腫瘤浸潤性樹突狀細胞和血管內皮生長因子在非小細胞肺癌組織中的表達及意義

楊會杰，任少達，郭瑞娜， 魏民，李修順，李鴻超，李瑩

(1.濮陽市油田總醫(yī)院病理科，河南 濮陽 457001；2.聊城市人民醫(yī)院呼吸科，山東 聊城 252002)

肺癌早期可經血液、淋巴結、直接擴散等方式轉移，腫瘤細胞的快速生長和轉移是導致患者預后不良的主要危險因素[1-2]。據報道僅2012年全球范圍就有1 820 000新發(fā)的肺癌患者，其中1 590 000例死亡，肺癌患者5年生存率僅有2%～30%[3]。最常見的肺癌類型為非小細胞肺癌，與小細胞肺癌相比，其分裂和擴散較慢，但由于確診時患者往往處于中晚期，因此5年生存率非常低[4-5]。目前研究已證實肺癌細胞的快速生長和轉移與免疫抑制有關[6-7]。Li等[8]研究表明調節(jié)性T細胞與非小細胞肺癌有關，其水平升高可能與免疫的耐受有關，降低其水平或許可改善非小細胞肺癌患者預后。樹突狀細胞是機體的一種抗原呈遞細胞，其功能最大，在腫瘤患者中，主要將腫瘤細胞表面分子標志物和代謝產物等呈遞給細胞毒性T細胞等，進而殺傷腫瘤細胞[9-10]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在腫瘤細胞中的高表達同樣可以促進腫瘤的轉移。然而目前關于腫瘤浸潤性樹突狀細胞(tumor infiltrating dendritic cells，TIDC)和VEGF在非小細胞肺癌組織中的表達水平尚不清楚。本研究對非小細胞肺癌組織和健康組織中TIDC和VEGF表達水平進行檢測，探討其與非小細胞肺癌的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料自2014年1月至2016年12月，連續(xù)性收集濮陽市油田總醫(yī)院收治的非小細胞肺癌患者106例，納入標準：(1)非小細胞肺癌(均有病理確診)；(2)行手術切除可以獲得腫瘤標本；(3)年齡18～75歲；(4)同意參與本研究。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)肺癌復發(fā)；(3)小細胞肺癌；(4)術前曾接受放療、化療或分子生物治療；(5)6個月內曾接受免疫調節(jié)劑；(6)潰瘍性結腸炎等免疫系統疾??；(7)急性或慢性感染期；(8)肝腎等臟器功能不全；(9)既往心肌梗死、腦出血等重大心血管疾病。所有患者對本研究均知情同意并簽署知情同意書，本研究通過濮陽市油田總醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2研究方法入院后完善相關檢驗檢查，擇期行“肺癌切除術”，術中取腫瘤組織，檢測腫瘤組織中(據腫瘤邊緣1 cm以上的腫瘤組織)和周圍健康組織中TIDC(距腫瘤邊緣3 cm以上的正常組織)和VEGF水平。并收集患者性別、年齡、臨床TNM分期、腫瘤細胞分化程度、病理類型等臨床特征，分析TIDC和VEGF與非小細胞肺癌患者臨床特征的相關性。

1.3檢測方法

1.3.1VEGF和TIDC檢測方法 均為免疫組織化學染色，其中TIDC采用S-100兔抗人多克隆抗體標記，VEGF采用VEGF兔抗人多克隆抗體標記(試劑均購買自北京中杉生物技術有限公司)，采用SABC法檢測，具體操作步驟見說明書。結果判讀(1)TIDC：行免疫組織化學染色，400倍鏡下對TIDC細胞計數，隨機抽取5個視野，其均值作為該患者的TIDC數密度；(2)染色結果為淡黃色或棕黃色為VEGF陽性，否則為陰性。本研究中非小細胞肺癌組織中TIDC和VEGF表達圖片資料見圖1。

1.3.2TIDC細胞的MHC-Ⅱ和CD54表型測定 取檢測的組織脫蠟、水化后，使用胰蛋白酶在37 ℃下消化30 min，過濾后離心(800 r·min-1)，去除細胞碎片，沉淀細胞PBS重懸，取106個細胞，離心后去掉上清液，分別加入MHC-Ⅱ和CD54APC抗體(試劑均購買自北京中杉生物技術有限公司)，加入固定液進行流式細胞儀檢測(BD FACSAriaⅡ分選型流式細胞儀)。

1.4統計學方法采用SPSS 22.0軟件完成數據分析。兩組患者TIDC數密度等計量資料之間差異采用兩獨立樣本的t檢驗進行統計分析；兩組患者VEGF陽性率差異采用χ2檢驗進行統計分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1非小細胞肺癌患者腫瘤組織中和健康組織TIDC和VEGF表達比較與健康組織比較，腫瘤組織中TIDC數密度顯著降低[(10.58±3.18)比(18.93±3.26)，P=0.000]；VEGF陽性率顯著增高(43.45%比11.32%，P=0.000)；MHC-Ⅱ陽性DC顯著降低[(6.48±1.04)%比(12.57±2.57)%，P=0.000]；CD54陽性DC顯著降低[(7.12±1.59)比(12.81±2.81) %，P=0.000]。見表1。

2.2非小細胞肺癌患者年齡與腫瘤組織中TIDC和VEGF關系年齡≥65歲的患者與其他患者相比，TIDC數密度、VEGF陽性率、MHC-Ⅱ陽性DC和CD54陽性DC比均差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3非小細胞肺癌患者性別與腫瘤組織中TIDC和VEGF關系男性與女性患者TIDC數密度、VEGF陽性率、MHC-Ⅱ陽性DC和CD54陽性DC比均差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

