蛋白酶和脂肪酶對稀奶油-乳清體系發(fā)酵特性及風味的影響

林偉鋒，周 艷，鮑志寧*，夏楓耿

在生產(chǎn)上利用乳酸菌發(fā)酵或脂肪酶水解等技術對稀奶油進行加工，可得到不同香氣特征的風味物質(zhì)，進而達到增香的目的[1-2]。奶油發(fā)酵會產(chǎn)生獨特的乳酸香味，而脂肪酶水解則產(chǎn)生大量奶香風味物質(zhì)，可提升香氣150～250 倍[3]。目前，酶解乳脂的研究主要集中在制備乳制品風味濃縮物上，王蓓[4]利用脂肪酶和復合風味蛋白酶對奶油進行酶解，制備天然牛奶風味乳基料和牛奶香精，何洋等[5]利用脂肪酶水解無水奶油，制備具有發(fā)酵乳脂味和奶油香味的天然奶味香精。乳清的主要成分是乳清蛋白，具有很高的營養(yǎng)價值和良好的功能性。目前，發(fā)酵乳清蛋白的研究方向多為飲料生產(chǎn)[6]和制備肽[7-8]，而酶解乳清蛋白多被用于研究其產(chǎn)物的抗氧化性等[9-10]。在制備奶味香精物質(zhì)時，混合適量的乳清粉進行發(fā)酵或酶解可明顯改善香味和滋味[11]。張惠丹等[12]將蛋白酶和脂肪酶復配對添加25%乳清液作為輔助底物的奶油進行酶解，制備出具有甜奶香氣的天然風味乳基料。在乳酸菌發(fā)酵協(xié)同蛋白酶和脂肪酶水解的過程中，乳酸菌發(fā)酵賦予體系特征發(fā)酵風味，一些蛋白酶可以加快脂肪酶水解速率[13]，而脂肪酶水解可提高香氣強度，彌補發(fā)酵產(chǎn)香較弱[11]和酶解產(chǎn)香較單調(diào)[14]的不足，最終獲得濃郁而豐富的風味。

利用發(fā)酵工程與酶技術的協(xié)同作用提升乳制品風味是當前研究的熱點。本實驗以稀奶油和濃縮乳清為原料，添加發(fā)酵劑（瑞士乳桿菌和副干酪乳桿菌）與酶制劑（菠蘿蛋白酶和脂肪酶），研究單獨添加及復配添加蛋白酶和脂肪酶對稀奶油-乳清體系發(fā)酵特性及風味的影響，制備營養(yǎng)價值高、具有稀奶油和乳清特有酶解及發(fā)酵風味的濃縮風味乳基，可應用于烘焙食品中，起到增香和提高食品營養(yǎng)價值的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

稀奶油（脂肪質(zhì)量分數(shù)42%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)1.4%）、濃縮乳清（蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)6.9%，乳糖質(zhì)量分數(shù)37.5%，滴定酸度129.14 °T） 廣州市焙杰食品有限公司；瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus，LHB02，1.7×1010CFU/g）、副干酪乳桿菌（L. paracasei，nu-trish?L.CASEI-01，1.6×1011CFU/g） 科漢森（中國）有限公司；菠蘿蛋白酶（30 000 U/g） 南寧龐博生物工程有限公司；脂肪酶（palatase?20000L，30 000 U/mL）諾維信（中國）生物技術有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

固相微萃取頭（75 μm CAR/PDMS） 美國色譜科技公司；DSQ II氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Thermo公司；三合一自動進樣器 澳大利亞SGE公司；APC-2000均質(zhì)機 德國APV設備公司；pHS-25數(shù)顯pH計 上海精密儀器有限公司；SW-CJ-ECU超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；DGX-9243B-2恒溫培養(yǎng)箱 上海?，攲嶒炘O備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 稀奶油-乳清體系的制備

將稀奶油和濃縮乳清混合均質(zhì)制備14%脂肪和4.6%蛋白質(zhì)的稀奶油-乳清體系。體系中乳酸菌接種量、蛋白酶和脂肪酶添加量如表1所示。

表1 稀奶油-乳清體系的配方Table 1 Cream and whey mixtures

工藝流程：稀奶油和濃縮乳清混合均勻→水化（55 ℃，15 min）→均質(zhì)（75 ℃，20 MPa）→滅菌（90 ℃，5 min）→冷卻至40 ℃→接種（瑞士乳桿菌與副干酪乳桿菌接種量比1∶1）和加酶→發(fā)酵（37 ℃，60 h）。

