程序性細(xì)胞死亡受體1配體在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)及臨床意義

梁莉，夏瑞祥，葛健

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，安徽 合肥 230022)

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)是成人非霍奇淋巴瘤中的主要類型，約占30%～40%，多見于中老年人，在中國以40～50歲患者居多。在近年治療方法的進(jìn)步下，一些患者預(yù)后良好，但仍有部分患者因疾病復(fù)發(fā)或者耐藥面臨治療效果差[1]，研究影響其臨床特征及預(yù)后的因素，為新的治療方案提供思路。

程序性死亡受體1配體(PD-L1)為B7家族中的一員，是一種跨膜蛋白。正常情形下免疫系統(tǒng)會(huì)對(duì)聚集在淋巴結(jié)或脾臟的外來抗原產(chǎn)生反應(yīng)，促進(jìn)具有抗原特異性的T細(xì)胞增生。而程序性死亡受體1(PD-1)及PD-L1結(jié)合后能產(chǎn)生抑制性信號(hào)，減少T細(xì)胞的產(chǎn)生,這一機(jī)制在自身免疫耐受及防止自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。多種腫瘤細(xì)胞表面也表達(dá) PD-L1，在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的PD-L1與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞表面的PD-1分子結(jié)合，抑制淋巴細(xì)胞功能和細(xì)胞因子釋放，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，從而抵抗淋巴細(xì)胞殺傷，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生免疫逃逸。與PD-L1結(jié)合的受體PD-1，在機(jī)制中也起著必不可少的作用，PD-1抗體已成為首款依照生物標(biāo)志物進(jìn)行癌癥治療的新藥，用于治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌，復(fù)發(fā)性及轉(zhuǎn)移性頭頸癌，難治性經(jīng)典霍奇金淋巴瘤或是尿路上皮癌的特定患者。近些年研究已經(jīng)證實(shí)PD-L1在多種腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織中均有表達(dá)[2-3]，對(duì)于PD-L1在DLBCL的表達(dá)相關(guān)研究仍需進(jìn)一步進(jìn)行，故本研究回顧性分析安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院80例DLBCL的患者病理組織中PD-L1的表達(dá)，并分析統(tǒng)計(jì)該些患者的年齡分期分組及療效，探討其相關(guān)性，為DLBCL患者的危險(xiǎn)分層提供新的方向，為下一步治療提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2012年2月至2015年6月期間于病理科經(jīng)組織形態(tài)學(xué)及免疫組織化學(xué)新診斷為DLBCL患者的甲醛固定石蠟包埋的病理組織標(biāo)本，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2008年WHO血液淋巴腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)[4]。要求：標(biāo)本獲得于新診斷且未接受任何化療時(shí)，并且保證患者臨床病例及預(yù)后資料完整,對(duì)于合并活動(dòng)性乙型肝炎病毒(HBV)感染及其他腫瘤的患者排除。本研究獲安徽醫(yī)科大學(xué)第一附院醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或近親屬對(duì)研究方案簽署知情同意書。

1.2試劑和儀器兔抗人PD-L1抗體(一抗)，Abcam公司；PV-6000聚合物免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒(酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG聚合物)，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；濃縮型DAB顯色試劑盒，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；PBS緩沖液，購自無錫傲銳東源生物科技有限公司； 檸檬酸購自無錫傲銳東源生物科技有限公司；梯度酒精；二甲苯；蘇木素；中性樹膠封固劑； 組織防脫載玻片。

1.3實(shí)驗(yàn)方法根據(jù)選好的病理組織蠟塊，由病理科老師切片及攤片，切片標(biāo)注對(duì)應(yīng)的病理號(hào)。實(shí)驗(yàn)步驟如下：(1)烤片-脫蠟-水化-抗原修復(fù)-畫圈-孵育-吐溫；(2)滴加一抗(PD-L1)：根據(jù)組織大小自行調(diào)整滴加量，4 ℃溫度下過夜孵育；(3)滴加二抗，室溫下孵育30 min，再經(jīng)PBS沖洗及DAB顯色處理；(4)復(fù)染-藍(lán)化-置于梯度濃度酒精及二甲苯中；(5)封片：滴加中性樹膠封固劑，放置于封片機(jī)。

1.4結(jié)果判讀對(duì)染色成功的切片，由2位資深病理科醫(yī)師在未知患者信息的情況下進(jìn)行獨(dú)立讀片，對(duì)于結(jié)果不一致的切片由第3位病理科醫(yī)師復(fù)核，經(jīng)討論后獲得一致結(jié)果,根據(jù)讀片結(jié)果，PD-L1在細(xì)胞膜上表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)PD-L1表達(dá)陽性的標(biāo)準(zhǔn)為PD-L1陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞>30%，陽性標(biāo)準(zhǔn)基于既往研究的陽性標(biāo)準(zhǔn)[5-6]，以便于橫向?qū)Ρ取?/p>

