補(bǔ)骨脂-肉豆蔻藥對對脾虛泄瀉小鼠腸道功能的保護(hù)作用

汪慶飛，高家榮,2，邢亞群，孫祥瑞

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥劑科，安徽 蚌埠 233003；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031)

泄瀉，是指糞便稀薄、排便次數(shù)增加，甚至瀉出如稀水樣而言。泄為大便溏薄而緩者，瀉為大便清稀如水直下者。本病在一年四季均可發(fā)生，但以夏秋兩季多見，與臨床常見的慢性腹瀉較相似。作為臨床常見的癥狀，病因很多，如現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的慢性菌痢、腸易激綜合征、胰原性慢性腹瀉、潰瘍性結(jié)腸炎、腸結(jié)核、腸道念珠菌病、腸功能紊亂、腸道腫瘤、結(jié)腸過敏、糖尿病腹瀉、藥源性腹瀉等。在治療慢性腹瀉方面，中醫(yī)有較好的療效，特別是中藥復(fù)方制劑，靶點(diǎn)多，可總體調(diào)節(jié)機(jī)體腸道功能，臨床應(yīng)用前景廣泛?！岸裢琛背鲎运巍ぴS叔微的《普濟(jì)本事方》，以補(bǔ)骨脂和肉豆蔻組成，具有溫腎暖脾，澀腸止瀉之功效，是臨床治療脾虛泄瀉的基礎(chǔ)方。補(bǔ)骨脂性味：辛、苦、溫。歸經(jīng)：入腎、脾經(jīng)。功能：溫腎助陽、納氣止瀉。主治：腎虛，冷瀉，遺尿，滑精，小便頻數(shù)，陽痿，腰膝冷痛，虛寒喘嗽。豆蔻性味：辛、溫。歸經(jīng)：入脾、胃、大腸經(jīng)。功能：溫中下氣，澀腸止瀉。主治：虛寒氣滯，虛瀉冷痢，脘腹冷痛，嘔吐，以及腸滑不固，積食不化等癥。

本研究旨在探討補(bǔ)骨脂-肉豆蔻藥對對脾虛泄瀉腸道的保護(hù)作用，利用現(xiàn)代藥學(xué)的研究方法，即以文獻(xiàn)為基礎(chǔ)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，采用HE染色法、生化法等多種方法，從小鼠的一般狀態(tài)、胃腸激素等多方面進(jìn)一步證實(shí)補(bǔ)骨脂-肉豆蔻藥對對脾虛泄瀉的作用，以便選取更安全、有效、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)乃幬飫┝俊⑴湮?，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥物補(bǔ)骨脂：安徽普仁中藥飲片有限公司，批號：20141212；肉豆蔻：安徽普仁中藥飲片有限公司，批號：20140625；參苓白術(shù)散：山西華康藥業(yè)股份有限公司，批號：20150905；生大黃：產(chǎn)地甘肅，批號：150401；補(bǔ)骨脂-肉豆蔻藥對的制備：取補(bǔ)骨脂-肉豆蔻(2 ∶1)藥材，加60%乙醇，8倍用量，每次提取1 h，提取2次，合并藥液，濃縮，配制成1.05、0.7、0.35 g·mL-1藥液備用。本研究起止時(shí)間為2015年12月17日至2016年1月11日，符合一般實(shí)驗(yàn)動物倫理學(xué)要求。

1.2動物昆明小鼠，SPF級，安徽醫(yī)科大學(xué)(合肥)動物實(shí)驗(yàn)中心供給，準(zhǔn)字號：SCXK(皖)2011-002。室溫18～22 ℃，濕度40%～60%，自由飲水飲食。

1.3主要儀器與試劑4%多聚甲醛，批號20121113，購自北京索萊寶科技有限公司。PBS緩沖液，批號：20110807144，購自谷歌生物公司。無水乙醇，批號20110301，購自國藥控股化學(xué)試劑有限公司。RM2016病理切片機(jī)，購自上海徠卡儀器有限公司。JB-P5包埋機(jī)購自武漢俊杰電子有限公司。

