純鎂超聲微弧氧化—硅烷—黃芪甲苷復(fù)合處理層的細(xì)胞相容性

孫勝磊 李德超 李慕勤 戴驍焱 張慧明 彭書浩

摘 要：目的 為了調(diào)節(jié)純鎂的降解性與提高生物活性，對其表層采取超聲微弧氧化（UMAO）、硅烷化、載黃芪甲苷復(fù)合處理方法，分析各種處理方法對成骨細(xì)胞生物相容性的影響大小。方法 以純鎂微弧氧化UMAO為對照組（A組），純鎂微弧氧化UMAO-硅烷（B組），純鎂微弧氧化UMAO-硅烷-100 μg/ml黃芪甲苷（C組）為實(shí)驗(yàn)組，通過Cell Counting Kit（CCK-8）試劑盒、掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡等方式檢測不同處理膜層細(xì)胞相容性。結(jié)果 CCK-8粘附與增殖實(shí)驗(yàn)測定的吸光率C組超過B組，B組超過A組，膜層表層細(xì)胞粘附及增殖隨著時(shí)間的推移呈現(xiàn)出不斷增加的趨勢，其中純鎂微弧氧化UMAO-硅烷-100 μg/ml黃芪甲苷復(fù)合膜層具有最優(yōu)的成骨細(xì)胞活性，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 純鎂微弧氧化UMAO-硅烷-100 μg/ml黃芪甲苷復(fù)合處理后膜層的細(xì)胞相容性最好，純鎂微弧氧化UMAO-硅烷處理次之，純鎂UMAO組最低。

關(guān)鍵詞：純鎂；超聲微弧氧化；硅烷；黃芪甲苷；細(xì)胞相容性

中圖分類號：R318.08 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.09.024

文章編號：1006-1959（2018）09-0079-05

Abstract：Objective To regulate the biodegradability of pure magnesium and to improve its bioactivity， ultrasound microarc oxidation （UMAO），silanization and astragaloside loading were used to treat the surface layer of magnesium，and the effects of various treatments on the biocompatibility of osteoblasts were analyzed.Methods Microarc oxidation of pure magnesium（UMAO）was used as control group（group A），magnesium microarc oxidation of UMAO- silane（group B），pure magnesium microarc oxidation UMAO- silane -100μg/ml astragaloside（group C）was the experimental group.The compatibility of different treatment membrane cells was detected by Cell Counting Kit（CCK-8）kit，scanning electron microscope and laser confocal microscope.Results The absorbance measured by CCK-8 adhesion and proliferation assays in group C surpassed group B，and group B surpassed that in group A.The adhesion and proliferation of surface layer cells in the membrane layer are increasing with time，in which pure magnesium microarc oxidation UMAO-silane-100μg/ml astragaloside composite membrane has the best osteoblast activity，and has statistical significance（P>0.05）.Conclusion After the pure magnesium microarc oxidation UMAO-silane-100μg/ml astragaloside composite treatment，the cytocompatibility of the membrane was the best，the pure magnesium micro arc oxidation UMAO-silane treatment was the second，the pure magnesium UMAO group was the lowest.

Key words：Pure magnesium；Ultrasonic microarc oxidation；Silane；Astragaloside；Cytocompatibility

純鎂可作為一種良好的可以降解的醫(yī)用植入金屬材料，純鎂有著的降解性與良好的力學(xué)特征，具有十分關(guān)鍵的優(yōu)勢地位。近些年來，醫(yī)用植入材料很大程度的采用了純鎂作為植入材料的第一選擇[1-3]。在體內(nèi)的生理環(huán)境中純鎂易發(fā)生降解，這種自動(dòng)降解的優(yōu)異性能滿足了不需要二次手術(shù)將其取出，且純鎂在人體內(nèi)的降解產(chǎn)物也沒有毒副作用[4]。鎂及其合金力學(xué)相容性而言也是非常優(yōu)異的，能作為一些支撐的骨骼材料，或者骨釘應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)中去，為有需要的患者提供支撐；純鎂也具有非常良好的生物相容性，這使得在以純鎂作為植入材料植入到生物體內(nèi)后，生物體并不會發(fā)生特別強(qiáng)烈的排異反應(yīng)[5]。但純鎂在體內(nèi)降解速率高于骨生長速率，如何降低降解速率，使之達(dá)到與骨生長匹配成為研究關(guān)鍵問題。微弧氧化處理，是一種通過高壓利用等離子放電的陽極氧化的方法[6]。純鎂表面通過微弧氧化（MAO）技術(shù)可在純鎂表面形成嚴(yán)密多孔隙的薄氧化鎂陶瓷層，提高純鎂表面的耐腐蝕性[7-9]。但微弧氧化表面多孔有的呈貫穿性，使體液直接浸入，發(fā)生點(diǎn)蝕。對硅烷采取金屬預(yù)處理是近些年以來主流的表面處理方法[10]。硅烷預(yù)處理的機(jī)理其實(shí)是硅烷分子水解后生成的硅羥基與金屬氧化物反應(yīng)形成無機(jī)膜，使金屬表面形成一種具有疏水性的膜。這種有機(jī)膜層能夠保護(hù)金屬基體與外界隔離，因其有機(jī)膜層的成分特點(diǎn)能夠很好的與生物基體結(jié)合[11]。據(jù)臨床和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷具有抗炎、促進(jìn)骨細(xì)胞生長、降低血糖和改善心腦血管疾病等杰出的生物活性 [12]。另據(jù)實(shí)驗(yàn)研究顯示，適宜濃度的黃芪甲苷可顯著促進(jìn)人體內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖[13]。對成骨細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察黃芪甲苷對成骨細(xì)胞增殖和分化的作用，濃度適宜的黃芪甲苷溶液對成骨細(xì)胞有促進(jìn)增殖與促進(jìn)分化的作用，具有促進(jìn)其骨形成作用[14]。