1.3.2 稀奶油-乳清體系發(fā)酵動力學參數(shù)的測定

用pHS-25型酸度計測定pH值[15]；參考文獻[16]的電位滴定法測定滴定酸度；參考文獻[17]測定活菌數(shù)，數(shù)值取3 個平行樣的平均值。

1.3.3 揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定

1.3.3.1 揮發(fā)性風味物質(zhì)的萃取

取樣5.00 g加入20 mL頂空瓶中，60 ℃保溫平衡20 min后，于60 ℃萃取40 min[18]，最后在250 ℃條件下解吸3 min。樣品萃取結束后萃取頭應在270 ℃條件下老化10 min，以防止樣品間相互污染[19]。

1.3.3.2 色譜條件

色譜柱：TG-5ms彈性石英毛細色譜柱（30 m×0.25 μm，0.25 μm）；升溫程序[20]：40 ℃保持2 min，以5 ℃/min升至120 ℃，保持2 min，再以7 ℃/min升至220 ℃，保持5 min；載氣（He）流速1.0 mL/min；分流比10∶1。

1.3.3.3 質(zhì)譜條件

電子電離源；電子能量70 eV；電子倍增器電壓350 V；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度250 ℃；掃描頻率3.00 scans/s；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～350。

1.3.3.4 揮發(fā)性風味物質(zhì)的定性和定量

定性：使用Xcalibur軟件（版本2.0）進行分析處理，再根據(jù)NIST08數(shù)據(jù)庫和Varian libraries進行對比確定揮發(fā)性風味物質(zhì)（忽略正向檢索或反向檢索的相似指數(shù)小于750的物質(zhì)）。

定量：揮發(fā)性風味物質(zhì)以峰面積進行定量。

1.3.4 感官評定

將SK、C、S3、S4和S5樣品（發(fā)酵60 h）完全解凍至室溫后，取5.00 g于樣品瓶中進行直接嗅聞和品嘗，對樣品的氣味和滋味特征進行描述。評定小組為10 人，采用6 分定義標度方法分別對各樣品的氣味（奶油味、芝士味、酸味、奶香味、熱反應味、果香味）和滋味（酸味、甜味、澀味、蠟味）進行強度評定，繪制風味剖面圖。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

用Origin 9.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理和圖表的繪制，并采用SPSS 19.0軟件對揮發(fā)性風味物質(zhì)的顯著性差異進行分析（P＜0.05），并將峰面積數(shù)據(jù)導入SIMCA 13.0進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 不同添加量的蛋白酶對稀奶油-乳清體系乳酸菌增殖和發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

圖1 不同添加量的蛋白酶對乳酸菌增殖（A）和發(fā)酵產(chǎn)酸（B）的影響Fig. 1 Effect of protease dosage on viable cell number of lactic acid bacteria (A) and pH, titratable acidity (B)

由圖1可知，所有樣品在發(fā)酵過程中滴定酸度和活菌數(shù)變化趨勢基本一致，但變化速率有所不同。蛋白酶添加量較低時樣品的pH值、滴定酸度和活菌數(shù)差異不明顯；添加量達到一定量時（高于0.01%）pH值下降速率、滴定酸度上升速率和乳酸菌增殖速率明顯加快；添加量高于0.03%時pH值、滴定酸度和活菌數(shù)則無明顯差異。綜上可知，蛋白酶可促進pH值下降、產(chǎn)酸量上升和乳酸菌增殖，促進效果與添加量呈正相關。隨著蛋白酶添加量增大，乳清蛋白水解產(chǎn)生的肽類和氨基酸增多，促進乳酸菌生長繁殖，產(chǎn)酸速率提高，產(chǎn)酸量增加，pH值下降。

2.2 蛋白酶與脂肪酶對稀奶油-乳清體系乳酸菌增殖和發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

圖2 蛋白酶與脂肪酶對乳酸菌增殖（A）和發(fā)酵產(chǎn)酸（B）的影響Fig. 2 Effect of protease and lipase on viable cell number of lactic acid bacteria (A) and pH, titratable acidity (B)