1.4方法

1.4.1模型復(fù)制 昆明種小鼠，雌雄各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。將小鼠按隨機(jī)區(qū)組法隨機(jī)分正常組、模型組、補(bǔ)骨脂肉豆蔻藥對組(21.06、14.04、7.02 g·kg-1)組、參苓白術(shù)散組(2.34 g·kg-1)，每組10只。苦寒瀉下法，除正常組按規(guī)定每天用蒸餾水灌胃外，其余五組均用100%生大黃水煎劑(含原生藥1 g·mL-1)0.2 g/10 g，每日1次，連續(xù)8 d，造成脾虛泄瀉模型。觀察小鼠腹瀉或脫肛后，治療組給予補(bǔ)骨脂肉豆蔻藥對(21.06 g·kg-1)、補(bǔ)骨脂肉豆蔻藥對(14.04 g·kg-1)、補(bǔ)骨脂肉豆蔻藥對(7.02 g·kg-1)和參苓白術(shù)散(2.34 g·kg-1)灌胃，正常組和模型組給予等量溶媒，每天1次，連續(xù)給藥2周。

1.4.2一般形態(tài)學(xué)觀察 觀察各組小白鼠的一般體征，如體質(zhì)量、毛色、神志、活動頻率等情況。

1.4.3腸推進(jìn)試驗(yàn)方法 末次給藥后，每只給予30%印度墨汁0.2 mL灌胃，20 min后，處死小鼠，剖腹，取出小腸(十二指腸始端到回盲部)，平放于桌面的白紙上，記錄墨汁在腸道中前行的距離以及小腸總長度，用墨水在腸道中前行距離與小腸總長度的比值，作為小腸推進(jìn)百分率來評價(jià)。

推進(jìn)率(%)=碳素墨水在小腸內(nèi)推進(jìn)距離(cm)/小腸全長(cm)×100%。

1.4.4結(jié)腸病理組織學(xué)觀察 取相對固定部位的結(jié)腸組織，置于4%多聚甲醛液中保存固定，2 d后依次進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE 染色、再次脫水、再次透明、封片，光鏡觀察，攝片保存，最后進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)分析。

1.4.5淀粉酶含量測定 末次給藥后，眼球取血，離心制備血清，按照淀粉酶測定試劑盒說明書要求，應(yīng)用比色測定法測定血清淀粉酶含量。

1.4.6D-木糖的含量測定 由于尿液收集難度較大，常采用測定血清D-木糖。用百分濃度3% D-木糖溶液給灌胃，按說明書要求劑量灌服3% D-木糖溶液，大約60 min后眼球取血，離心制備血清，參照D-木糖試劑盒說明書，采用比色法檢測各組血清D-木糖含量。

2 結(jié)果

2.1一般情況造模前，各組的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；造模7 d后模型組相繼出現(xiàn)飲水、食欲下降，便溏，毛色不整，體質(zhì)量減輕，倦怠，嗜臥等癥狀。給藥前，與正常組相比，其余各組體質(zhì)量明顯減小(P<0.01)；給藥2周后，與模型組相比，補(bǔ)骨脂-肉豆蔻藥對(21.06 、14.04 g·kg-1)體質(zhì)量增加差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2補(bǔ)骨脂-肉豆蔻藥對對脾虛泄瀉模型腸推進(jìn)率影響與正常組相比，模型組墨汁推進(jìn)率顯著增高(P<0.01)，提示脾虛泄瀉結(jié)腸運(yùn)動增強(qiáng)；與模型組相比，給藥2周后，補(bǔ)骨脂-肉豆蔻藥對(21.06 g·kg-1)能明顯降低墨汁推進(jìn)率(P<0.05)，提示其能降低脾虛泄瀉的結(jié)腸運(yùn)動，參苓白術(shù)散組有類似的療效，見表2。