利用純鎂的可降解性和良好的力學(xué)特性等優(yōu)異特點(diǎn)，以控制鎂的降解速率為重點(diǎn)，對純鎂進(jìn)行微弧氧化處理，并提出硅烷中添加黃芪甲苷設(shè)計(jì)的思路。含有黃芪甲苷硅烷水解液可浸漬微弧氧化孔隙實(shí)現(xiàn)減少貫穿孔隙的作用，進(jìn)而控制鎂降解速率，而黃芪甲苷具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化的作用，使純鎂表面形成生物性膜層。本文通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)黃芪甲苷的最佳濃度，采取對比分析方法，探討純鎂微弧氧化膜層、純鎂微弧氧化-硅烷膜層、純鎂微弧氧化-硅烷-載100 μg/ml黃芪甲苷膜層細(xì)胞膜層對成骨細(xì)胞增殖、分化及活性的影響，為純鎂及其合金在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的臨床應(yīng)用提供充分而有說服力的依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1.1菌株和試劑 MC3T3-E1細(xì)胞株（中科院上海細(xì)胞庫），純鎂（其中純度超過99.9%，直徑10 mm，厚1 mm），赫斯特Hoechest熒光染料（北京索萊寶），CCK8試劑盒（日本同仁），鬼筆環(huán)肽（上海祤圣生物公司），抗熒光淬滅液（Beyotime）。PBS離子緩沖液，10%胎牛血清（NQBB），胰蛋白酶（HyClone），青霉素-鏈霉素溶液（雙抗），α-MEM培養(yǎng)基，硅烷，黃芪提取物黃芪甲苷。

1.1.2儀器 Air Tech凈化工作臺，激光共聚焦顯微鏡（Olympus公司），Hepa Class 100型CO2培養(yǎng)箱，（E）型4 ℃冰箱，YXQSG41.280型手提式壓力蒸汽滅菌鍋，-80 ℃冰箱，酶聯(lián)免疫檢測儀，AL204電子天平，SZ-100自動(dòng)三重純水蒸餾水（上海亞榮生化儀器廠），培養(yǎng)箱（美國Sheldom公司），掃描電子顯微鏡（JSM-6360LV），超聲微弧氧化（UMAO）實(shí)驗(yàn)儀器（哈爾濱工業(yè)大學(xué)先進(jìn)涂層技術(shù)實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)），KQ-50型醫(yī)用數(shù)控超聲儀（昆山超聲波儀器有限司）。

1.2試件制備及分組

1.2.1鎂片表面涂層制備 試件均采用厚度1 mm，直徑10 mm的純鎂材料，500目、800目、1000目、1500目砂紙打磨，蒸餾水清洗晾干。將微弧氧化設(shè)備的參數(shù)設(shè)定為頻率為500 Hz，脈沖寬度為50 μs，電壓恒定為300 V，將純鎂試樣作為正極，不銹鋼電解槽為負(fù)極，將硅酸鹽電解液放入超聲波儀器中微弧氧化10 min，蒸餾水清洗晾干。

