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    響應(yīng)面優(yōu)化谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶改性大豆與啤酒糟混合蛋白工藝

    2018-08-31 02:32:44宗緒巖彭翠珍
    食品科學(xué) 2018年16期
    關(guān)鍵詞:水浴啤酒凝膠

    宗緒巖,李 建,彭翠珍,李 麗,*

    啤酒糟又稱為麥糟、麥芽糟,是啤酒釀造麥芽糖化的副產(chǎn)物,占啤酒工業(yè)總副產(chǎn)物的85%[1]。啤酒糟中含有麥芽的外殼和殘留的胚乳,富含纖維素、阿拉伯木聚糖、木質(zhì)素和蛋白質(zhì),是一種低成本食品廢棄物,是良好的膳食纖維源和植物性蛋白質(zhì)源[2],因此除了用于飼料生產(chǎn)[3]、食用菌培植[4]外,也被用于研發(fā)生產(chǎn)水解多肽、復(fù)合氨基酸[5]等蛋白制品及面包[6]、餅干等休閑食品。由于啤酒糟中蛋白質(zhì)在麥芽汁制備過程中經(jīng)過了高溫滅酶處理,蛋白質(zhì)發(fā)生變性,特性也已經(jīng)改變,限制了啤酒糟蛋白的利用。

    目前,對植物蛋白的改性方法主要有化學(xué)改性[7]、物理改性[8]、酶法改性[9]等。酶法改性的方式有多種,通常包括催化蛋白質(zhì)發(fā)生水解作用[10]、共價交聯(lián)作用、糖基化[11]以及磷酸化[12]等,從而改善蛋白質(zhì)的溶解度及乳化性等功能特性。由于可控性強、條件溫和、耗能少、專一性強及副產(chǎn)物少,易于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn),酶法改性成為近年來研究的熱點[13]。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminase,TGase)通過催化蛋白質(zhì)或多肽中谷氨酰胺殘基的γ-羥胺基團與Lys上的ε-氨基之間形成共價鍵,增大蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量,從而改善蛋白質(zhì)的凝膠性、黏彈性、保水性等。胡小中等[14]研究表明對大豆分離蛋白改性時,TGase的使用使大豆蛋白的凝膠性及熱穩(wěn)定性能得到顯著改善。朱小燕等[15]研究發(fā)現(xiàn)通過TGase改性的米渣蛋白持油性、體外消化率及流變性得到提升。由于啤酒糟中蛋白質(zhì)主要來源于大麥[16],含有大量的谷氨酰胺,而大豆蛋白富含Lys,Lys和谷氨酰胺作為TGase的作用底物,若將啤酒糟蛋白和大豆蛋白混合進行TGase改性,不僅有助于改善蛋白的凝膠性能,平衡其人體必需氨基酸的組成,提高蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值,拓寬啤酒糟蛋白的利用價值和使用范圍。

    本實驗采用濕磨法提取、富集啤酒糟蛋白,分析了其氨基酸組成,從而確立了TGase改性啤酒糟蛋白與大豆分離蛋白混合的實驗思路,并采用響應(yīng)面分析法對改性加工條件進行優(yōu)化,提高TGase生物改性效果,從而獲得凝膠性能良好的蛋白產(chǎn)品,研究結(jié)果為拓寬啤酒糟蛋白的應(yīng)用范圍及其精深加工提供實驗參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    啤酒糟 華潤雪花啤酒(內(nèi)江)有限責(zé)任公司;大豆分離蛋白(蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)>90%) 益海嘉里(秦皇島)蛋白工業(yè)有限公司;TGase(酶活力100 U/g)泰興市東圣食品有限公司;其他試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    多功能膠體磨 溫州昊星機械設(shè)備制造有限公司;粗(細)篩子、高效落地高速離心機 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;H-spray Mini小型噴霧干燥儀北京霍爾斯生物科技有限責(zé)任公司;L-8800全自動氨基酸分析儀 日本Hitachi公司;TA.XT Plus物性測定儀 英國Stable Mciro System公司;Kjeltec 2200凱氏定氮儀 瑞典FOSS公司。

    1.3 方法

    1.3.1 啤酒糟蛋白的制備工藝流程[17]

    啤酒糟→濕法粉碎→篩分→濾漿→離心→去上清液→復(fù)溶沉淀→噴霧干燥→保存?zhèn)溆?/p>

    噴霧干燥條件:進風(fēng)溫度165 ℃,進風(fēng)量700 L/h,物料質(zhì)量分數(shù)12%,進料流量0.4 L/h。

    1.3.2 凱氏定氮法測定啤酒糟蛋白含量[18]

