上調(diào)Klotho基因表達(dá)對(duì)心肌梗死大鼠心功能及心肌纖維化的影響

張瑞萍，劉福壘

(1.洛陽(yáng)市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 洛陽(yáng) 471002；2.泰安市中心醫(yī)院，山東 泰安 271000)

心肌重構(gòu)作為心臟在多種心血管疾病后的一種代償性病理過(guò)程，是導(dǎo)致患者心力衰竭甚至死亡的重要因素[1]，而心肌纖維化在心肌重構(gòu)中扮演重要角色[2]。因此，如何有效防治心肌纖維化已成為心內(nèi)科研究重點(diǎn)。Klotho作為一種抗衰老基因，在多種生理病理過(guò)程中扮演重要角色，Klotho表達(dá)缺失會(huì)導(dǎo)致一系列與衰老類似的功能紊亂，如骨質(zhì)疏松、動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥、免疫功能異常、皮膚衰老等[3]。Corsetti等[4]研究指出，Klotho基因及表達(dá)產(chǎn)物與心血管疾病及其各種危險(xiǎn)因素密切相關(guān)。田倪妮等[5]研究也認(rèn)為，慢性心力衰竭患者心肌組織中Klotho基因表達(dá)減少。本研究通過(guò)構(gòu)建大鼠心肌梗死模型，并轉(zhuǎn)導(dǎo)外源性腺病毒重組Klotho基因，觀察其對(duì)心肌梗死大鼠心功能及心肌纖維化的影響，以期為心肌梗死引起心肌纖維化的相關(guān)機(jī)制研究提供基礎(chǔ)資料。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(210±10)g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(豫)2010-0002。飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下，自由飲水、進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)前預(yù)適應(yīng)環(huán)境至少7 d。利用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、Klotho轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒組，每組15只。本研究起止時(shí)間為2016年12月至2017年1月，符合一般實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.1.2主要試劑和設(shè)備 慢病毒載體、pDC316-T載體和pDC316-mCMV-EGFP載體質(zhì)粒(美國(guó)Stratagene公司)，總RNA提取試劑盒(Trizol法，美國(guó)Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄、PCR試劑盒、加A尾試劑盒、EcoR Ⅰ和XhoⅠ限制酶(日本TaKaRa公司)，2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)(上海聯(lián)碩生物科技有限公司)， Klotho、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)及內(nèi)參引物序列(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，Klotho兔多克隆抗體和兔抗大鼠TGF-β 多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)，兔抗大鼠CTGF 多克隆抗體(美國(guó) SantaCruz公司)，免疫組織化學(xué)試劑盒(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)，Masson三色染色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)公司)，生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(北京東西儀科技有限公司)，小動(dòng)物呼吸機(jī)(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad公司)。

1.2方法

1.2.1Klotho基因重組腺病毒載體構(gòu)建 利用總RNA提取試劑盒(Trizol法)對(duì)大鼠新鮮腎臟組織中總RNA進(jìn)行提取，根據(jù)GeneBank中大鼠Klotho基因序列(收錄號(hào)：NM_021748.1)設(shè)計(jì)Klotho基因特異性引物：上游：5′-GGGAAGCTTGCTGCGCGGGAG-CCAGGCTCCGGGGC-3′，下游：5′-GGCCTCGAGTG-CTAATATATGCTGGCTGGAGTTGG-3′。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以Klotho基因特異性引物下游為模板逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，對(duì)Klotho基因序列進(jìn)行RT-PCR。利用加A尾試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行加A尾后，與pDC316-T載體連接，利用EcoR Ⅰ 和Xho Ⅰ 限制酶進(jìn)行雙酶切，并進(jìn)行基因測(cè)序鑒定。提取測(cè)序正確的質(zhì)粒，利用EcoR Ⅰ和XhoⅠ限制酶進(jìn)行雙酶切后，克隆至pDC316-mCMV-EGFP載體質(zhì)粒，在與慢病毒載體混合、同源重組、酶切后，制備攜帶Klotho基因的重組質(zhì)粒。攜帶Klotho基因的重組質(zhì)粒經(jīng)包裝、擴(kuò)增、純化、滴度測(cè)定均由上海閃晶分子生物科技有限公司完成。病毒半數(shù)組織細(xì)胞感染量(TCID50)法測(cè)定出病毒滴度為1.5×1010TU·mL-1。