表1 補(bǔ)骨脂-肉豆蔻藥對對小鼠體質(zhì)量的影響

注：與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

2.3結(jié)腸病理組織學(xué)觀察HE染色結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組出現(xiàn)結(jié)腸膜萎縮變薄，腺體細(xì)胞增生，層次增多排列紊亂，并伴有大量炎細(xì)胞潤。與模型組相比，補(bǔ)骨脂-肉豆蔻藥對則明顯減輕了上述癥狀，炎細(xì)胞浸潤減少，腺體排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)清楚；提示補(bǔ)骨脂-肉豆蔻藥對對腸黏膜修復(fù)及炎性病理改善有一定的效果(見圖1)。

2.4酶活性檢測(生化法)D-木糖、淀粉酶的含量與正常組相比，模型組血清中D-木糖和淀粉酶的含量顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，給藥2周后，補(bǔ)骨脂-肉豆蔻藥對組(14.04 g·kg-1、21.06 g·kg-1)能不同程度的升高血清中D-木糖和淀粉酶的含量(P<0.05 或P<0.01)，結(jié)果見表3。

3 討論

泄瀉是醫(yī)院門診常見的一種疾病，泄是指便稀薄，間斷發(fā)作，來勢緩者；瀉指大便直下，如水傾注，來勢急者。二者統(tǒng)稱為泄瀉。最早《黃帝內(nèi)經(jīng)》[1]稱為泄，有“洞泄”“濡泄”之說。漢唐以后稱為“下利”，直到宋代才稱為“泄瀉”。泄瀉的病因較為復(fù)雜，如寒瀉、熱瀉、虛瀉、濕瀉、食瀉等。其中虛瀉又包括脾虛瀉、腎虛瀉。而脾虛泄瀉是由于脾虛濕盛，困厄脾胃，致運(yùn)化異常，又稱濡泄。臨床常見癥狀[2]大便稀薄，時(shí)停時(shí)瀉，完谷不化，略進(jìn)油膩食物，則便次增多，腹脹不適，飲食減少，面黃，體無力，舌淡苔白，脈弱。雖然該證一般認(rèn)為是大便溏薄，但有時(shí)臨床常見癥狀是大便先溏后干，或者是先干后溏，或者是干溏結(jié)合，不可認(rèn)為都是溏浠狀[3]。該證為脾不健運(yùn)時(shí)稱之為脾陽虛。脾的功能調(diào)節(jié)需脾陽和脾陰共同完成，缺一不可。脾主運(yùn)化，多指脾陽的作用，但須有脾陰的協(xié)同，二者相輔相成，缺一不可。同時(shí)，脾胃互為表里，脾升清與胃降濁的平衡調(diào)節(jié)是維持臟腑氣機(jī)暢通，水谷精微正常吸收、分布、代謝的前提條件。脾虛氣陷，清陽當(dāng)升不升，濕濁不化，則清濁雜混而下，遂成泄瀉之癥狀。由此可知脾虛濕盛是導(dǎo)致該證的首要病因[4]。自20世紀(jì)80年代以來，有關(guān)脾虛泄瀉證實(shí)質(zhì)研究主要從脾主運(yùn)化展開。普遍研究認(rèn)為，脾虛泄瀉主要臨床表現(xiàn)為淀粉酶活性降低，D-木糖排泄率下降，胃腸功能紊亂，胃腸道激素異常等[5]。楊維益等[6]發(fā)現(xiàn)血清中的淀粉酶及胰脂肪酶活性也有不同程度的降低。脾虛還表現(xiàn)為免疫功能降低，副交感神經(jīng)功能亢進(jìn)，腸道二群感染等[7]。許多傳統(tǒng)中草藥在治療脾虛泄瀉證中發(fā)揮著極其重要的作用，如中藥復(fù)方制劑“益糖康”可以減少脾虛泄瀉小鼠血清炎癥因子的表達(dá)、“四君子湯”能夠減輕大鼠的脾虛泄瀉癥狀以及中藥“神曲”有調(diào)整脾虛泄瀉小鼠腸道菌群及保護(hù)腸黏膜的作用等。

