T4 DNA聚合酶在大腸桿菌中高效表達、純化及部分生物學活性分析

付大偉，陳啟蒙，孫瑩瑩，徐 偉

T4 DNA聚合酶（T4 DNA polymerase，T4 DP），是由T4噬菌體的基因編碼的一種模板依賴的DNA聚合酶[1]，同時具有5’→3’DNA聚合酶活性和3’→5’DNA外切酶活性[2]，可以用于將5’端突出末端補平或3’端突出末端削平，使克隆載體末端平滑化[3-5]，是基因工程技術中一種重要的工具酶。

目前，市場所售的許多DNA末端平滑化試劑盒中的主要作用酶是T4 DP，雖然其可快速補平基因的黏性末端，但也存在問題：末端平滑化的目的片段需電泳和膠回收后才可進行連接反應，這使得構建重組載體的操作變得繁瑣，DNA損失量較大，影響連接效率，所以把末端平滑化反應與連接反應相結合成為現今急需解決的問題。

ccdB致死基因可編碼一種使細菌中促旋酶失活的毒素蛋白CcdB，從而抑制標準大腸桿菌宿主的生長[6]。在重組克隆載體構建過程中，當外源基因成功插入到含ccdB基因的克隆載體中會影響ccdB基因的正常翻譯，從而無法正確表達毒素蛋白CcdB，含有重組子的菌株可以正常生長；當外源基因片段未插入到含ccdB基因的克隆載體中，克隆載體自連后致死基因正確表達，包含自連空載體的宿主無法存活，即低背景。用這種陽性篩選策略可以提高陽性重組率，加速陽性克隆篩選進程[7-9]。

目前較通用的蛋白純化方法是Ni柱純化法[10]，但其存在操作程序繁瑣、時間較長、介質昂貴、純化量少等問題，只適應于實驗室規(guī)模的小量樣品制備[11]。與傳統Ni柱純化法相比較，近幾年興起的MagNi磁珠純化法更具有優(yōu)勢，MagNi磁珠是高均一性的磁性微球，其表面包被Ni＋，可與帶有His標簽的重組蛋白充分特異性結合，使其從混合溶液中分離出來[12-14]。其主要特點有：1）操作簡單、成本低廉；2）分離速度快、效率高、可重復性好；3）特異性強、純化量大，可應用于大規(guī)模生產基因工程重組蛋白；4）不影響重組蛋白活性與功能。

本研究將構建的pET-22b（＋）-T4 dp表達載體在Transetta（DE3）中進行了自誘導表達[15-16]，并對誘導條件進行了優(yōu)化。分別采用MagNi磁珠法與傳統Ni柱法對自誘導表達的T4 DP進行純化，分析兩種方法的純化效果。使純化后的T4 DP應用于末端平滑化反應，并與T4 DNA連接酶協同作用于低背景克隆載體的構建中，旨在研究出一種新的DNA末端平滑化連接方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

Transetta（DE3） 北京全式金生物技術有限公司；TransI菌株、pET-22b（＋）質粒由本實驗室保存。

HiFi DNA Polymerase、Taq DNA聚合酶、DNA Marker 北京全式金生物技術有限公司；限制性內切酶BamHI、NotI、T4 DP、快速末端平齊化?試劑盒美國NEB公司；一步法克隆試劑盒 南京諾唯贊生物科技有限公司；異丙基硫化-β-半乳糖苷（isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG） 美國Sigma公司；篩選用的氨芐青霉素（Amp）、氯霉素（Cmr）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、Triton X-100、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、DNA Blunting 寶生物工程（大連）有限公司；DNA 凝膠回收試劑盒和小量質?；厥赵噭┖忻绹鳲mega公司；Ni SepharoseTM6 Fast Flow親和層析柱美國GE公司；預染蛋白質Marker 美國Thermo公司。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 7.0；LB固體培養(yǎng)基需加入瓊脂粉18 g/L。SOB培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 0.5 g/L、2.5 mmol/L KCl、10 mmol/L MgCl2、瓊脂粉18 g/L。

1.2 儀器與設備

T100TMThermal Cycler聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠；H1650-W臺式離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；GDS8000凝膠成像系統 美國UVP公司；W201B恒溫水浴鍋上海申勝生物技術有限公司；DW-86L388A立式超低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司；DHP-9162恒溫培養(yǎng)箱、HZQ-311C落地恒溫振蕩器 上海一恒科學儀器有限公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 T4 dp基因的擴增