1.2.2大鼠急性心肌梗死模型制備及處理 參考文獻(xiàn)[6]中結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支的方法制備大鼠急性心肌梗死模型：利用腹腔注射戊巴比妥鈉的方法將大鼠麻醉后，利用生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)對(duì)大鼠進(jìn)行檢測(cè)。氣管插管后連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，開胸后，利用撐胸器使胸腔中心臟充分暴露，利用8-0無(wú)創(chuàng)傷絲線合針于肺動(dòng)脈圓錐和主動(dòng)脈交界處以下約2 mm穿過(guò)左冠狀動(dòng)脈前降支，并進(jìn)行結(jié)扎，建模成功標(biāo)志：以結(jié)扎線以下心肌顏色變蒼白、波動(dòng)減縮、心電圖示ST段抬高明顯為結(jié)扎成功。假手術(shù)組僅將8-0無(wú)創(chuàng)傷絲線穿過(guò)左冠狀動(dòng)脈前降支而不結(jié)扎。10 min后，Klotho轉(zhuǎn)染組取200 μL的攜帶Klotho基因的質(zhì)粒，分別于左心室游離壁上、下、左、右四個(gè)部位進(jìn)行局部注射，模型組和空白質(zhì)粒組則分別將等量的生理鹽水和空白質(zhì)粒按照Klotho轉(zhuǎn)染組的方法進(jìn)行局部注射。常規(guī)胸腔滴注利多卡因以防止室性心動(dòng)過(guò)速、心室顫動(dòng)的發(fā)生，將胸腔積液吸盡后，斷開呼吸機(jī)，負(fù)壓逐層關(guān)胸。待大鼠蘇醒后，拔除氣管插管，同組同籠喂養(yǎng)。術(shù)后3 d連續(xù)腹腔注射青霉素以預(yù)防感染。術(shù)后存活大鼠51只，假手術(shù)組14只、模型組12只、Klotho轉(zhuǎn)染組13只和空白質(zhì)粒組12只。

1.2.3大鼠心功能檢測(cè) 各組14 d后，稱重，利用腹腔注射戊巴比妥鈉的方法將大鼠麻醉后，利用超聲心動(dòng)圖對(duì)大鼠心功能進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)包括左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVDs)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)和短軸縮短率(FS)。

1.2.4各組大鼠心肌梗死面積檢測(cè) 各組大鼠完成心功能檢測(cè)后，處死，打開胸腔，取出心臟，用生理鹽水反復(fù)沖洗，將殘留血液洗凈，去除表面結(jié)締組織，放入-80 ℃冰箱凍存15 min，取出后沿心臟縱軸方向從心底向心尖對(duì)左心室切片，厚度約2 mm，置于新配置的TTC溶液中，避光恒溫染色30 min，取出后，PBS沖洗3次，用4%多聚甲醛固定30～40 min，自然光下拍照，梗死區(qū)呈灰白色。利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)各組大鼠心肌梗死面積占全部心肌面積比例進(jìn)行分析。

1.2.5各組大鼠心肌組織病理學(xué)和纖維化檢測(cè) 取各組心尖部心肌組織，PBS洗滌后，用4%多聚甲醛過(guò)夜固定，石蠟包埋，切片，利用免疫組織化學(xué)染色試劑盒檢測(cè)心肌組織病理學(xué)變化，利用Masson三色染色試劑盒對(duì)間質(zhì)膠原纖維染色，利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)間質(zhì)纖維化面積占組織切片總面積的比值進(jìn)行分析。

1.2.6利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組大鼠心肌組織中Klotho、TGF-β1和CTGF基因表達(dá) 取各組大鼠心尖部心肌組織，研磨后加入細(xì)胞裂解液，用總RNA提取試劑盒提取組織中總RNA，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA純度，取A260/A280≥1.80作為合格樣品。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄為模板單鏈cDNA，利用PCR試劑盒進(jìn)行PCR。引物序列分別為：Klotho引物(104 bp)：上游：5′-GCTCTCAAA-GCCCACATACTG-3′，下游：5′-GCAGCATAACGATA-GAGGCC-3′；TGF-β1引物(146 bp)：上游：5′-GGATACCAACTATTGCTTCAGCTCC-3′，下游：5′-AGGCT-CCAAATATAGGGGCAGGGTC-3′；CTGF引物(232 bp)：上游：5′-GCAGCGGTGAGTCCTTCC-3′，下游：5′-AATGTGTCTTCCAGTCGGTAGG-3′；β-actin引物(205 bp)：上游： 5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游：5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min，92 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，連續(xù)進(jìn)行40次循環(huán)，每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔。用2-△△Ct法分析各組大鼠心肌組織中Klotho、TGF-β1和CTGF基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7利用Western blot法檢測(cè)各組大鼠心肌組織中Klotho、TGF-β1和CTGF蛋白表達(dá) 取各組大鼠心尖部心肌組織，研磨后加入細(xì)胞裂解液，用總蛋白提取試劑盒對(duì)組織中總蛋白進(jìn)行提取，用BCA總蛋白檢測(cè)試劑盒對(duì)獲得的總蛋白進(jìn)行檢測(cè)。取20 μg總蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，用5%脫脂奶粉室溫下封閉60 min，將一抗Klotho兔多克隆抗體、兔抗大鼠TGF-β和CTGF 多克隆抗體(稀釋比例分別為1 ∶800、1 ∶1 200和1 ∶600)加入，過(guò)夜孵育，用TBST沖洗3次，加入二抗，37 ℃條件下孵育4 h，用TBST沖洗3次，加入辣根過(guò)氧化物酶底物，暗室下反應(yīng)30 min。拍照，利用圖像分析軟件按半定量法對(duì)各組大鼠心肌組織中Klotho、TGF-β1和CTGF蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠心功能比較與假手術(shù)組相比，模型組、Klotho轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒組大鼠LVEF和FS均降低，而LVDs和LVDd均升高，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組和空白質(zhì)粒組相比，Klotho轉(zhuǎn)染組大鼠LVEF和FS均升高，而LVDs和LVDd均降低，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表1。