1.5臨床資料收集所有患者按Ann Arbor-Cotswolds分期，ECOG評(píng)分，IPI評(píng)分系統(tǒng)對(duì)患者進(jìn)一步分期的評(píng)分，診斷后經(jīng)過至少3個(gè)療程CHOP(環(huán)磷酰胺、表柔比星、長(zhǎng)春地辛及地塞米松)或RCHOP(CHOP方案聯(lián)合利妥昔單抗)方案進(jìn)行化療，80例患者的平均中位評(píng)估時(shí)間為7個(gè)療程，均在一線CHOP或R-CHOP方案化療后進(jìn)行評(píng)估，根據(jù)《2016年NCCN淋巴瘤治療指南》進(jìn)行療效評(píng)估。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)比較采用Pearson χ2檢驗(yàn)分析PD-L1表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系，不滿足χ2檢驗(yàn)條件時(shí)應(yīng)用Fisher精確概率法。應(yīng)用單因素和多因素logistic分析方法影響患者療效的因素。采用多元逐步法回歸分析(α剔除>0.1，α進(jìn)入<0.05)。

2 結(jié)果

2.1患者臨床及病理特征本研究納入了80例DLBCL患者，其中男性49例(61%)，女性31例(39%)，發(fā)病年齡16～82歲，中位年齡58歲，年齡≥60歲者有29例(36%)，患者PD-L1的表達(dá)與治療效果相關(guān)，PD-L1陽性的患者的緩解率為58%，顯著低于PD-L1陰性患者的緩解率(90%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，PD-L1陽性與non-GCB亞型相關(guān)，non-GCB亞型患者PD-L1陽性率為71%，而GCB亞型為29%(P=0.035)，PD-L1的表達(dá)與患者的年齡、分期、IPI評(píng)分、B組癥狀的有無、ECOG評(píng)分、LDH升高、>1處結(jié)外受累無相關(guān)性。結(jié)果見表1。

2.2影響患者療效的單因素分析結(jié)果顯示年齡(OR=0.353，P=0.058)，分期(OR=0.126，P=0.002)、IPI評(píng)分(OR=0.123，P=0.001)、結(jié)外受累>1(OR=0.180，P=0.006)、加用利妥昔單抗(OR=4.257，P=0.015)，PD-L1(OR=0.157，P=0.002)，DCBCL類型是影響療效的因素。

表1 PD-L1表達(dá)與患者臨床資料列聯(lián)表

2.3影響患者療效的多因素分析采用P<0.1的變量進(jìn)入多因素分析，因IPI評(píng)分包含年齡分期結(jié)外受累等因素，納入PD-L1，IPI評(píng)分，DCBCL類型及加用利妥昔單抗四個(gè)因素，最終僅PD-L1陽性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)。結(jié)果見表2。

3 討論

近年來，隨著大家對(duì)腫瘤微環(huán)境認(rèn)識(shí)的提高，腫瘤免疫療法興起，PD-L1與PD-1作為重要的免疫負(fù)調(diào)控分子，尤受到大家的廣泛關(guān)注。PD-L1/PD-1通路抑制T細(xì)胞的功能，使其喪失對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，降低IFN-γ、IL-2和IL-10的分泌，而由于CD4+T細(xì)胞的自分泌作用，此途徑對(duì)CD8+T細(xì)胞的抑制作用更加顯著[7]。腫瘤細(xì)胞通過此途徑逃逸CTL的殺傷作用，減弱集體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，進(jìn)而進(jìn)一步影響患者療效及預(yù)后。Muenst等[8]的試驗(yàn)中表明，乳腺癌患者病理組織中PD-L1的表達(dá)與年齡腫瘤大小，腫瘤分類，淋巴結(jié)狀態(tài)，ER表達(dá)缺失等密切相關(guān)，在多元分析中，PD-L1表達(dá)仍是一個(gè)獨(dú)立的不良預(yù)后因子。我們推斷阻止此通路中兩者的任一均可恢復(fù)宿主對(duì)腫瘤的免疫，目前已有試驗(yàn)表明在部分黑色素瘤，肺癌腎癌及膀胱癌患者中，阻斷此通路取得了較好的療效，能夠顯著延長(zhǎng)患者的總生存期，副作用相對(duì)化療藥物較小。如應(yīng)用PD-1抗體治療非細(xì)胞肺癌患者，約20%～25%的患者獲得客觀緩解[9]。目前針對(duì)PD-L1/PD-1，F(xiàn)AD已批準(zhǔn)數(shù)個(gè)單克隆抗體上市。確定哪些患者可以從免疫治療中獲益仍是一個(gè)重要的臨床問題。

