單寧酶固定化及其降低藍(lán)靛果汁口腔染色作用分析

韓春然，張家成,*，王 鑫，那治國(guó)，戴傳榮，王佳寧，謝靜南

單寧酶（EC3.1.1.20）又稱單寧?；饷福窃趩螌幩岬葪l件下合成的誘導(dǎo)酶。單寧能被單寧酶水解成葡萄糖和沒(méi)食子酸[1-2]，主要用來(lái)處理單寧所引起的澀味等不好影響。由于單寧酶的大量生產(chǎn)較為困難、使用率低、穩(wěn)定性差等原因，從而導(dǎo)致其價(jià)格昂貴[3-4]。應(yīng)用固定化技術(shù)對(duì)其進(jìn)行研究，經(jīng)過(guò)酶的固定化后不僅可以重復(fù)使用，還可提高酶的各方面性質(zhì)，這對(duì)于將單寧酶進(jìn)行連續(xù)化催化反應(yīng)很有意義[5-7]。單寧微球具有多孔、易回收、比表面積大和可再生等特點(diǎn)[8]，可顯著加強(qiáng)單寧的工業(yè)應(yīng)用，單寧酸在藍(lán)靛果中為含量較高的一種酚類化合物，制得的單寧微球易于分散和吸收[9-12]。

藍(lán)靛果中含有大量的單寧，但在果汁生產(chǎn)中的縮合單寧可影響口感、色澤和澄清度，也因其可與口腔黏膜和唾液蛋白結(jié)合生成沉淀，產(chǎn)生澀味，造成舌頭表皮膜染色現(xiàn)象，這是廣大果汁、飲料中所共同存在的問(wèn)題之一[13-17]。而水解單寧中的鞣花酸具有抗腫瘤、降脂、抗氧化等多種生物活性，對(duì)心腦血管疾病和糖尿病等具有一定的抑制作用[18]。因此，果汁生產(chǎn)中對(duì)單寧的水解以獲得高含量的鞣花酸，對(duì)果汁產(chǎn)品質(zhì)量的改善具有極其重要的生產(chǎn)價(jià)值和理論基礎(chǔ)。

本研究得到了固定化單寧酶的制備條件，將固定化單寧酶利用在藍(lán)靛果果汁單寧水解中，并對(duì)豬舌上層黏膜的染色進(jìn)行研究，考察添加固定化酶的藍(lán)靛果果汁對(duì)豬舌黏膜的染色能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)靛果（忍冬科，忍冬屬） 大興安嶺百盛藍(lán)莓科技有限公司；單寧酶（酶活力為100 000 U/g） 安徽中旭生物科技有限公司；豬舌頭 哈爾濱朝陽(yáng)大市場(chǎng)；鞣花酸（標(biāo)準(zhǔn)品） 上海源葉生物科技有限公司；單寧酸山東浩中化工科技有限公司；液體石蠟、司班85 天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-5200紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；SU8000日立新型掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM） 天美（中國(guó)）科學(xué)儀器有限公司；Spetrum 100傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 美國(guó)Thorlabs公司。

1.3 方法

1.3.1 單寧微球固定單寧酶的制備

1.3.1.1 單寧微球的制備

參考盧玉棟等[19]的方法進(jìn)行制備單寧微球：將5 g/100 mL單寧酸溶液稱取20 g，緩慢攪拌加入到裝有1 g司班85和40 g液體石蠟的250 mL錐形瓶中，調(diào)節(jié)pH 10，攪拌30 min后加入1 g質(zhì)量濃度37 g/100 mL甲醛溶液，在水浴80 ℃中反應(yīng)1 h；再將反應(yīng)物靜置，冷卻、抽濾，依次用丙酮和蒸餾水反復(fù)充分洗滌濾物至其濾液到中性為止；將濾物在室溫下晾干后，70 ℃真空干燥，最終獲得單寧微球。