配制硅烷水解溶液，硅烷偶聯(lián)劑KH-550∶H2O∶乙醇=1∶10∶1，將微弧氧化后試樣進(jìn)行硅烷封孔處理。在配制的硅烷水解液中添加100 μg/ml黃芪甲苷，配制成含黃芪甲苷硅烷水解溶液。將微弧氧化后鎂試件分別懸吊于硅烷水解液和含甲苷硅烷水解溶液中，每隔30 s進(jìn)行提拉一次并拋干，將上述操作重復(fù)3次后，將試件拿出快速甩干，制出復(fù)合膜層。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)總共分成三個(gè)小組，純鎂微弧氧化是屬于A組，即所謂的對照組；微弧氧化后載硅烷為B組；微弧氧化硅烷處理后載100 μg/ml黃芪甲苷為C組。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 為了確定黃芪甲苷的最佳加入濃度，設(shè)置對照組（0 μg/ml）、0.1 μg/ml、1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml、1000 μg/ml黃芪甲苷培養(yǎng)液六組實(shí)驗(yàn)組，對照組為0 μg/ml的黃芪甲苷培養(yǎng)液，每組三個(gè)復(fù)孔。取3個(gè)96孔板分別用于3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，常規(guī)培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞至對數(shù)期，制備細(xì)胞懸液質(zhì)濃度為1×104 cells/ml，接種于各組孔板中，將三個(gè)96孔板放入培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h后，吸出原培養(yǎng)液，對照組加入200 μl培養(yǎng)液，其余各組分別加入200 μl的0.1 μg/ml、1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml、1000 μg/ml黃芪甲苷培養(yǎng)液，再放入培養(yǎng)箱中分別培育24 h、48 h、72 h之后暫停培育，使用PBS反復(fù)清洗3次后，每孔加入100 μl無血清培養(yǎng)基和10 μl CCK-8溶液，其中培養(yǎng)4 h，在酶標(biāo)儀波長為450 nm時(shí)測量A值。

1.3.2掃描電鏡下觀察純鎂表面和進(jìn)行能譜分析 試件制造完成后，得到本實(shí)驗(yàn)的分組，A組、B組、C組，在試件表面進(jìn)行噴金處理后，在掃描電鏡下觀察試件表面的微形態(tài)，并對其表面進(jìn)行元素分析。

1.3.3激光共聚焦下觀察細(xì)胞形態(tài)實(shí)驗(yàn) 將A、B、C三組樣本分別放到24孔板內(nèi)，細(xì)胞接種濃度為5×104 cells/ml濃度接種到三個(gè)小組材料表層，恒溫培養(yǎng)箱主要培育12 h、24 h，0.5 ml/孔，4%的多聚甲醛37 ℃固定10 min，PBS洗2次，1 ml/次，0.5 ℃ Triton-X100 1 ml加入24孔中37 ℃，PBS 1 ml清洗2次，棄上清液，加200 μl鬼筆環(huán)肽，1 ml/次，PBS洗3次，加Hoechst 0.5 ml，常溫下放置5 min，吸棄Hoechst加入PBS后，取出載玻片將試件放置其上，在試件表面加入抗熒光淬滅試劑，然后轉(zhuǎn)移至顯微鏡觀測細(xì)胞狀態(tài)。

1.3.4 CCK-8細(xì)胞增殖活性檢測 使用CCK-8方式觀察成骨細(xì)胞增殖狀況，細(xì)胞接種的方式也是一樣的，各組樣本中分別取12塊放進(jìn)24孔板中對細(xì)胞加以孵育。往往在孵育1 d、3 d、5 d之后拿出每組樣本，不同時(shí)間點(diǎn)設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，用PBS進(jìn)行緩慢沖洗，且將其放到全新的24孔板內(nèi)，根據(jù)一定比例添加培養(yǎng)液與CCK-8試劑，然后放進(jìn)培養(yǎng)箱中孵育2 h之后拿出，然后吸取上清液加入96孔板里，用酶標(biāo)儀觀察在450 nm波長下方的OD值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS20.0對整體數(shù)據(jù)加以研究，往往使用二次測量的方差分析方式，各組使用LSD的兩兩對比。數(shù)據(jù)以（x±s）表示，檢驗(yàn)水平α=0.05。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果 為了確定黃芪的提取物黃芪甲苷的合適加入量，采用CCK-8實(shí)驗(yàn)觀察MC3T3-E1成骨細(xì)胞在不同濃度黃芪甲苷處理的24 h、48 h、72 h后細(xì)胞毒性，見表1。對照組為不含黃芪甲苷的培養(yǎng)液，低濃度（0.1 μg/ml）組與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml組和對照組進(jìn)行對比，在不同的時(shí)間差別有著統(tǒng)計(jì)學(xué)作用。所以，黃芪甲苷加入1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml組都能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的不斷增殖，但最高濃度（1000 μg/ml）組對成骨細(xì)胞增殖有一定的約束效果。根據(jù)數(shù)據(jù)分析得出，100 μg/ml組對MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖效果是最高的，因此選取100 μg/ml組作為體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的加入量。