根據T4 DP的基因在Genbank數據庫中報道的序列（U34036）及所需載體的基因序列來設計引物，在上、下游引物的5’端分別加入了BamHI和NotI酶切位點。上游引物P1：5’-GGCGATGGCCATGCGGATTCGATGAAAGA ATTTTATATCTCTATTGAAACAGTCG-3’，下游引物P2：5’-GTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCGCCAAACAGGAAG TCTAACGAAGC-3’（下劃線代表酶切位點），引物送至上海生工生物有限公司進行合成。以提取的T4噬菌體的基因組為模板，PCR擴增獲得T4 dp的基因，利用膠回收試劑盒回收目的基因片段。

1.3.2 重組表達載體的構建

通過一步法將純化產物與經BamHI和NotI酶切后的pET-22b（＋）表達載體連接，構建重組質粒pET-22b（＋）-T4 dp[17]，并直接轉化到 E. coli TransI克隆感受態(tài)細胞中，通過菌落PCR及酶切鑒定篩選出陽性菌，并將其送到上海生工生物有限公司進行序列測定。

1.3.3 自誘導和IPTG誘導重組質粒pET-22b（＋）-T4 dp表達的比較分析

將測序成功的重組質粒pET-22b（＋）-T4 dp轉化到Transetta（DE3）表達感受態(tài)細胞中，涂布于含Amp及Cmr的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落培養(yǎng)過夜，按1‰的接種量分別接種于10 mL含Amp及Cmr的ZYP（1 g/100 mL酸水解酪素＋0.5%酵母提取物＋磷酸鹽）＋5052自誘導培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中，分別進行自誘導[18-19]及IPTG誘導表達[20]。取樣分別進行菌體密度及10 g/100 mL的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析。

1.3.4 磁珠法檢測T4 DP表達的可溶性分析

取1.3.3節(jié)中1 mL自誘導培養(yǎng)的菌液，離心收集菌體，按MagNi Protein Purification Kit的說明書進行純化檢測T4 DP的可溶性。對沉淀、上清液、穿透液、洗脫液進行SDS-PAGE分析。

1.3.5 重組蛋白T4 DP的自誘導表達條件的優(yōu)化

1.3.5.1 自誘導溫度的優(yōu)化

將菌液按1‰的接種量分別接種于4 管10 mL ZYP＋5052自誘導培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600nm值約為0.2時，分別放置于16、20、25、30 ℃培養(yǎng)至OD600nm值約為1.5時，收集菌體，依據1.3.4節(jié)方法進行可溶性T4 DP的純化檢測及SDS-PAGE分析。

1.3.5.2 自誘導時間的優(yōu)化

將菌液按1‰的接種量接種于20 mL含Amp及Cmr的ZYP＋5052自誘導培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)4、5、6、7、8、9、10、12、14、16 h時，收集菌體進行SDSPAGE分析。

1.3.6 不同裂解菌體方法的比較

將菌液按1‰的接種量接種于300 mL含Amp及Cmr的ZYP＋5052自誘導培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)10 h，以100 mL每管分裝于1、2、3號管中，離心收集菌體。向1號管中加入結合緩沖液懸浮菌體，冰浴超聲裂解細胞[21]；向2號管中加入結合緩沖液、終質量濃度1 mg/mL的溶菌酶、10 mmol/L PMSF及終質量分數為1%的Triton-X 100充分混勻，冰浴30 min，超聲破碎[22]；向3號管中加入0.2 mg/L多黏菌素B、50 mmol/L pH 7.5 Tris-HC1、200 mmol/L NaCl、1 mmol/L DTT、1 mmol/L PMSF及100 μL DNaseI溶液懸浮菌體[23]，間歇振蕩20 min。分別離心收集3 個管中的上清和沉淀進行SDSPAGE分析比較。

1.3.7 Ni柱和MagNi磁珠純化效果的比較

1.3.7.1 Ni SepharoseTM6 Fast Flow親和層析柱純化分析

按GE的Ni Sepharose 6 Fast Flow說明書的操作進行純化，取樣進行SDS-PAGE分析。1.3.7.2 MagNi磁珠純化分析

將1.3.5節(jié)中3號管破碎后收集的上清液按1.3.4中方法進行大量純化，收集樣品進行SDS-PAGE分析。

1.3.8 純化后T4 DP質量濃度的測定

用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）20000包埋法對1.3.7.2節(jié)中Ni柱和MagNi磁珠純化后的T4 DP進行濃縮，經脫鹽柱脫鹽以除去咪唑，用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定洗脫液中T4 DP質量濃度，加入storage buffer，－20 ℃保存。