    稱取1 g(精確至0.001 g)啤酒糟蛋白樣品于消化管中,加入12 mL濃硫酸及7.8 g混合催化劑(硫酸鉀-硫酸銅質(zhì)量比7∶0.8),放入消化爐中,220 ℃消化0.5 h,420 ℃消化1.5 h后取出冷卻至室溫,上機測定蛋白含量。取蛋白質(zhì)換算系數(shù)為6.25。

    1.3.3 啤酒糟蛋白氨基酸組成測定

    取3 mL樣品溶液(質(zhì)量濃度1 mg/mL)于安瓿瓶中,加入6 mol/L鹽酸溶液10 mL,滴入幾滴苯酚,充入氮氣1 min以排出其中的空氣,酒精噴燈,熔化封瓶。將密封樣品在110 ℃條件下徹底水解22 h后,冷藏保存。取出冷卻至室溫。敲瓶,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶,過濾后取200 μL,與真空干燥箱中減壓干燥。加入1 mL的pH 2.2檸檬酸鈉上機緩沖溶液稀釋,振蕩,取20 μL上樣。用全自動高速氨基酸分析儀進行分析,采用柱后茚三酮法測定樣品中的各種氨基酸含量。

    分析條件:柱溫57 ℃;色譜柱日立#26225C型;流動相流速1 mL/min;反應(yīng)柱溫135 ℃。

    1.3.4 TGase改性混合蛋白工藝

    參考文獻[19],并稍作修改。恒定溶液蛋白質(zhì)量分數(shù)為15%,配制不同添加量的啤酒糟蛋白與大豆蛋白混合溶液,在室溫條件下攪拌均勻,用1 mol/L的NaOH(或HCl)溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值為所需值,添加TGase,在所需溫度水浴反應(yīng)一段時間后,于90 ℃水浴加熱40 min,將制得的樣品放入冰水浴中迅速冷卻,并置于4 ℃冰箱中過夜,用于凝膠強度的測定。

    1.3.5 凝膠強度測定

    采用質(zhì)構(gòu)儀穿刺實驗法[20]。穿刺實驗操作條件:P 0.5探頭,測試前速率5.0 mm/s,測試速率2.0 mm/s,測試后速率10.0 mm/s,出發(fā)力10 g,下壓凝膠5 mm所需力為凝膠強度[21]。

    1.3.6 單因素試驗

    以混合蛋白凝膠強度為指標,分別考察啤酒糟蛋白添加量(10%、20%、30%、40%、50%)、加酶量(5、10、15、20、25 U/g)、水浴溫度(20、30、40、50、60 ℃)、水浴時間(60、90、120、150、180 min)、初始pH值(5、6、7、8、9)對混合蛋白凝膠性質(zhì)的影響。單因素試驗基本條件為啤酒糟蛋白添加量30%、加酶量15 U/g、水浴溫度50 ℃、反應(yīng)時間2 h、反應(yīng)pH 7.0。

    1.3.7 響應(yīng)面試驗

    在單因素試驗的基礎(chǔ)上,利用Design-Expert 8.0軟件進行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計,以混合蛋白凝膠強度為響應(yīng)值,以啤酒糟蛋白添加量、水浴溫度、水浴時間為因變量,設(shè)計3因素5水平的二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合分析試驗,試驗重復(fù)6 次,共20 個試驗點,試驗因素與水平如表1所示。

    表1 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels used in quadratic regression orthogonal rotation design

    2 結(jié)果與分析

    2.1 啤酒糟提取物蛋白質(zhì)含量及氨基酸組成分析

    采用凱氏定氮法,重復(fù)測定3 次后取平均值,測得蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為52.23%。在1.3.3節(jié)色譜條件下,取標準混合液和樣品溶液各20 μL進樣分析,測定峰面積值,同時對樣品進行3 次平行測定。啤酒糟蛋白氨基酸組成如表2所示。

    表2 啤酒糟蛋白的氨基酸組成(n=3)Table 2 Amino acid composition of BSG protein (n = 3)

    由表2可知,啤酒糟蛋白樣品中共檢測到17 種氨基酸,氨基酸總量為503.943 mg/g,其中人體必需氨基酸(除Try外)含量為183.972 mg/g,占總氨基酸含量的36.48%,而含量最高的是Glu+Gln(23.01%),其次是Pro(12.33%)。谷物蛋白中的第1限制氨基酸[22]Lys相對含量較低,僅4.1%。實驗結(jié)果表明,啤酒糟蛋白中含有大量的Glu,但Lys含量較低,因此考慮添加富含Lys的大豆蛋白配合TGase改性啤酒糟蛋白,一方面可以為酶交聯(lián)反應(yīng)提供更多的催化位點,提高催化效率,另一方面,可以優(yōu)化蛋白質(zhì)中氨基酸配比。

