AMPK激動劑干預(yù)瘢痕疙瘩形成過程的實驗研究

蔡海豐 殷嘉菲 王琛 周仁鵬 王澤劍 王丹茹

瘢痕疙瘩（Keloid）是指皮膚創(chuàng)面自愈時，局部組織受過度增生的膠原纖維的影響而呈現(xiàn)的瘢痕化的過度纖維化病理損傷。瘢痕疙瘩超出原有損傷范圍而過度生長并侵犯周圍皮膚，呈瘤樣增生，這種瘢痕組織一般都呈現(xiàn)出較為活躍的生長代謝現(xiàn)象，且基本都不會進入成熟期[1-2]。目前的治療方法主要為局部注射糖皮質(zhì)激素、放療、服用抗代謝藥物或抗腫瘤藥物等，但均無法根治。

瘢痕疙瘩的形成機制不明確。研究表明，瘢痕疙瘩具有與腫瘤相似的生物學(xué)特性，被認(rèn)為是一種皮膚的良性腫瘤[3]。腫瘤中存在缺氧環(huán)境，存在Warburg現(xiàn)象，導(dǎo)致其能量代謝存在異常[4]。瘢痕疙瘩組織中也存在局部缺氧微環(huán)境，且瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞具有與腫瘤細(xì)胞類似的代謝方式[5]，細(xì)胞表型與腫瘤類似，能量代謝存在異常，且具有干性。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是細(xì)胞內(nèi)的能量感受器，是重要的蛋白激酶，參與多個代謝過程，在真核細(xì)胞生物中廣泛存在，主要負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的代謝和能量平衡。AMPK激動劑能通過促進葡萄糖攝取，抑制糖原合成，逆轉(zhuǎn)Warburg現(xiàn)象，改善腫瘤細(xì)胞的能量代謝[6-8]。二甲雙胍是一種常見的抗糖尿病藥物，也是一種AMPK激動劑，Würth等[9]的研究表明，該藥物具有抗腫瘤作用。但目前還沒有針對AMPK激動劑在干預(yù)瘢痕疙瘩形成中的作用的研究。

肌成纖維細(xì)胞在創(chuàng)傷修復(fù)中起著重要的作用，病理情況下，肌成纖維細(xì)胞的持續(xù)存在可能引起病理性瘢痕[10]。過去認(rèn)為，增生性瘢痕中存在肌成纖維細(xì)胞，而瘢痕疙瘩中不存在[11]。但是，新的研究表明，瘢痕疙瘩中α-SMA（肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞的主要標(biāo)志物）的表達(dá)與增生性瘢痕沒有顯著差異[12]。研究提示，皮膚成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化可能是瘢痕疙瘩形成和發(fā)展的重要機制[13-14]，Zhao等[15]通過人羊膜上皮細(xì)胞抑制該過程，以此來控制瘢痕疙瘩的形成。本實驗在此基礎(chǔ)上進一步探討肌成纖維細(xì)胞在瘢痕疙瘩形成過程中的作用。

本實驗擬從AMPK改善能量代謝的角度來探究其對瘢痕疙瘩的形成過程的干擾，為今后的瘢痕疙瘩相關(guān)研究及臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

人皮膚成纖維細(xì)胞 （Human skin fibroblasts，hSF）由上海交通大學(xué)殷明實驗室贈予。

A769662（Targetmol，美國）；TGF-β（Protein Tech，美國）；磷酸酶抑制劑和復(fù)合蛋白酶抑制劑（Roche，美國）；苯甲基磺酰氟PMSF和RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑、蛋白變性試劑（碧云天生物技術(shù)研究所）；Western blot相關(guān)試劑（Amersco，美國）；ACTA2、E-cadherin、CollagenⅠ、Viementin、IRS-1、Glut4、PH2AX、H2AX、NANOG、OCT4、GAPDH、羊抗鼠 IgG、羊抗兔 IgG（Proteintech，美國），ELISA 試劑盒（XinlePcc，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 hSF培養(yǎng)、復(fù)蘇、傳代