1.3.9 純化后的T4 DP在重組克隆載體中的應用

1.3.9.1 T4 DP的末端平滑化活性檢測

配制末端平滑化連接反應體系，在反應體系中加入10 μL 5×T4 DP Buffer，38 μL EcoRV、HindIII雙酶切pET-32a，0.2 μL待測的T4 DP，0.5 μL 100 μg/mL BSA，2.5 μL dNTPs。反應體系中以ddH2O代替待測酶設為空白對照，以其他公司購買的T4 DP作對照。輕輕混勻，12 ℃反應15 min，1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收后進行連接反應。在連接反應體系中加入2 μL 5×T4 DNA連接酶Buffer，8 μL膠回收產物，0.5 μL T4 DNA連接酶，25 ℃反應30 min。轉化到E. coli TransI克隆感受態(tài)細胞中，涂布于含Amp的SOB固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，觀察菌落數，菌落PCR檢測其陽性克隆率。

1.3.9.2 T4 DP在低背景重組載體構建中的應用

以EcoRV單酶切的pUC19-ccdB載體為克隆載體，以EcoRI和NotI雙酶切的T4多聚核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase，T4 pnk）基因片段為目的片段，配制連接反應體系。在連接反應體系中加入10 μL 5×T4 DNA連接酶Buffer、34 μL EcoRV單酶切的pUC19-ccdB、4 μL EcoRI和NotI雙酶切后的T4 pnk基因片段，25 ℃反應15 min，置冰上2 min，與其他公司的DNA Blunting Kit作對照，按1.3.9.1節(jié)方法進行轉化，培養(yǎng)及檢測。

2 結果與分析

2.1 目的基因的擴增

以T4噬菌體基因組為模板經PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示在約2 697 bp處有一條清晰帶（圖1），與預期目的片段大小一致。

圖1 PCR擴增T4 dp基因Fig. 1 PCR amplification of T4 dp gene

2.2 重組質粒的鑒定

2.2.1 菌落PCR

經一步法構建重組載體pET-22b（＋）-T4 dp，轉化到E. coli TransI中，用含Amp及Cmr的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性菌落，用1.3.1節(jié)中的P1 Primer和T7 ter對挑取的6 個菌落進行菌落PCR檢測，1%瓊脂糖凝膠電泳中約2 740 bp處有明顯條帶，與預期目的片段大小一致（圖2），但以空載體為陰性對照無目的條帶，說明目的條帶成功插入pET-22b（＋）表達載體中。

圖2 菌落PCR鑒定pET-22b（＋）-T4 dp重組質粒Fig. 2 Identification of recombinant plasmid pET-22b(+)-T4 dp by PCR

2.2.2 酶切鑒定

取菌落PCR檢測成功的菌株進行培養(yǎng)，按GenElute?Plasmid Miniprep Kit進行質粒的提取，對其進行BamHI和NotI雙酶切，以重組質粒為陰性對照，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可看到約2 697 bp和約5 370 bp處有兩條條帶（圖3），與預期大小基本符合。利用NCBI中的BLAST程序，將測序的結果與GenBank中所查基因序列進行比對，相似性達98%，成功構建重組質粒pET-22b（＋）-T4 dp。

圖3 雙酶切鑒定pET-22b(+)-T4 dp重組質粒Fig. 3 Identification of recombinant plasmid pET-22b(+)-T4 dp by double enzyme digestion

2.3 自誘導和IPTG誘導重組質粒pET-22b（＋）-T4 dp表達的比較分析

將重組菌Transetta（DE3）/pET-22b（＋）-T4 dp分別進行自誘導及IPTG誘導表達。菌體密度OD600nm值分別為4.5與1.3。SDS-PAGE分析顯示，誘導都產生特異性條帶，其分子質量約104 kDa，與預期大小基本相符（圖4），Bandscan分析表達量分別為50.8%與25.7%。由此可見，自誘導不僅可提高細胞生長密度，而且提高單位細胞中蛋白表達量，誘導效果更顯著，因此選用自誘導培養(yǎng)基誘導更合適。

圖4 T4 DP誘導表達的SDS-PAGE分析Fig. 4 The SDS-PAGE profile of induced expression of T4 DP