1.3.1.2 化學(xué)交聯(lián)法制備固定單寧酶

將上述制備好的單寧微球稱取0.05 g放入20 mL 0.03 mg/mL的單寧酶溶液中，調(diào)節(jié)溶液pH值至5.5，25 ℃恒溫振蕩20 min后加入0.10 g/100 mL戊二醛溶液0.1 g，恒溫固化振蕩40 min后過(guò)濾，分別得到固定單寧酶（濾渣）和酶濾液，濾渣取出用大量蒸餾水和緩沖液洗滌后，放入真空干燥器干燥4 h后取出，測(cè)定酶固定化率。

1.3.2 酶活力回收率的測(cè)定

取0.002 0 g的固定化單寧酶，參考保玉心等[20]的方法。固定化酶活力回收率計(jì)算方法如下式所示：

1.3.3 固定化條件的單因素試驗(yàn)

在錐形瓶中加入0.05 g單寧微球，再加入一定量（0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL）的單寧酶液，調(diào)pH值（3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5），振蕩后加入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.00%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.30%）戊二醛，固化一段時(shí)間（20、30、40、50、60、70 min），固定化處理步驟同1.3.1.2節(jié)。測(cè)定固定化酶的活力回收率。

1.3.4 固定化工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

通過(guò)單因素的試驗(yàn)結(jié)果從而確定響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和水平區(qū)間，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析，以確定固定化單寧酶的最佳工藝條件。選取酶質(zhì)量濃度、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH值3 個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and their levels used in response surface analysis

1.3.5 固定化前后酶的表征

1.3.5.1 SEM分析

將干燥的固定化前后單寧酶及載體單寧微球樣品均勻地撒在貼有雙面導(dǎo)電膠的座上，將未黏上的粉末用洗耳球吹去，再噴金處理后放入電鏡樣品室，調(diào)節(jié)觀察倍數(shù)并選擇最佳視野進(jìn)行拍照觀察[21]。

1.3.5.2 FTIR分析

采用將游離單寧酶和固定化單寧酶分別置于干燥器內(nèi)充分干燥，取0.05 g樣品與KBr粉末0.5 g一起放入瑪瑙研缽內(nèi)，混合研磨，烘干10 min后壓片，用Spetrum 100 FTIR儀在4 000～400 cm-1、分辨率為4 cm-1、波數(shù)精度為0.01 cm-1，環(huán)境溫度為25 ℃，經(jīng)32 次掃描測(cè)定樣品FTIR圖[22]。

1.3.6 藍(lán)靛果果汁的制備

將藍(lán)靛果解凍、漂燙，破碎攪拌，將得到的藍(lán)靛果果漿離心（4 000 r/min，15 min），濾液過(guò)濾后滅菌將所得原汁放入冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.7 藍(lán)靛果果汁中鞣花酸含量的測(cè)定

1.3.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考陳笳鴻等[23]方法測(cè)定鞣花酸的含量。稱取10 mg鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品，緩慢加入0.1 mol/L NaOH溶液共3.5 mL，定容至100 mL。分別從稀釋液中取1、5、10、15、20 mL至100 mL容量瓶中，定容，配成質(zhì)量濃度分別為1、5、10、15、20 mg/L的溶液，以蒸餾水為空白，測(cè)定其在357 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.7.2 鞣花酸含量的測(cè)定

取1 mL樣液加入3.5 mL的0.1 mol/L NaOH溶液，常溫下反應(yīng)15 min（顏色由淺黃色變?yōu)樯钭厣┖螅?57 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，以蒸餾水為空白測(cè)定，所有測(cè)試都進(jìn)行3 個(gè)重復(fù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣液中所含有的鞣花酸含量。

1.3.7.3 固定化酶在藍(lán)靛果果汁中的水解

于50 mL藍(lán)靛果果汁中加入0.2 g固定化單寧酶（121 U），分別在50 ℃和40 ℃條件下100 r/min振蕩反應(yīng)1 h后，過(guò)濾，取樣進(jìn)行鞣花酸含量的測(cè)定，以未加酶的藍(lán)靛果汁為對(duì)照組。比較鞣花酸含量的高低，評(píng)價(jià)固定化酶在藍(lán)靛果果汁中水解后提高鞣花酸含量的能力。

1.3.8 豬舌膜染色的檢測(cè)