將細(xì)胞凍存管從液氮內(nèi)取出，快速置于37℃水浴中，反復(fù)輕搖解凍；將凍存管內(nèi)的細(xì)胞懸液加入含4 mL DMEM培養(yǎng)基的15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min去除DMSO，將培養(yǎng)基吸取干凈，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，最后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞融合達(dá)80%～90%后，0.25%Trypsin-EDTA消化傳代，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取第3～5代細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 hSF表型轉(zhuǎn)化環(huán)境的構(gòu)建及驗證

將培養(yǎng)有hSF的培養(yǎng)皿置入封箱，在培養(yǎng)皿邊上放置蠟燭并點燃，同時封閉封箱。蠟燭自動熄滅，即表明低氧環(huán)境已構(gòu)造完畢。將封箱置于37℃恒溫培養(yǎng)，每6 h觀察細(xì)胞形態(tài)變化，共72 h。上述方法有效后，取濃度為8×104cells/mL的細(xì)胞懸液接種于6孔板，每組設(shè)3個復(fù)孔，每孔2.5 mL，重復(fù)低氧環(huán)境，并加入不同濃度的 TGF-β1（0 ng/mL、2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL 和 20 ng/mL）以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，并篩選最佳誘導(dǎo)濃度，通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及Western blot檢測 （相關(guān)標(biāo)志物包括 E-cadherin、Vimentin、ACTA2、Collagen I等）來驗證誘導(dǎo)結(jié)果。

1.2.3 AMPK激動劑干預(yù)hSF表型轉(zhuǎn)化

在以同一濃度TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞模型上，加入不同劑量（2.5 μmol、5 μmol、10 μmol和 20 μmol）AMPK激動劑（A769662），每組設(shè)3個復(fù)孔，每6 h光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，48 h后取細(xì)胞樣本進行Western blot及ELISA檢測。

1.2.4 Western blot測定AMPK激動劑干預(yù)效果

收集單獨缺氧狀態(tài)下培養(yǎng)的hSF、缺氧及最佳TGF-β1濃度誘導(dǎo)下的hSF，以及加入不同濃度AMPK激動劑誘導(dǎo)后的hSF，分別以適量RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。BCA法測定蛋白濃度。蛋白提取液中加入等量電泳緩沖液電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜，5%BSA溶液室溫封閉1 h；加入3 μL一抗，4℃孵育過夜；TBST洗膜5 min，3次；加相應(yīng)的二抗室溫孵育2 h；TBST洗膜10 min，3次；用化學(xué)發(fā)光法檢測不同樣品蛋白 （ACTA2、E-cadherin、CollagenⅠ、Vimentin、IRS-1、Glut4、P-H2AX、H2AX、NANOG、OCT4）的表達(dá)狀況。

1.2.5 ELISA測定hSF表型轉(zhuǎn)化的相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)

標(biāo)準(zhǔn)品溶液依次按倍數(shù)稀釋至5～640 ng/mL。標(biāo)準(zhǔn)品孔加標(biāo)準(zhǔn)品和鏈霉素-HRP各50 μL，待測樣品孔先加40 μL樣本（細(xì)胞培養(yǎng)液上清），再加50 μL鏈霉素-HRP和10 μL抗IL-6抗體（或抗VEGF抗體），混勻。將酶標(biāo)板存于37℃溫箱內(nèi)1 h，揭去封板膜，各孔洗滌5次，加入顯色液顯色，加入終止液，10 min后于450 nm處進行吸光度測定。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)檢測均重復(fù)3次，結(jié)果以（x±s）表示。采用SPSS21.0行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用t檢驗，若不滿足正態(tài)分布則選用非參數(shù)檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)

2.1.1 無氧環(huán)境構(gòu)造

細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，處于缺氧狀態(tài)下的hSF形態(tài)改變，由典型紡錘形變?yōu)槎噙呅危▓D1）。

2.1.2 TGF-β1誘導(dǎo)hSF表型轉(zhuǎn)化

為驗證TGF-β1在hSF向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化過程中的誘導(dǎo)作用[16]，并探討其誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化效應(yīng)的劑量關(guān)系，本實驗在模擬缺氧條件下，加入不同濃度TGF-β1。結(jié)果顯示，隨著TGF-β1濃度提高，hSF紡錘形態(tài)喪失；當(dāng)TGF-β1濃度達(dá)到10.0 ng/mL時，細(xì)胞呈現(xiàn)出團狀結(jié)構(gòu)（圖2）。