    2.2 單因素試驗結(jié)果

    2.2.1 啤酒糟蛋白添加量對混合蛋白凝膠性能的影響

    圖1 啤酒糟蛋白添加量對混合蛋白凝膠強度的影響Fig. 1 Effect of proportion of BSG protein on gel strength of TGase-treated mixed proteins

    如圖1所示,當啤酒糟蛋白添加量較低時,隨著添加量的增加,混合蛋白的凝膠強度也增加。當添加量超過30%時,凝膠強度隨添加量的升高而下降。這可能是因為隨著添加量的增加,體系中的非蛋白類物質(zhì)增多,從而使得凝膠強度反而下降。因此,啤酒糟蛋白添加量為30%為宜。

    2.2.2 水浴溫度對混合蛋白凝膠性能的影響

    圖2 水浴溫度對混合蛋白凝膠強度的影響Fig. 2 Effect of bath temperature on gel strength of TGase-treated mixed proteins

    如圖2所示,當水浴溫度在20~50 ℃時,混合蛋白的凝膠強度隨水浴溫度的升高呈增長趨勢,當水浴溫度超過50 ℃時,混合蛋白的凝膠強度急劇下降。溫度的升高可以提高酶的活性,且隨溫度的升高,布朗運動速率增加,分子相互碰撞的機會增加,酶催化效率增大[23],故混合蛋白的凝膠強度呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢。當溫度繼續(xù)升高,超過了酶的最適宜溫度時,酶逐漸失活,導(dǎo)致凝膠強度下降[24]。唐傳核等[25]在研究中發(fā)現(xiàn),TGase在60 ℃時幾乎完全失活。本實驗與上述結(jié)論基本相符,選擇水浴溫度為50 ℃。

    2.2.3 水浴時間對混合蛋白凝膠性能的影響

    如圖3所示,隨著水浴時間的延長,混合蛋白的凝膠強度先上升后降低,在120 min時達到最大值。反應(yīng)時間是影響酶促反應(yīng)的重要因素[26],隨著反應(yīng)時間的延長,TGase催化反應(yīng)趨于完全,并且有一定的水分析出,而維持蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性所需要的共價鍵數(shù)目具有一定的飽和性[27],因而反應(yīng)時間過長反而使得凝膠強度降低。因此,選擇水浴時間為120 min為宜。

    圖3 水浴時間對混合蛋白凝膠強度的影響Fig. 3 Effect of heating time on gel strength of TGase-treated mixed proteins

    2.2.4 初始pH值對混合蛋白凝膠性能的影響

    圖4 初始pH值對混合蛋白凝膠強度的影響Fig. 4 Effect of initial pH on gel strength of TGase-treated mixed proteins

    如圖4可知,隨著初始pH值的升高,混合蛋白的凝膠強度呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢,在pH 6~8時TGase均表現(xiàn)出較好的催化效果。當pH值大于8時,混合蛋白的凝膠強度開始下降,這可能是因為過高的pH值使得TGase發(fā)生空間構(gòu)象的改變而部分失活所致[28]。因此,選擇反應(yīng)初始pH值為7。

    2.2.5 加酶量對混合蛋白凝膠性能的影響

    圖5 加酶量對混合蛋白凝膠強度的影響Fig. 5 Effect of TGase dosage on gel strength of TGase-treated mixed proteins

    如圖5所示,隨著TGase添加量的增多,混合蛋白的凝膠強度也隨之呈先上升后平穩(wěn)的趨勢。江波等[29]指出,由于TGase體系中可能存在水解酶,添加量過高反而會影響凝膠的形成。因此,選擇加酶量為15 U/g為宜。

    2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

    利用Design-Expert 8.0軟件的中心組合設(shè)計,以啤酒糟蛋白添加量、水浴時間、水浴溫度為響應(yīng)變量,混合蛋白凝膠強度為響應(yīng)值,進行響應(yīng)面試驗,結(jié)果如表3所示,對表3數(shù)據(jù)進行回歸分析和響應(yīng)面分析,回歸分析結(jié)果如表4所示,響應(yīng)面和等高線如圖6所示。得到以混合蛋白凝膠強度為響應(yīng)值的回歸方程為:凝膠強度=214.46+8.82A-12.16B+8.11C+12.25AB-9.5AC-3.25BC-26.52A2-22.81B2-6.19C2。