2.2 SEM觀察試件表面形貌并進(jìn)行元素分析 純鎂表層各種處理膜層SEM外形狀態(tài)見圖1。純鎂UMAO組表面有很多細(xì)微的小孔。然而純鎂UMAO膜層利用硅烷處理之后，B組與C組材料表層的微小孔隙明顯減少，大多數(shù)孔隙均被均勻覆蓋且試件表面比較平整。C組經(jīng)黃芪甲苷處理之后并沒有影響封孔的效果，還可以見到有白色顆粒狀的黃芪甲苷粘附在表面。這表明通過不同的處理，達(dá)到了對膜層表面的封孔作用。

2.3 MC3t3-E1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 表2為細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)數(shù)值，在三個(gè)不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)上，A、B、C組對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。不同小組在各時(shí)間節(jié)點(diǎn)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在C組樣本表面細(xì)胞孵育1 d、3 d、5 d之后的吸光度值達(dá)到0.719、0.831、0.954，皆顯著大于B、C兩組，證明C組細(xì)胞增殖情況最佳。

2.4細(xì)胞形態(tài)觀察 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，通過鬼筆環(huán)肽熒光染色觀察，各組細(xì)胞鋪展較好，但數(shù)目差異較大，A組細(xì)胞的鋪展跟數(shù)量不如B組和C組，B組與C組的細(xì)胞間沒有密切的關(guān)系，C組的細(xì)胞狀態(tài)更為明顯，C組細(xì)胞為伸展充分，細(xì)胞之間關(guān)聯(lián)緊密，相互聯(lián)通，微絲骨架清晰可見，見圖2。

3討論

Correa提出，堿性清洗劑可以盡量保留鎂合金外部較多的堿性羥基，這是為了和酸性硅烷羥基進(jìn)行有效反應(yīng)，讓Si-O-Mg融合力更加強(qiáng)大[15，16]。因此，在實(shí)驗(yàn)過程中堿處理是非常關(guān)鍵的步驟，硅烷則起到一種“粘接劑”的作用，作為連接微弧氧化后的試件和黃芪甲苷的橋梁，將兩種差異懸殊的材料連接起來，形成一種特殊的生物涂層[17，18]。目前對植入材料進(jìn)行生物改性主要通過對其表面進(jìn)行處理或者是將一些有生物活性的高分子材料通過某種方式固定于植入材料表面，同時(shí)在這種高分子材料固定于植入材料之后，可以保證植入界面的穩(wěn)定性，因而這種材料必須有明確的目標(biāo)性和指向性，可以起到與細(xì)胞、組織的中介作用[19]。微弧氧化技術(shù)有助于純鎂及其合金植入材料生物性能的提高，使純鎂及其合金的生物穩(wěn)定性大大提高[20，21]。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，純鎂表面微弧氧化后形成了多孔的生物膜層。以添加黃芪甲苷硅烷為中間層，在微弧氧化的純鎂表面，形成純鎂UMAO-硅烷-黃芪甲苷的復(fù)合生物膜層。

在今后的新型種植材料的研發(fā)與進(jìn)展中，要充分考慮到種植材料在骨結(jié)合的過程中能否與骨組織的成骨細(xì)胞形成良好的生物相容性[22]。通過細(xì)胞骨架觀察，黃芪甲苷涂層的表面展現(xiàn)出了比其他兩組更好的生存能力。通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，證明了載有黃芪甲苷涂層的生物涂層有著十分優(yōu)良的細(xì)胞相容性。

本次實(shí)驗(yàn)第一次將純鎂微弧氧化、硅烷、黃芪甲苷三種處理相融合，不但加強(qiáng)了純鎂的生物相容性，而且將黃芪甲苷促進(jìn)細(xì)胞增殖粘附的巨大優(yōu)勢體現(xiàn)出來，為今后純鎂在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)這些數(shù)據(jù)對種植義齒的理論總結(jié)、實(shí)際應(yīng)用等各方面均具有參考價(jià)值。

4結(jié)論

純鎂經(jīng)超聲微弧氧化-硅烷-黃芪提取物黃芪甲苷復(fù)合處理后具有良好的細(xì)胞相容性，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)了良好的生物相容性和生物活性，且優(yōu)于純鎂UMAO和純鎂UMAO-硅烷組，純鎂UMAO-硅烷-黃芪甲苷生物膜層利于成骨細(xì)胞的增殖。

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收稿日期：2018-2-22；修回日期：2018-3-23

編輯/楊倩