由圖2可知，所有樣品在發(fā)酵過程中滴定酸度和活菌數(shù)變化趨勢基本一致，但變化速率差異很大。在發(fā)酵過程中S4、S5樣品的滴定酸度遠高于C、S3樣品，這是因為脂肪酶水解產(chǎn)生大量游離脂肪酸，是滴定酸度主要來源。當?shù)味ㄋ岫冗_到一定量時，乳酸菌增殖會受到抑制。復配添加蛋白酶后，S5樣品的滴定酸度反而比S4樣品低，這是因為添加蛋白酶降低了脂肪酶的活性，進而影響其水解產(chǎn)生游離脂肪酸。添加脂肪酶后，在發(fā)酵初期S4、S5樣品的pH值下降速率高于C、S3樣品，在發(fā)酵后期則相反，pH值下降明顯放緩。這是因為一方面游離脂肪酸在水相中存在非離解型和離解型脂肪酸互逆形式，隨著pH值下降，H＋濃度上升，離解型脂肪酸的生成被抑制[18]，H＋濃度上升速率因此減緩；另一方面在發(fā)酵后期S4、S5樣品的活菌數(shù)增殖速率低于C、S3樣品，導致乳酸產(chǎn)量下降，從而使得pH值下降速率減緩，這也說明了脂肪酶水解產(chǎn)生游離脂肪酸抑制乳酸菌增殖。S4樣品的滴定酸度略高于S5樣品，但S5樣品的pH值則明顯低于S4樣品，這是S5樣品中蛋白酶將體系的蛋白質(zhì)水解為低分子質(zhì)量的肽類和氨基酸，使得體系的緩沖能力下降所致。

2.3 蛋白酶與脂肪酶對稀奶油-乳清體系中揮發(fā)性風味物質(zhì)的影響

如表2所示，測定SK樣品和發(fā)酵60 h后C、S3、S4、S5（記為C-60 h、S3-60 h、S4-60 h、S5-60 h）樣品的揮發(fā)性風味物質(zhì)，結果共檢出6 大類，分別是羧酸類、酮類、酯類、醛類、醇類以及其他類。其中，羧酸類9 種，酮類8 種，酯類5 種，醛類6 種，醇類4 種，其他類4 種。

表2 稀奶油-乳清體系的揮發(fā)性風味物質(zhì)Table 2 Volatile flavor compounds isolated fermented cream and whey mixtures

圖3 蛋白酶與脂肪酶對稀奶油-乳清體系中各類揮發(fā)性風味物質(zhì)的影響Fig. 3 Effect of protease and lipase on the composition of volatile compounds in fermented cream and whey mixtures

由表2和圖3可知，被檢出的揮發(fā)性風味物質(zhì)中，羧酸類和酯類物質(zhì)的產(chǎn)生主要與脂肪酶相關，特別是酯類，僅在添加脂肪酶的樣品中被檢出；而酮類和醛類的產(chǎn)生主要與蛋白酶相關，前3 類物質(zhì)對風味的貢獻度最大。揮發(fā)性羧酸類物質(zhì)主要有乙酸、丁酸和己酸，酮類物質(zhì)主要有2,3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮和2-庚酮，酯類物質(zhì)主要有己酸乙酯，與劉南南[21]和王丹[22]等關于酸牛奶關鍵風味物質(zhì)的研究結果較一致，但有所區(qū)別的是本研究中的關鍵風味物質(zhì)多了乙酯類物質(zhì)。

具有揮發(fā)性的羧酸類物質(zhì)能夠強化發(fā)酵乳制品的風味，并且還是其他風味物質(zhì)（如甲基酮和醇等）的前體。如圖3所示，隨著酶制劑種類和不同酶制劑添加量的變化，揮發(fā)性羧酸類呈上升趨勢。添加蛋白酶后，與C-60 h、S4-60 h樣品相比，S3-60 h、S5-60 h樣品的羧酸類含量增加。一方面，乳酸菌在內(nèi)源脂肪酶和酯酶的作用下可將脂肪轉化為磷脂、中鏈多不飽和脂肪酸以及單甘脂等[23-24]，蛋白酶促進乳酸菌增殖，使得乳酸菌利用脂肪轉化為具有揮發(fā)性脂肪酸的能力增強，脂肪酸含量增加；另一方面，乳蛋白被水解后所產(chǎn)生的寡肽和氨基酸在乳酸菌作用下可能會進一步生成C1～C4脂肪酸[25]，因此添加蛋白酶后體系羧酸類含量增加。添加脂肪酶后，與C-60 h、S3-60 h樣品相比，S4-60 h、S5-60 h樣品的羧酸類含量大量增加，種類也增加，S4-60 h樣品增加了3 種中長鏈脂肪酸（戊酸、庚酸和癸酸），S5-60 h樣品增加了4 種（戊酸、庚酸、癸酸和壬酸）。揮發(fā)性羧酸類的增加主要是由于中短鏈脂肪酸的增加所導致，其中丁酸和己酸含量最高，共占羧酸類的76.26%。中短鏈脂肪酸主要由脂肪分解生成[26]，更短的羧酸也可以通過酮類、酯類和醛類的氧化產(chǎn)生[27]。丁酸、己酸、辛酸等這些揮發(fā)性較強的中、短鏈脂肪酸閾值較低，特別是丁酸和己酸，其閾值小于0.3 mg/L，在低濃度下均具有較為濃郁的奶香味[28]。2 種酶復配添加后，與C-60 h樣品相比，S5-60 h樣品的羧酸類含量增加，種類也增加4 種（戊酸、庚酸、癸酸和壬酸）。綜上可知，蛋白酶促進揮發(fā)性羧酸類含量增加；脂肪酶明顯促進揮發(fā)性羧酸類含量和種類增加；2 種酶復配同樣明顯促進揮發(fā)性羧酸類含量和種類增加，促進效果更明顯。