2.2 Western blot檢測

Western blot檢測不同濃度的 TGF-β1對 hSF的 Vimentin、E-cadherin、ACTA2、CollagenⅠ蛋白表達(dá)的影響，實驗選用GAPDH作為內(nèi)參。

2.2.1 TGF-β1誘導(dǎo)hSF表型轉(zhuǎn)化

Western blot結(jié)果顯示，隨TGF-β1濃度升高，E-cadherin表達(dá)逐漸受到抑制，至10 ng/mL后抑制作用減弱；Vimentin、ACTA、CollagenⅠ的表達(dá)則明顯增強，隨TGF-β1濃度升高，促進作用增強，直至10 ng/mL后，效果開始減弱。實驗表明，在TGF-β1濃度不斷增加至10 ng/mL的過程中，TGF-β1刺激hSF增殖并向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，而濃度繼續(xù)增加時，效果出現(xiàn)停滯并呈現(xiàn)逆轉(zhuǎn)跡象。因此，刺激hSF表型向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的最佳濃度應(yīng)不超過10 ng/mL（圖3）。

2.2.2 Western blot檢測AMPK激動劑對hSF表型轉(zhuǎn)化的干預(yù)作用

Western blot檢測顯示，加入AMPK激動劑后，E-cadherin的表達(dá)逐步上調(diào)；Vimentin、ACTA的表達(dá)則逐步下調(diào)，CollagenⅠ也逐步減少；而干性標(biāo)志Nanong、Oct4的表達(dá)也隨之下調(diào)；同時，H2AX磷酸化活化水平也被抑制，而Glut4和IRS-1的表達(dá)均逐步上調(diào)。以上結(jié)果說明，隨著AMPK激動劑劑量的增加，hSF向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的過程被逐步干預(yù)（圖4）。

2.3 ELISA測定

瘢痕疙瘩組織內(nèi)存在低氧微環(huán)境，其中缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）是響應(yīng)于低氧環(huán)境的主要轉(zhuǎn)錄因子。在缺氧環(huán)境下，HIF-1α高表達(dá)，通過轉(zhuǎn)錄激活機制來提高VEGF的合成[5，17]。ELISA測定顯示，在缺氧環(huán)境下，hSF中的VEGF和IL-6的表達(dá)均明顯提高，在TGF-β1誘導(dǎo)下，VEGF和IL-6的合成進一步增加，而隨著AMPK激動劑的添加，VEGF及IL-6的表達(dá)逐步減少，從而達(dá)到抑制hSF向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的作用（圖5）。

圖1 人皮膚成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Morphology observation of human fibroblast

圖2 缺氧條件下，加入不同濃度TGF-β1后hSF的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察Fig.2 Morphology observation of human fibroblasts after different concentrations of TGF-β1 added under hypoxia condition

圖3 缺氧條件下，加入不同濃度的TGF-β1對hSF表型轉(zhuǎn)化的影響Fig.3 The effects of different concentrations of TGF-β1 on phenotype transformation of human fibroblasts under hypoxia condition

圖5 ELISA檢測IL6和VEGF在不同劑量AMPK激動劑作用下的表達(dá)（*：P＜0.05；**：P＜0.01）Fig.5 The expression of IL-6 and VEGF after the addition of AMPK agonist tested by ELISA analysis(*:P＜0.05;**:P＜0.01)

圖4 加入同一濃度的TGF-β1使hSF向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化后，不同劑量的AMPK激動劑（A769662）對hSF表型向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的干預(yù)Fig.4 The intervention effect of different doses of AMPK agonist(A769662)on myofibrosis of human fibroblasts after adding the same concentration of TGF-β1 which induced myofibrosis of human fibroblasts