2.4 磁珠法檢測T4 DP表達的可溶性分析

圖5 T4 DP可溶性表達的SDS-PAGE分析Fig. 5 SDS-PAGE profile of T4 DP expressed in a soluble form

對上述自誘導后收集的1 mL菌液進行純化檢測其可溶性，SDS-PAGE分析顯示，菌體破碎后上清液中有較多T4 DP，但沉淀和穿透液有T4 DP（圖5），說明表達的T4 DP有包涵體存在，這可能是因為大腸桿菌中外源基因快速大量表達目的蛋白時出現了錯誤性折疊，從而形成失活的包涵體[24]，需要對誘導條件進一步優(yōu)化，以提高T4 DP的可溶性。

2.5 重組蛋白T4 DP的自誘導表達條件的優(yōu)化

2.5.1 自誘導溫度的優(yōu)化

誘導溫度不僅影響菌體的生長，同樣影響著重組蛋白的誘導表達及蛋白的可溶性。低溫誘導可以有助于蛋白的可溶性表達[25]。SDS-PAGE顯示，在30 ℃條件下形成的包涵體相對較少，表達量最高。所以最佳誘導溫度為30 ℃（圖6）。

圖6 溫度對可溶性T4 DP質量濃度的影響Fig. 6 Effects of induction temperature on the solubility of T4 DP

2.5.2 自誘導時間的優(yōu)化

在30 ℃條件下進行自誘導培養(yǎng)4、5、6、7、8、9、10、12、14、16 h時，分別取樣檢測，SDS-PAGE顯示，未誘導的菌體不表達目的蛋白，誘導后菌體表達量隨時間延長而增加（圖7），在誘導10 h時，T4 DP表達量最高，同時菌體內的蛋白酶對重組蛋白的降解也會增加，所以過長時間的誘導對重組蛋白的表達同樣不利，隨后T4 DP的表達量有所減少，所以最佳誘導時間為10 h。

圖7 誘導表達時間對T4 DP表達的影響Fig. 7 Effects of induction time on the expression of T4 DP

2.6 3 種裂解重組菌方法的比較

圖8 不同裂解重組菌體方法的比較Fig. 8 Comparison of recombinant bacteria disintegrated by different methods

分別采用超聲波法、超聲波-溶菌酶法、化學裂解法對100 mL菌體進行破碎。SDS-PAGE顯示，在相同菌體量的條件下，化學裂解法破碎菌體較為完全，上清液中的T4 DP含量較多，所以采用化學裂解法裂解重組菌效果好（圖8）。

2.7 Ni柱和MagNi磁珠純化效果的比較

2.7.1 Ni SepharoseTM6 Fast Flow親和層析柱純化

取10 mL 1.3.6節(jié)中3號管裂解的上清液進行親和層析純化。SDS-PAGE顯示，純化后的洗脫液有一條清晰條帶，其大小與預期的T4 DP相同，但并不是單一條帶，且穿透液及漂洗液中都含有T4 DP，說明T4 DP純化量少，且純化程度不高（圖9）。

圖9 Ni Sepharose 4B親和層析柱純化T4 DP的SDS-PAGE分析Fig. 9 SDS-PAGE analysis of T4 DP purified by Ni Sepharose 4B affinity column

2.7.2 MagNi磁珠純化

取10 mL上述3號管裂解后上清液進行親和層析純化，SDS-PAGE顯示，雖穿透中有少許T4 DP，但純化后的洗脫液僅有一條清晰條帶，其大小與預期的T4 DP相同。由于MagNi磁珠是一種表面包被Ni＋的磁性微球，可懸浮于裂解液中，從而增加特異性結合面積，所以MagNi磁珠法純化程度較高，純化量較大，純化效果較好（圖10）。

圖10 MagNi磁珠純化 T4 DP的SDS-PAGE分析Fig. 10 SDS-PAGE analysis of T4 DP purified by MagNi magnetic beads

2.8 純化后的T4 DP質量濃度測定

分別對Ni柱和MagNi磁珠純化后的T4 DP進行濃縮、脫鹽，采用BCA法測定T4 DP質量濃度分別為539.29、3 073.960 μg/mL。

2.9 純化的T4 DP在重組克隆載體中的應用

2.9.1 T4 DP的末端平滑化活性檢測結果

對EcoRV、HindIII雙酶切的pET-32a進行平末端化及連接反應，重新構建載體。如表1所示，酶切的pET-32a產物沒有經過末端平滑化反應，末端不匹配，則無法進行連接反應，所以無重組菌生長。與A公司及B公司購買的T4 DP進行對比，純化的T4 DP菌落生長數較多，PCR檢測其陽性克隆率最高，說明該酶的末端平滑化活性較好。