2.2各組大鼠心肌梗死面積比較TTC染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌梗死面積為0.00%，模型組和空白質(zhì)粒組大鼠心肌梗死面積分別為(39.09±4.66)%和(36.07±3.25)%，兩組均高于Klotho轉(zhuǎn)染組的(24.49±4.30)%，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=44.195，P<0.001)，詳見圖1。

2.3各組大鼠心肌組織病理學(xué)和纖維化比較HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)完整，可見細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，以及細(xì)胞間連接，纖維整齊排列；模型組和空白質(zhì)粒組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)不完整，纖維排列稀疏雜亂，肌纖維出現(xiàn)斷裂、間質(zhì)水腫，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；Klotho轉(zhuǎn)染組大鼠心肌病理學(xué)改變較模型組和空白質(zhì)粒組減輕，詳見圖2。

Masson染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞規(guī)整排列，散在分布有少量的藍(lán)色膠原纖維；模型組和空白質(zhì)粒組大鼠心肌細(xì)胞排列雜亂，期間可見大量的藍(lán)色膠原纖維；Klotho轉(zhuǎn)染組大鼠纖維化改變較模型組和空白質(zhì)粒組減輕，詳見圖3。假手術(shù)組間質(zhì)纖維化面積為(4.75±0.35)%，模型組和空白質(zhì)粒組間質(zhì)纖維化面積均增加，分別為(38.82±2.38)%和(38.50±2.91)%，與模型組和空白質(zhì)粒組相比，Klotho轉(zhuǎn)染組則減少，為(21.88±2.38)%，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=719.697，P<0.001)。

2.4各組大鼠心肌組織中Klotho、TGF-β1和CTGF基因表達(dá)比較與假手術(shù)組相比，模型組、空白質(zhì)粒組和Klotho轉(zhuǎn)染組大鼠心肌組織中Klotho mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低，而TGF-β1、CTGF mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組和空白質(zhì)粒組相比，Klotho轉(zhuǎn)染組大鼠心肌組織中Klotho mRNA相對(duì)表達(dá)量升高，而TGF-β1、CTGF mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表2。

2.5各組大鼠心肌組織中Klotho、TGF-β1和CTGF蛋白表達(dá)比較與假手術(shù)組相比，模型組、空白質(zhì)粒組和Klotho轉(zhuǎn)染組大鼠心肌組織中Klotho蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，而TGF-β1、CTGF蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組和空白質(zhì)粒組相比，Klotho轉(zhuǎn)染組大鼠心肌組織中Klotho蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，而TGF-β1、CTGF蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表3和圖4。

表1 各組大鼠心功能比較

注：與假手術(shù)組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與空白質(zhì)粒組相比，cP<0.05

表2 各組大鼠心肌組織中Klotho、TGF-β1和CTGF基因表達(dá)比較

注：與假手術(shù)組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與空白質(zhì)粒組相比，cP<0.05

表3 各組大鼠心肌組織中Klotho、TGF-β1和CTGF蛋白表達(dá)比較

注：與假手術(shù)組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與空白質(zhì)粒組相比，cP<0.05

