(bào)道的草本植物FLA的多，這暗示林木FLA基因家族產(chǎn)生了顯著擴(kuò)張。FLA是植物細(xì)胞壁的成分蛋白，這種基因數(shù)量的擴(kuò)張很可能是滿足樹(shù)木從草本進(jìn)化成木本植物的需要，因?yàn)闃?shù)木進(jìn)化出高度發(fā)達(dá)的次生壁組織。我們進(jìn)化樹(shù)分析進(jìn)一步表明毛果楊FLA家族成員同樣分為4個(gè)亞類(圖1)，與草本植物FLA分類相同。然而，引人關(guān)注是PtrFLA家族A亞類包含27個(gè)基因，約占據(jù)其整個(gè)家族成員的一半，這種基因擴(kuò)張可能與毛果楊某種生長(zhǎng)性狀(例如發(fā)達(dá)的次生壁組織)密不可分。

FLA作為一種植物細(xì)胞壁蛋白參與植物細(xì)胞伸長(zhǎng)、感應(yīng)外界環(huán)境因子信號(hào)等，而AtFLA11和AtFLA12已被報(bào)道與植物次生壁形成相關(guān)[7]。在本研究中我們通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析確定，PtrFLA31和PtrFLA34主要在毛果楊次生生長(zhǎng)發(fā)達(dá)的組織內(nèi)高豐度表達(dá)，如莖節(jié)和木質(zhì)部(圖2)，這個(gè)結(jié)果提示此亞類FLA成員很可能參與楊樹(shù)木材的生長(zhǎng)和發(fā)育。有一個(gè)研究報(bào)道，在桉樹(shù)FLA家族中A亞類的3個(gè)成員EniFLA1/2/3也在木質(zhì)部高豐度表達(dá)[6]。然而，PtrFLA31和PtrFLA34在木材形成上的功能，需要利用其突變體來(lái)準(zhǔn)確鑒定。

Cas9/gRNA植物基因組編輯技術(shù)已應(yīng)用在多個(gè)植物物種，包括：擬南芥、大豆、煙草、玉米等[11～14]，對(duì)林木物種來(lái)說(shuō)，非常適合應(yīng)用Cas9/gRNA基因編輯技術(shù)幫助鑒定其基因功能和輔助分子育種，然而這方面的研究報(bào)道甚少。本研究中我們創(chuàng)建模式樹(shù)毛果楊的Cas9/gRNA基因編輯技術(shù)體系，嘗試并實(shí)現(xiàn)了對(duì)毛果楊PtrFLA31和PtrFLA34雙基因同時(shí)編輯(圖5)。編輯后的PtrFLA31和PtrFLA34基因序列產(chǎn)生終止子提前，形成這兩基因被敲除的雙突變體。Cas9/gRNA技術(shù)在毛果楊中被有效的建立，解決了用傳統(tǒng)方法幾乎很難制作林木基因突變體的困境，這個(gè)技術(shù)將加速林木功能基因組鑒定的進(jìn)展。此外，我們獲得的3株毛果楊fla31/34敲除突變體，為下一步深入研究PtrFLA31和PtrFLA34基因功能提供了遺傳材料。