酮類主要是由脂肪酸β氧化降解和乳酸菌檸檬酸分解代謝產(chǎn)生。如圖3所示，添加蛋白酶后，與C-60 h樣品相比，S3-60 h樣品的酮類物質(zhì)含量明顯增加；與S4-60 h樣品相比，S5-60 h樣品的酮類物質(zhì)含量無顯著差異，這可能是因為大量游離脂肪酸抑制了蛋白酶的活性；其中，S3-60 h樣品和S5-60 h樣品的2,3-丁二酮含量分別增加了59.92%和12 倍，這是因為蛋白酶促進乳酸菌增殖，乳酸菌檸檬酸分解代謝增強。添加脂肪酶后，與C-60 h樣品、S3-60 h樣品相比，S4-60 h樣品、S5-60 h樣品的酮類物質(zhì)含量下降，但前者增加了2-十一酮，后者增加了2-十一酮和2-己酮。這是因為脂肪酶抑制乳酸菌增殖，檸檬酸分解代謝減弱，但添加脂肪酶后生物化學反應更復雜，導致了酮類種類發(fā)生變化。2 種酶復配添加后，與C-60 h樣品相比，S5-60 h樣品的酮類含量下降，但種類增加了2 種（2-十一酮和2-己酮）。酮類含量變化最主要是由2,3-丁二酮和3-羥基-2-丁酮引起的，兩者具有芳香性，可賦予樣品奶油特有的風味，提高味感的豐滿度[29]。綜上，蛋白酶促進酮類物質(zhì)含量增加；脂肪酶不利于酮類物質(zhì)含量上升，但種類增加1 種；2 種酶復配同樣不利于酮類物質(zhì)含量上升，但種類增加2 種。

由圖3可以看到，只有在添加脂肪酶的S4-60 h樣品和S5-60 h樣品中才有酯類被檢出，這說明脂肪酶水解產(chǎn)生大量游離脂肪酸有利于酯類的生成，這與鮑志寧[18]的研究結果一致。2 種酶復配后有利于提高酯類物質(zhì)產(chǎn)量。由表2可知，酯類物質(zhì)為乙酯類，其閾值都很低，是乳制品特征風味組分，可賦予樣品花香和果香的風味，還能進一步緩和因中、短碳鏈羧酸濃度過高所帶來的刺激性酸味，從而使得香氣更柔和[30]。

2.4 稀奶油-乳清體系中揮發(fā)性風味物質(zhì)的主成分分析結果

表3 主成分載荷矩陣Table 3 Principal component loading matrix

續(xù)表3

對發(fā)酵60 h體系中揮發(fā)性風味物質(zhì)進行主成分分析，得到載荷矩陣如表3所示。第1主成分反映的主要正載荷為2-壬酮、2-己酮、2-十一酮、除苯甲酸外所有揮發(fā)性羧酸類以及所有酯類；第2主成分反映的主要正載荷為乙酸、2-庚酮、苯甲醛、所有醇類物質(zhì)、2,5-二甲基呋喃、檸檬烯和1,4-戊二烯。

圖4 揮發(fā)性物質(zhì)主成分分析得分圖（A）和載荷得分雙標圖（B）Fig. 4 Score plot (A) and biplot (B) of principle component analysis for volatile compounds