3 討論

瘢痕疙瘩實際上是在機體皮膚創(chuàng)口恢復(fù)過程中出現(xiàn)的過度纖維化問題。正常情況下，人體膠原的分解和合成是相互協(xié)調(diào)和統(tǒng)一的，但皮膚損傷后，會導(dǎo)致膠原合成能力增強，進而打破膠原分解與合成的動態(tài)平衡，造成膠原異常堆積而導(dǎo)致瘢痕的出現(xiàn)。肌成纖維細(xì)胞在病理性愈合中起著重要作用，其持續(xù)出現(xiàn)是典型的異常愈合，如瘢痕疙瘩[10，18]。

本研究中，我們將瘢痕疙瘩中的主要細(xì)胞hSF作為研究目標(biāo)，基于瘢痕疙瘩中主要存在缺氧及慢性炎癥微環(huán)境的事實，構(gòu)建了體外缺氧及TGF-β1誘導(dǎo)的炎癥微環(huán)境，來建立hSF表型向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的體外模型。瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型可歸納為hSF向肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞轉(zhuǎn)化，能量代謝出現(xiàn)異常，細(xì)胞呈氧化應(yīng)激狀態(tài)，出現(xiàn)干性分化等。驗證該模型后，再加入不同濃度的AMPK激動劑，以探討其對hSF表型向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的干預(yù)作用。

本研究對瘢痕疙瘩的低氧微環(huán)境進行模擬。結(jié)果表明，hSF在不同的環(huán)境當(dāng)中會發(fā)生較大的形態(tài)變化，處于無氧環(huán)境中的hSF會迅速變成多邊形。TGF-β1能促進hSF內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)（如葡萄糖、氨基酸等）的代謝過程，使得細(xì)胞外基質(zhì)的合成增加[19]，還可促進hSF向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[20]。本研究結(jié)果表明，隨著TGF-β1濃度增加，hSF形態(tài)發(fā)生變化，逐漸向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變，并存在劑量效應(yīng)。本研究在缺氧環(huán)境內(nèi)不斷增加TGF-β1濃度，hSF多數(shù)喪失了原來的紡錘形而呈現(xiàn)扁平化，并逐漸聚集成團。該結(jié)果說明，TGF-β1可誘導(dǎo)hSF表型向人肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并可提升hSF的遷移運動能力。

以往研究發(fā)現(xiàn)，AMPK具有改善腫瘤能量代謝，逆轉(zhuǎn)Warburg現(xiàn)象的作用[6-8]。二甲雙胍（AMPK激動劑）也已被證明具有抗腫瘤作用[9]。但AMPK激動劑在瘢痕疙瘩上的應(yīng)用尚未見報道。我們在瘢痕疙瘩體外模型構(gòu)建成功后，加入不同劑量的AMPK激動劑（A769662）來對其進行干預(yù)。結(jié)果顯示，hSF出現(xiàn)顯著的干性分化特點，細(xì)胞形態(tài)逐步趨向于向具有多觸角的形態(tài)分化。隨著AMPK激動劑劑量的增加，其分化程度也相應(yīng)增加。這意味著AMPK激動劑可影響hSF表型向人肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程，進而對瘢痕疙瘩的形成過程進行干預(yù)。

本研究中，我們通過Western blot來定量分析瘢痕疙瘩體外模型相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)與TGF-β1濃度的關(guān)系，同時探討AMPK激動劑對hSF表型向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的干預(yù)作用。在對TGF-β1誘導(dǎo)hSF表型向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的干預(yù)作用進行定量定性分析用到的標(biāo)記物主要有：①上皮源性標(biāo)記物E-cadherin，②間葉源性標(biāo)記物Vimentin，③標(biāo)志性蛋白ACTA2，④膠原蛋白標(biāo)志CollagenⅠ。在研究AMPK激動劑對瘢痕疙瘩體外模型干預(yù)作用時，進一步選用的目標(biāo)蛋白監(jiān)測因子有：①NANOG、OCT4細(xì)胞干性標(biāo)志，②H2AX磷酸化標(biāo)志，③胰島素受體底物IRS-1，④葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白Glut4。通過這些監(jiān)測因子的使用，確定AMPK激動劑對H2AX活化程度、hSF表型向人肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程、細(xì)胞能量代謝，以及細(xì)胞永生化的影響，進而確定代謝在瘢痕疙瘩形成過程中所起的作用。首先，在缺氧條件及TGF-β1的作用下，hSF的E-cadherin表達(dá)呈明顯下調(diào)趨勢，Vimentin的表達(dá)上調(diào)；此外，肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物ACTA2的表達(dá)也相應(yīng)增強。說明hSF在向肌成纖維相關(guān)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，并且CollagenⅠ表達(dá)也明顯提升。上述結(jié)果表明，TGF-β1可使hSF向肌成纖維細(xì)胞分化，其結(jié)果是造成細(xì)胞外基質(zhì)含量提升，在hSF向肌成纖維細(xì)胞分化過程中扮演著重要角色，產(chǎn)生病理性愈合，進而導(dǎo)致瘢痕疙瘩的形成。