表1 T4 DP的末端平滑化活性檢測結果Table 1 Terminal blunting activity of T4 DP obtained from different companies

2.9.2 T4 DP在低背景重組載體構建中的應用

以EcoRV單酶切的pUC19-ccdB載體為克隆載體，以EcoRI和NotI雙酶切后的T4 pnk基因片段為目的片段，通過末端平滑化連接方法構建重組載體pUC19-ccdB-T4 PK。pUC19-ccdB載體中含有ccdB基因，當連接反應不加入T4 DP時，目的片段末端不能平滑化，無法插入到克隆載體中，從而使克隆載體自連抑制宿主細胞生長，所以無菌體生長（表2），說明pUC19-ccdB載體有良好的篩菌作用。與其他公司的試劑盒比較，本研究菌落數較多，陽性克隆率高，說明低背景克隆載體平滑化連接方法具有可行性與高效性。

表2 末端平滑化試劑盒的比較Table 2 Comparison of terminal blunting kits from different companies

3 結 論

本研究以提取的T4噬菌體基因組為模板，根據GenBank上已發(fā)表的來源于T4噬菌體的RB69 DNA polymerase（gene 43）基因序列來設計引物，擴增得到長度為2 697 bp的T4 dp序列，編碼851 個氨基酸。在BLAST上進行比對，與上述所查基因序列相似性達98%。使其插入到 pET-22b（＋）質粒中構建重組表達載體，轉化到Transetta（DE3）表達宿主中進行自誘導及IPTG誘導表達，與IPTG誘導相比，自誘導表達使菌體密度增加到4 倍左右，T4 DP表達量增加到2 倍左右。通過優(yōu)化得出最佳自誘導條件：30 ℃培養(yǎng)10 h。MagNi磁珠純化獲得大量高純度T4 DP，經BCA法檢測其質量濃度為3 073.960 μg/mL，與Ni柱純化的T4 DP相比，其質量濃度提高到Ni柱的5.7 倍。分別利用MagNi磁珠純化獲得的T4 DP及其他公司的T4 DP進行克隆載體的構建，檢測的菌落數及陽性克隆率都較高，證明其具有較好的末端平滑化的作用。最終使其應用于低背景克隆載體平滑化連接方法中，陽性克隆率達97.92%，證明該方法具有可行性和高效性。

為增加可溶性T4DP的表達量，本實驗采取3 種手段：1）選擇自誘導表達T4 DP。馬閃閃等[20]研究表明自誘導表達可使CBM2蛋白表達量提高2 倍，其菌體密度提到4.4 倍。本實驗采用自誘導培養(yǎng)基進行誘導表達，也使重組菌的菌體密度及T4 DP的表達量得到了顯著提高。2）選擇能夠補充大腸桿菌缺乏的8種稀有密碼子（AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA）對應的tRNA的E.coli Transetta（DE3）作為宿主菌，促進外源基因的可溶性表達[26-27]。3）優(yōu)化誘導表達條件，通過預實驗發(fā)現對重組菌表達量影響較大的因素是溫度與時間，對其進行優(yōu)化以確定最佳誘導條件。除了以上方法，仍有許多在實驗中成功提高蛋白可溶性的方法，如使用分子伴侶、增加融合標簽或選擇不同宿主細胞等[28-30]，但由于蛋白質種類繁多、性質各異，目前還沒有一個可以提高可溶性表達的通用方法，所以最佳表達可溶性T4DP的方法還有待進一步深入研究。

本實驗通過Ni柱和MagNi磁珠純化效果的比較，證明MagNi磁珠純化具有操作簡單、結合量大、純化效果好等特點，在重組蛋白分離純化中有良好的應用前景。但本研究還需對MagNi磁珠法的純化條件及對重組酶活性的影響做進一步探究，以確定最佳純化方案。

雖然本研究構建了一種低背景克隆載體末端平滑化連接方法，但只是對該方法進行了初步研究。本課題組還需對該方法中的反應體系和反應條件進一步優(yōu)化，有望實現其在分子生物技術等領域的應用。