表2影響患者療效的單因素與多因素logistic回歸分析

項(xiàng)目單因素分析OR(95%CI)值P值多因素分析OR(95%CI)值P值年齡≥60歲0.353(0.121～1.036)0.058Ann Arbor分期0.126(0.033～0.483)0.002IPI評(píng)分0.123(0.038～0.401)0.001B組癥狀0.512(0.177～1.483)0.217體能評(píng)分>1分0.240(0.076～0.759)0.015LDH升高0.597(0.205～1.740)0.344結(jié)外受累>1處0.180(0.053～0.613)0.006PD-L1陽性0.157(0.049～0.506)0.0020.171(0.049～0.602)0.006DCBCL類型5.333(1.402～20.285)0.014加用利妥昔單抗4.257 (1.763～9.654)0.015

對(duì)于淋巴瘤患者，很多學(xué)者做了類似的試驗(yàn)，由于PD-L1在腫瘤組織中的表達(dá)的異質(zhì)性，經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤及外周T細(xì)胞淋巴瘤常有PD-L1的高表達(dá)，而濾泡細(xì)胞淋巴瘤及Burkitt淋巴瘤PD-L1相對(duì)低表達(dá)。PD-L1的高表達(dá)對(duì)淋巴瘤患者臨床特征及預(yù)后的影響也有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，Paydas等[10]分析了87例HL患者石蠟病理組織中PD-L1的表達(dá)，表達(dá)陽性及陰性的患者OS及DFS差異明顯，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在韓麗娟等[11]的研究表明，NK/T細(xì)胞淋巴瘤組織中PD-L1的表達(dá)水平與臨床分期，LDH表達(dá)呈正相關(guān)，與臨床療效，IPI評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。而對(duì)于彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的患者，有一項(xiàng)研究報(bào)道[6]PD-L1陽性患者占33%(以PD-L1陽性細(xì)胞/所有細(xì)胞>30%為陽性標(biāo)準(zhǔn))，PD-L1陽性與低CR率相關(guān)，PFS和OS低于PD-L1陰性患者。另一項(xiàng)研究[5]以PD-L1陽性細(xì)胞/所有細(xì)胞>20%為陽性標(biāo)準(zhǔn)，腫瘤微環(huán)境中PD-L1陽性表達(dá)的患者占15.3%，在多元分析后PD-L1陽性仍為獨(dú)立的預(yù)后因子。本實(shí)驗(yàn)中PD-L1陽性的患者占所有患者的35.0%，結(jié)論與既往報(bào)導(dǎo)相仿。試驗(yàn)中所應(yīng)用的免疫組織化學(xué)法是檢測(cè)PD-L1在腫瘤組織中表達(dá)的主要方法，但仍有許多因素干擾，包括試驗(yàn)抗體的選取，操作步驟及讀片，均增加了試驗(yàn)的難度。這也導(dǎo)致試驗(yàn)中的數(shù)據(jù)難以做到統(tǒng)一。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腫瘤病理組織中PD-L1的陽性水平與臨床分期，IPI評(píng)分，LDH升高等臨床特征無關(guān)，與療效CR率呈負(fù)相關(guān)，表明PD-L1/PD-1通路對(duì)DLBCL患者疾病的發(fā)展及治療有重要作用。因不同病理類型淋巴瘤PD-L1的表達(dá)存在異質(zhì)性，仍需不斷完善相關(guān)研究。但不同試驗(yàn)均表明，PD-L1是部分類別淋巴瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，這可能作為部分淋巴瘤危險(xiǎn)分層指標(biāo)和潛在治療靶點(diǎn)。在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中，有試驗(yàn)表明應(yīng)用PD-1抗體治療總反應(yīng)率為近二分之一[12]。對(duì)于PD-1及PD-L1均陽性表達(dá)的病人，根據(jù)PD-1/PD-L1通路作用機(jī)制，PD-1抗體或者PD-L1抗體均可阻斷通路并促進(jìn)免疫恢復(fù)，PD-1抗體治療有效已有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，那么根據(jù)本實(shí)驗(yàn)初步推斷PD-L1抗體也可提高患者治療有效率，因此PD-L1抗體能否進(jìn)一步完善將會(huì)是我們關(guān)注的熱點(diǎn)，我們期待抗體應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，為腫瘤患者帶來更多的希望。