1.3.8.1 原料處理

選用4 條大小一致、表面膜完整的新鮮豬舌頭，洗凈后沿舌根向舌尖切取表面黏膜，其下層肉全部切除，處理完成后將黏膜均切成形狀一致的小塊，放入盛有0.9%生理鹽水和微量疊氮化鈉的燒杯中，再在4 ℃冰箱中封膜保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.8.2 人工唾液的配制

分別加入0.78 g磷酸氫二鈉、0.795 g氯化鈣、0.005 g硫化鈉、1 g尿素、0.4 g氯化鈉和0.4 g氯化鉀，用蒸餾水定容至1 L，然后用NaOH溶液調(diào)pH值為6.8即配制完成[24]。

1.3.8.3 染色實(shí)驗(yàn)

取處理后的豬舌頭表皮黏膜，放入盛有人工唾液的燒杯中浸泡30 min，然后在25 mL藍(lán)靛果果汁中加入4 mg固定化單寧酶，再用NaOH溶液調(diào)pH值為4.5后，將沾有唾液的豬舌黏膜完全浸入其中，室溫下染色5 min后放入人工唾液中30 min，觀察著色能力。

1.3.8.4 色差分析

取染色完成后的豬舌黏膜樣品采用CS-800型分光測(cè)色儀進(jìn)行測(cè)定。首先使用黑板和白板分別校準(zhǔn)色差儀，再直接將樣品置于光源上進(jìn)行測(cè)量，讀取儀器顯示的數(shù)值（ΔL*、Δa*、Δb*和ΔE*ab），其中ΔL*值為所測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)白板間的亮度（L*）差，ΔL值越大亮度越高；Δa*值為所測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)白板間的a*值差，＋Δa*為紅度加強(qiáng)，-Δa*為綠度加強(qiáng)；Δb*值為所測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)白板間的b*值差，＋Δb*為黃度增加，-Δb*為藍(lán)度增加；ΔE*ab為色差，表示為所測(cè)樣品的L*、a*、b*值與標(biāo)準(zhǔn)白板間的色差值[25]。以此確定其顏色的色調(diào)和明亮度，對(duì)染色效果進(jìn)行分析。

1.3.8.5 固定化酶添加量對(duì)色差的影響

在25 mL藍(lán)靛果果汁中分別加入1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5 mg的固定化單寧酶，并按1.3.8.3節(jié)方法進(jìn)行處理。以未加酶果汁的染色為對(duì)照，分別測(cè)定ΔL*、Δa*、Δb*和ΔE*ab值。

1.3.8.6 顯微鏡分析

將豬舌黏膜在加有固定化酶的果汁中按條件進(jìn)行染色，然后在40 倍顯微鏡下觀察豬舌黏膜表面的染色現(xiàn)象，與未加固定化單寧酶的果汁染色相比較研究其著色能力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行3 次重復(fù)的平均值，采取SPSS 13.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)行方差分析，響應(yīng)面所得數(shù)據(jù)使用Design-Expert 7.0.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶質(zhì)量濃度對(duì)固定化酶活力的影響

圖1 酶質(zhì)量濃度對(duì)固定化酶活力的影響Fig. 1 Effects of tannase concentration on the activity of immobilized enzyme

由圖1可知，酶質(zhì)量濃度為0.03 mg/mL時(shí)，固定化酶的活力回收率最大；當(dāng)酶質(zhì)量濃度低于0.03 mg/mL時(shí)，所制備的單寧微球表面能夠吸附住大部分單寧酶，從而使得酶固定化活力回收率隨酶質(zhì)量濃度的增加而提高；但當(dāng)酶質(zhì)量濃度大于0.03 mg/mL后，達(dá)到一定的酶質(zhì)量濃度時(shí)載體的負(fù)載量已到達(dá)飽和狀態(tài)，相反會(huì)由于空間位阻等一些因素，最終導(dǎo)致固定化酶活力回收率降低。

2.1.2 戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化酶活力的影響

單寧通過(guò)改性成為單寧微球后與戊二醛發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，引入醛基官能團(tuán)，其可與單寧酶發(fā)生Schiff反應(yīng)，連接酶與載體以此實(shí)現(xiàn)游離酶的固定化[26-28]。