表2 給藥治療2周后對腸推進(jìn)試驗(yàn)的影響

注：與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05

表3 補(bǔ)骨脂-肉豆蔻藥對對脾虛泄瀉血清中D-木糖和淀粉酶含量的影響

注：與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01，cP<0.05

“二神丸”出自宋·許叔微的《普濟(jì)本事方》[8]，由補(bǔ)骨脂和肉豆蔻組成。補(bǔ)骨脂為豆科植物，性味辛、溫、微苦，歸腎脾經(jīng)，具有溫腎助陽、納氣止瀉之療效。歷代中醫(yī)常用于治腎虛，冷瀉、瘡瘍、遺尿、滑精、陽痿、水腫、尿頻，脾胃虛弱，腰膝酸痛，虛寒喘嗽。補(bǔ)骨脂中含有很多活性組分[9-11]，主要有香豆素，如補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素)，擬雌內(nèi)酯類(如補(bǔ)骨脂定)，黃酮類，酚萜類(如補(bǔ)骨脂酚)化合物等。臨床應(yīng)用：用于盜汗、冷痢，如慢性結(jié)腸炎、腸結(jié)核等;用于健胃，對有脾胃虛寒、鼓腸、腹脹、腸鳴腹痛者較為適宜。近些年來，大量的藥理學(xué)研究還發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂還具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗抑郁、治療骨質(zhì)疏松、治療白癜風(fēng)、治療銀屑病、治療血管性癡呆、性激素樣作用、增強(qiáng)免疫功能等多重作用。

肉豆蔻是肉豆蔻科肉豆蔻屬植物肉豆蔻的干燥成熟種仁[12-14]。肉豆蔻性味：辛、溫。歸經(jīng)：入脾、胃、大腸經(jīng)。功能：溫中下氣，澀腸止瀉[15]，主治：長尾虛寒氣滯，虛瀉冷痢，脘腹冷痛，嘔吐，以及腸滑不固，積食不化等癥。臨床應(yīng)用：用于盜汗、冷痢，如慢性結(jié)腸炎、腸結(jié)核等;用于健胃，對有脾胃虛寒、食欲不振、腹痛、腹脹、腸鳴音亢進(jìn)者較適宜。補(bǔ)骨脂-肉豆蔻醇提物是治療脾虛泄瀉的傳統(tǒng)古方， 但是文獻(xiàn)資料研究多為對該方組成藥物補(bǔ)骨脂、肉豆蔻的單味藥物研究，對于復(fù)方的研究很少，且極少數(shù)研究其組方劑量對藥效的產(chǎn)生的影響，并且復(fù)方對于治療脾虛的作用研究及其機(jī)制也尚不明確。因此本研究重點(diǎn)探討了“補(bǔ)骨脂-肉豆蔻醇提物”復(fù)方在大黃誘導(dǎo)小鼠脾虛泄瀉模型中發(fā)揮的作用及其潛在的機(jī)制。

本研究表明補(bǔ)骨脂-肉豆蔻醇提物有如下功能：補(bǔ)骨脂-肉豆蔻醇提物有明顯的止瀉作用，并且能明顯提高脾虛泄瀉小鼠體重、降低小鼠腸推進(jìn)率、對腹瀉小鼠的腸黏膜修復(fù)及炎性病理改善有一定的效果。

綜上所述，從胃腸功能角度來研究補(bǔ)骨脂-肉豆蔻醇提物對脾虛泄瀉小鼠的作用機(jī)理得到證實(shí)，提示補(bǔ)骨脂-肉豆蔻醇提物有保護(hù)腸黏膜的作用，且通過對其機(jī)制的研究，為今后治療脾虛泄瀉提供了潛在的靶點(diǎn)。

(本文圖1見插圖9-1)