    表3 中心組合試驗方案及結(jié)果Table 3 Central composite design with response variable

    表4 回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variances for the developed regression equation

    由表4可知,模型的F值為32.6,P值小于0.000 1,表明該模型達到了極顯著水平;失擬項差異不顯著(P=0.392 6>0.05),這表明模型無失擬因素存在,能較好地反映實際情況;試驗?zāi)P偷臎Q定系數(shù)R2值為0.967 0,說明混合蛋白凝膠強度的檢測結(jié)果與模型預(yù)測結(jié)果有著良好的一致性,試驗?zāi)P偷男U禂?shù)R2Adj值為0.937 4,這表明試驗結(jié)果有93.74%受所選試驗因素的影響。因此,該模型可以較好地對混合蛋白凝膠強度進行分析和預(yù)測。各因素對混合蛋白凝膠強度影響的大小順序為B>A>C,即水浴溫度對混合蛋白的凝膠強度的影響最大,其次是啤酒糟蛋白添加量,最后是水浴時間。由回歸方程和方差分析可知,模型中一次項A、B、C對混合蛋白凝膠強度的影響達到極顯著水平(P<0.01);模型中交互項AB對混合蛋白凝膠強度的影響達到極顯著水平(P<0.01),AC對混合蛋白凝膠強度的影響達到顯著水平(P<0.05);模型中二次項A2、B2對混合蛋白凝膠強度的影響達到極顯著水平(P<0.01),C2對混合蛋白凝膠強度的影響達到顯著水平(P<0.05)。

    2.4 響應(yīng)面分析及模型驗證實驗結(jié)果

    圖6 各因素交互作用的響應(yīng)面Fig. 6 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on gel strength of modified proteins

    響應(yīng)面圖是回歸方程的形象描述,能夠直觀反映各個因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系以及兩因素間交互作用的類型[30-31]。響應(yīng)面圖的等高線呈橢圓形、密集、曲面坡度陡峭則表示兩因素交互影響大,而等高線呈圓形、稀疏、曲面坡度平緩則與之相反[32]。由圖6可知,啤酒糟蛋白添加量與水浴溫度、水浴時間等高線為橢圓形,這表明啤酒糟蛋白添加量與水浴溫度、水浴時間對混合蛋白凝膠強度的影響交互作用顯著。而水浴時間與水浴溫度等高線雖為橢圓形,但較接近圓形,這表明兩者間有一定的交互作用,但交互效應(yīng)較弱;觀察沿坐標軸方向等高線疏密情況可知,在兩兩交互作用中,對于混合蛋白凝膠強度的影響:水浴溫度>啤酒糟蛋白添加量>水浴時間,這與表4方差分析結(jié)果一致。

    利用Design-Expert 8.0軟件進行反應(yīng)條件進行優(yōu)化組合,得到TGase改性大豆與啤酒糟混合蛋白的最佳工藝條件為啤酒糟蛋白添加量29.72%、水浴溫度48.26 ℃、水浴時間131.84 min,此時酶改性所得混合蛋白的凝膠強度最高,達到219.611 g??紤]到實際情況,將最佳處理條件修改為啤酒糟蛋白添加量30%、水浴溫度48 ℃、水浴時間132 min,在此優(yōu)化條件下進行3 次驗證實驗。驗證實驗平均值為218.55 g,與預(yù)測值總體吻合,說明采用響應(yīng)面優(yōu)化TGase改性混合蛋白的處理條件是可行的,所得優(yōu)化工藝條件較可靠。

    3 結(jié) 論

    以啤酒糟為原料,通過濕磨法對其中蛋白質(zhì)進行提取富集,并分析了所得蛋白質(zhì)的氨基酸組成,確立了TGase對啤酒糟蛋白與大豆蛋白混合改性的實驗思路。在單因素試驗的基礎(chǔ)上,選擇啤酒糟蛋白添加量、水浴溫度、水浴時間進行中心組合試驗設(shè)計,使用Design-Expert 8.0軟件進行數(shù)據(jù)擬合,得到TGase改性最佳處理條件為啤酒糟蛋白添加量30%、加酶量15 U/g、反應(yīng)pH 7、水浴溫度48 ℃、水浴時間132 min,在此處理條件下,所得改性后蛋白質(zhì)的凝膠強度為218.55 g。通過驗證實驗所得實際值與模型預(yù)測值接近,證明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化TGase改性啤酒糟蛋白與大豆蛋白混合是準確可行的,對于拓寬啤酒糟蛋白的適用范圍具有重要意義。

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