由圖4A可知，每個點代表一個樣品，所有樣品均在95%的置信區(qū)間內(nèi)。第1主成分的貢獻率為63.5%，第2主成分的貢獻率為13.7%，累計貢獻率達到77.2%。由表2和圖4B可知，與樣品在同一個橢圓的揮發(fā)性風味物質(zhì)剛好是該樣品的主要風味物質(zhì)。S4-60 h和S5-60 h樣品及其風味物質(zhì)所在的橢圓與其他2 個橢圓沒有交集，說明脂肪酶能明顯改變體系風味，而S3-60 h樣品及其主要風味物質(zhì)所在的橢圓與C-60 h樣品有交集，2,3-丁二酮是它們共同的風味物質(zhì)，說明蛋白酶對風味主要起增強作用。5 種樣品明顯分散，說明各樣品的揮發(fā)性風味物質(zhì)發(fā)生了很明顯變化。S4-60 h樣品到C-60 h樣品的距離比S3-60 h樣品到C-60 h樣品的距離要遠，這說明脂肪酶對體系揮發(fā)性風味物質(zhì)變化影響比蛋白酶更明顯；S5-60 h樣品距離C-60 h樣品最遠，說明復配2 種酶對體系揮發(fā)性風味物質(zhì)變化影響最明顯，可顯著改變風味。

2.5 稀奶油-乳清體系的感官評定結果

樣品的感官評定分為氣味評定（評香）[4]和滋味評定（品嘗）[31]2 個部分。表4是發(fā)酵60 h樣品描述性評定結果。

表4 樣品氣味和滋味描述結果Table 4 Results of sensory evaluation

酸味和芝士味的產(chǎn)生主要是由脂肪酶水解產(chǎn)生的中、短鏈脂肪酸所引起的，對體系感官品質(zhì)貢獻最大；果香味主要是由酯類物質(zhì)賦予的；奶油味是由酮類物質(zhì)特別是2,3-丁二酮引起的；熱反應味主要是由美拉德反應產(chǎn)生的；蠟味的產(chǎn)生主要是因為脂肪酶水解產(chǎn)生各種單甘酯、甘油二酯和中、長鏈脂肪酸，而澀味和苦味，是蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的苦味肽引起的。

圖5 風味剖面圖Fig. 5 Radar chart of flavor characteristics

由圖5可知，不同樣品的風味強度和特征差異明顯。添加蛋白酶使得S3-60 h樣品產(chǎn)生顯著的奶油味和酸味（滋味），而添加脂肪酶的S4-60 h樣品產(chǎn)生顯著的酸味，綜合表4和圖5可知，蛋白酶和脂肪酶能夠提高樣品的風味品質(zhì)，2 種酶復配則能緩和大量脂肪酸帶來的刺激性酸味，賦予更柔和的風味品質(zhì)。

3 結 論

本實驗以稀奶油和濃縮乳清為原料，添加發(fā)酵劑（瑞士乳桿菌和副干酪乳桿菌）與酶制劑（菠蘿蛋白酶和脂肪酶），研究單獨及復配添加蛋白酶和脂肪酶對稀奶油-乳清體系乳酸菌發(fā)酵特性及風味的影響。蛋白酶可促進體系中乳酸菌增殖和發(fā)酵產(chǎn)酸，促進效果和添加量呈正相關；脂肪酶可大幅度提高體系的酸度，但抑制乳酸菌增殖和發(fā)酵產(chǎn)酸；復配后結合2 種酶的特點，蛋白酶對脂肪酶水解有干擾作用。

頂空-固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜測定結果表明，體系中揮發(fā)性風味物質(zhì)以揮發(fā)性羧酸類、酮類和酯類為主。蛋白酶明顯促進酮類含量增加；脂肪酶明顯地促進羧酸類含量和種類增加，同時酯類的生成是脂肪酶對體系中揮發(fā)性風味物質(zhì)最大的影響；2 種酶復配更明顯地促進羧酸類含量和種類增加，提高了酯類物質(zhì)產(chǎn)量，結合2 種酶的優(yōu)點給樣品帶來更濃郁和更豐富的揮發(fā)性風味物質(zhì)。

通過主成分分析，蛋白酶和脂肪酶復配對體系中揮發(fā)性風味物質(zhì)變化影響最大，顯著改變體系風味；脂肪酶的影響次之，明顯改變風味；蛋白酶的影響最小，對風味主要起增強作用。通過感官評定，蛋白酶和脂肪酶均能提高風味品質(zhì)，復配后能緩和大量脂肪酸帶來的刺激性酸味，賦予更柔和的風味品質(zhì)。本研究為利用發(fā)酵工程與酶技術提升乳制品風味提供了理論支撐和實驗依據(jù)。