圖4 Western blot檢測(cè)各組大鼠心肌組織中

3 討論

心肌梗死作為心內(nèi)科常見的危急癥，發(fā)病率居高不下，且近年來(lái)呈逐年上升趨勢(shì)，是嚴(yán)重威脅人群生命健康的重要疾病[7]。Talman和Ruskoaho[8]研究表明，心肌纖維化所致心肌重構(gòu)在心肌梗死中扮演重要角色。心肌纖維化是心肌中成纖維細(xì)胞被大量活化，細(xì)胞外基質(zhì)大量產(chǎn)生，是多因素、多基因、多步驟共同作用的結(jié)果[9]。Klotho基因作為重要的抗衰老基因，參與了多種疾病的發(fā)生過(guò)程，在心血管疾病患者血漿中呈低表達(dá)[10]，且參與了心血管疾病的相關(guān)危險(xiǎn)因素(如糖尿病、高血壓、血脂異常、腎功能異常等)的發(fā)生[11]。本研究進(jìn)一步探討了Klotho基因在心肌梗死心肌纖維化中的作用，在利用腺病毒重組傳導(dǎo)Klotho基因?qū)Υ笫笮募√幚砗?，PCR和Western blot檢測(cè)均顯示Klotho基因轉(zhuǎn)染組心肌組織中Klotho表達(dá)升高，提示轉(zhuǎn)染成功。

本研究采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支的方法制備大鼠心肌梗死模型，HE染色結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不完整，纖維排列稀疏雜亂，肌纖維出現(xiàn)斷裂、間質(zhì)水腫，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；TTC染色結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌梗死面積顯著增加，這些結(jié)果均提示成功構(gòu)建了大鼠心肌梗死模型。在轉(zhuǎn)導(dǎo)了Klotho基因后，Klotho轉(zhuǎn)染組大鼠心肌病理學(xué)改變較模型組和空白質(zhì)粒組減輕，且心肌梗死面積縮小，說(shuō)明上調(diào)Klotho基因表達(dá)可有效減輕結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支對(duì)心肌的損傷作用。心肌重構(gòu)作為心肌梗死后重要的病理學(xué)改變，一方面可通過(guò)增加左心室心肌重量及室壁厚度而維持正常的心臟容積及LVEF，同時(shí)，隨著左心室的擴(kuò)張，LVEF會(huì)隨之下降并表現(xiàn)出心力衰竭癥狀[12-13]。本研究顯示，與假手術(shù)組相比，心肌梗死大鼠均出現(xiàn)LVEF和FS降低，而LVDs和LVDd升高，提示心肌梗死導(dǎo)致的心肌重構(gòu)可影響心臟功能。在轉(zhuǎn)導(dǎo)了Klotho基因后，與模型組和空白質(zhì)粒組相比，Klotho轉(zhuǎn)染組大鼠LVEF和FS均升高，而LVDs和LVDd均降低，說(shuō)明上調(diào)Klotho基因表達(dá)可有效改善大鼠心臟功能。

心肌纖維化作為心肌梗死后心力衰竭的重要病理基礎(chǔ)，是導(dǎo)致死亡的重要因素[14]，在此過(guò)程中，膠原蛋白會(huì)大量地堆積于細(xì)胞之間及血管間隙，使心肌活動(dòng)力下降，心室壁僵硬、收縮及舒張功能受損，心功能不斷下降[15]。本研究Masson染色結(jié)果顯示，模型組和空白質(zhì)粒組大鼠心肌細(xì)胞外堆積了大量藍(lán)染的纖維，間質(zhì)纖維化面積顯著增加，這也是導(dǎo)致大鼠心功能下降的原因，但Klotho轉(zhuǎn)染組大鼠心肌組織Masson染色藍(lán)色區(qū)域顯著減少，間質(zhì)纖維化面積減少，說(shuō)明上調(diào)Klotho基因基因表達(dá)可有效減輕心肌纖維化。CTGF作為一種分泌性蛋白，在促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成、加速纖維沉淀及抑制膠原降解中發(fā)揮重要作用，在心力衰竭后心肌纖維化進(jìn)程中呈異常高表達(dá)[16]；TGF-β1是心肌纖維化過(guò)程中關(guān)鍵性調(diào)控因子，可促進(jìn)CTGF的表達(dá)，二者在加速心肌重構(gòu)及纖維化過(guò)程中發(fā)揮協(xié)同作用[17]。本研究顯示，模型組和空白質(zhì)粒組大鼠心肌組織中TGF-β1、CTGF基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，而Klotho轉(zhuǎn)染組大鼠心肌組織中TGF-β1、CTGF基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，說(shuō)明上調(diào)Klotho基因表達(dá)可能通過(guò)抑制TGF-β1、CTGF基因表達(dá)而阻斷急性心肌梗死大鼠心肌纖維化進(jìn)程。

綜上所述，利用重組腺病毒載體傳導(dǎo)Klotho基因可有效改善心肌梗死大鼠心功能，減輕心肌纖維化，其機(jī)制可能與抑制TGF-β1、CTGF基因表達(dá)有關(guān)，有望為心肌梗死臨床治療提供新的靶點(diǎn)。

(本文圖1～3見插圖9-1)