其次，在人為造成的缺氧和炎癥微環(huán)境誘導(dǎo)的瘢痕疙瘩化hSF中加入不同劑量AMPK激動劑后，hSF的膠原表達(dá)被抑制，而且Vimentin和ACTA的表達(dá)都呈明顯的下調(diào)趨勢，同時hSF膠原表達(dá)也相應(yīng)下降，而E-cadherin的表達(dá)被顯著上調(diào)。由此推測，AMPK激動劑可減緩hSF向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。此外，干性標(biāo)志物Nanong、Oct4等的表達(dá)也呈明顯的下調(diào)趨勢。H2AX磷酸化水平也明顯減弱，表明氧化應(yīng)激導(dǎo)致的DNA損傷被逆轉(zhuǎn)。IRS-1和Glut4都呈現(xiàn)出不同程度的上調(diào)，說明誘導(dǎo)模型對葡萄糖的攝取能力提升，能量代謝被改善。

TGF-β1和組織缺氧等因素均可直接激活A(yù)MPK。由Western blot結(jié)果分析可知，隨著AMPK激動劑劑量增加，H2AX磷酸化程度降低，hSF表型向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化被抑制。DNA雙鏈斷裂標(biāo)志物pH2AX/H2AX的表達(dá)降低，則提示受DNA損傷修復(fù)影響而產(chǎn)生的細(xì)胞周期停滯得到緩解。Glut4和IRS-1的表達(dá)上調(diào)，提示糖異生被降低，細(xì)胞糖原的合成減少；同時，IRS-1的表達(dá)上調(diào)，意味著hSF表型向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的過程被逐步抑制。在AMPK激動劑的作用下，細(xì)胞逐步衰老，表明細(xì)胞的永生化被逆轉(zhuǎn)，從而達(dá)到抑制瘢痕疙瘩惡化的目的。

缺氧條件下，HIF-1α的表達(dá)增強，一旦被激活，可以極大提升VEGF的表達(dá)水平[17，21]。本研究進一步通過 ELISA檢測來研究hSF表型向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化受AMPK激動劑的影響程度。結(jié)果表明，與正常狀態(tài)下的機體細(xì)胞相比，hSF內(nèi)的VEGF和IL-6的表達(dá)量增加，從而使得血管生長因子與抑制因子的動態(tài)平衡被打破，VEGF合成也會在缺氧狀態(tài)中成倍增加而導(dǎo)致細(xì)胞遷移能力增強。隨著AMPK激動劑濃度的增加，IL-6活性和VEGF的產(chǎn)生都會有所下降，進而達(dá)到抑制細(xì)胞纖維化的目標(biāo)。

在后續(xù)研究中，我們將繼續(xù)研究瘢痕疙瘩來源成纖維細(xì)胞在誘導(dǎo)環(huán)境下的表型，以及AMPK激動劑對其的作用。同時，可以研究在不同炎癥的影響下，死亡細(xì)胞分泌Wnt3，從而誘導(dǎo)β-catenin介導(dǎo)的周圍成纖維前體細(xì)胞增殖過程，以及AMPK、NF-B等因素是否會導(dǎo)致瘢痕疙瘩的出現(xiàn)。此外，AMPK激動劑能否進一步在活體實驗上取得類似的效果也將是今后探索的方向。