2.4非小細胞肺癌患者臨床TNM分期與腫瘤組織中TIDC和VEGF關系與TNM分期為Ⅰ或Ⅱ期的患者相比，Ⅲ或Ⅳ期患者TIDC數密度顯著降低[(9.51±2.88)比(11.82±3.58)，P=0.000]；VEGF陽性率顯著增加(61.40%比20.41%，P=0.000)；MHC-Ⅱ陽性DC顯著降低[(7.83±1.05)%比(5.32±0.91) %，P=0.000]；CD54陽性DC顯著降低[(6.26±1.01)%比(8.12±1.72)%，P=0.000]。見表4。

2.5非小細胞肺癌患者腫瘤細胞分化程度與腫瘤組織中TIDC和VEGF關系與腫瘤細胞為高分化的患者相比，中低分化的患者TIDC數密度顯著降低[(9.58±2.58)比(12.37±3.13)，P=0.000]；MHC-Ⅱ陽性DC顯著降低[(6.01±1.09)%比(7.32±0.93)%，P=0.000)；CD54陽性DC顯著降低[(6.66±1.68)%比(7.94±1.58)%，P=0.000]。見表5。

表1 非小細胞肺癌患者腫瘤組織中和VEGF表達比較

表2 非小細胞肺癌患者年齡與腫瘤組織中TIDC和VEGF關系

表3 非小細胞肺癌患者性別與腫瘤組織中TIDC和VEGF關系

表4 非小細胞肺癌患者臨床TNM分期與腫瘤組織中TIDC和VEGF關系

表5 非小細胞肺癌患者腫瘤細胞分化程度與腫瘤組織中TIDC和VEGF關系

表6 非小細胞肺癌患者腫瘤病理類型與腫瘤組織中TIDC和VEGF關系

2.6非小細胞肺癌患者腫瘤病理類型與腫瘤組織中TIDC和VEGF關系腺癌與鱗癌患者TIDC數密度、VEGF陽性率、MHC-Ⅱ陽性DC和CD54陽性DC比較均差異無統計學意義(P>0.05)。見表6。

3 討論

非小細胞肺癌是肺癌的主要類型，是導致中老年患者死亡的重要原因之一[11]。肺癌的發(fā)生、發(fā)展與機體免疫相關，近些年腫瘤免疫學的發(fā)展為腫瘤的治療提供了新方向。樹突狀細胞在腫瘤患者可以作為一種抗原呈遞細胞，刺激細胞毒性T細胞等的增殖，進而對腫瘤細胞進行殺傷。而DC細胞在特定環(huán)境下可以表現為免疫抑制作用，這部分DC細胞是不成熟或分化異常的DC細胞組成，主要表現為MHC-Ⅱ和CD54陽性率低下[12-14]。然而目前關于DC細胞及其表型在非小細胞肺癌患者中的表達尚不清楚。為此我們設計了本研究，結果顯示腫瘤組織中TIDC數密度、CD54陽性和MHC-Ⅱ陽性率均顯著低于正常組織(P<0.05)，表明非小細胞肺癌患者腫瘤組織中DC細胞低表達，且以不成熟的DC細胞為主，由于DC細胞是人體最強大的抗原呈遞細胞，腫瘤環(huán)境中DC水平的降低，可導致機體對腫瘤特異性細胞毒性T細胞的增生促進作用下降，最終導致機體對腫瘤細胞的殺傷作用降低[15-16]。另外，不成熟或分化異常的DC細胞，具有免疫抑制作用，可以分泌不同的細胞因子促進T細胞免疫由Th1免疫向Th2免疫漂移，介導腫瘤細胞對機體的免疫耐受[17-18]。因此腫瘤組織中DC細胞數量降低與不成熟或異常分化，可能會導致患者預后不良，可惜目前相關研究缺乏。本研究顯示TNM分期為Ⅲ或Ⅳ期、腫瘤細胞分化程度為低分化的患者腫瘤組織中TIDC數密度、CD54陽性和MHC-Ⅱ陽性率也同樣低于其余非小細胞肺癌患者(P<0.05)。DC細胞療法可能有助于改善非小細胞肺癌患者臨床預后。Zhou等[19]研究顯示化療聯合DC細胞可以增強對非小細胞肺癌患者腫瘤細胞的殺傷作用。Liu等[20]研究則顯示鈣網織蛋白可以通過促進DC細胞的成熟和增殖，進而促進抗原特異性細胞毒性T細胞對非小細胞肺癌的殺傷作用。Zhu等[21]研究則顯示DC聯合放療可以明顯改善ⅢB期非小細胞肺癌患者的臨床治療有效率。但是目前相關研究較為缺乏，尚不能作為依據指導臨床治療，急需大樣本量的多中心隨機對照研究證實。另外，本研究顯示非小細胞肺癌患者腫瘤組織中VEGF陽性率增高，且TNM分期為Ⅲ或Ⅳ期的患者VEGF陽性率高于Ⅰ或Ⅱ期患者(P<0.05)，VEGF是腫瘤血管生成的重要促成因子，腫瘤組織中VEGF高表達可以促進腫瘤血管的生成，進而促進腫瘤細胞的生長和轉移[22-24]。

綜上所述，TIDC在腫瘤組織中低表達，且多為不成熟的調節(jié)性DC細胞，VEGF在腫瘤組織中高表達，均與患者臨床預后惡化有關。

(本文圖1見插圖9-2)