圖2 戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化酶活力的影響Fig. 2 Effects of glutaraldehyde concentration on the activity of immobilized enzyme

由圖2可知，戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)單寧酶活力有一定的影響。當(dāng)戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.1%時(shí)，固定化酶的活力回收率隨其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而增大；當(dāng)戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%時(shí)，固定化酶活力回收率達(dá)到最大值；當(dāng)戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.1%～0.3%范圍內(nèi)，固定化酶活力回收率隨戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而逐漸降低，這是由于戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)很小時(shí)易造成酶的流失，但當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)大時(shí)，會(huì)造成與酶蛋白交聯(lián)過(guò)度以此改變活性中心，同時(shí)也會(huì)限制酶與底物之間的接觸和擴(kuò)散，并能較大程度地影響酶活力。

2.1.3 pH值對(duì)固定化酶活力的影響

圖3 pH值對(duì)固定化酶活力的影響Fig. 3 Effects of pH on the activity of immobilized enzyme

在固定化酶的過(guò)程中，pH值的變化會(huì)引起酶的微觀結(jié)構(gòu)改變。由圖3可知，當(dāng)pH值為3.5～6.5時(shí)，固定化酶的活力回收率呈上升趨勢(shì)；當(dāng)pH值為6.5時(shí)，酶活力回收率最高；pH值為6.5～8.5時(shí)，酶活力回收率呈下降趨勢(shì)，這可能是因?yàn)楫?dāng)溶液的pH值超過(guò)一定范圍時(shí)，單寧酶分子的結(jié)構(gòu)特性產(chǎn)生了改變，從而導(dǎo)致酶變性，活力下降。這表明單寧酶的固定化受pH值影響程度大。這可能是因?yàn)楣潭ɑ慕橘|(zhì)其酸堿性在酶結(jié)構(gòu)上受到的影響是根據(jù)酶的凈電荷由介質(zhì)的等電點(diǎn)所決定的。載體的性質(zhì)受到影響是由于其能夠改變其帶電荷量；酶的微觀結(jié)構(gòu)特征的變化會(huì)造成酶特性的改變，從而使酶失去活力[29]。

2.1.4 固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響

圖4 固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響Fig. 4 Effects of immobilization time on the activity of immobilized enzyme

由圖4可知，隨著固定化時(shí)間的延長(zhǎng)，固定化酶活力回收率逐漸上升，當(dāng)達(dá)到40 min時(shí)酶活力回收率最大，40 min后固定化酶活力回收率趨于穩(wěn)定狀態(tài)。這一現(xiàn)象可能是由于交聯(lián)時(shí)間過(guò)短會(huì)影響反應(yīng)的完成程度，隨著固定化時(shí)間延長(zhǎng)，載體交聯(lián)越緊密，固定化效果逐漸提升；且一定質(zhì)量的載體對(duì)固定酶要有一定的時(shí)間，但被載體所吸附的單寧酶量已到達(dá)飽和狀態(tài)時(shí)就不能吸附多余的酶[30]，所以酶活力也就保持相對(duì)的穩(wěn)定狀態(tài)。因此，選取固定化時(shí)間40 min為最佳。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

通過(guò)Design-Expert 7.0.0軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到酶活力回收率對(duì)酶質(zhì)量濃度（A）、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）和pH值（C）的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=70.87-1.23A＋0.12B-0.37C-0.17AB＋0.41AC-0.092BC-2.33A2-3.56B2-3.01C2。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental scheme and results of central composite design

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of the regression model

由表3可知，模型的R2值為0.999 8，表明精簡(jiǎn)模型可用于解釋約99.98%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，其與實(shí)際情況擬合度良好。整體模型F值為2 315.99，P值小于0.000 1，二次方程模型極顯著。方程的一次項(xiàng)中A、B、C對(duì)響應(yīng)值Y（酶活力回收率）的影響極顯著（P＜0.01），二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)Y的影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)AB、AC對(duì)響應(yīng)值Y的影響極顯著（P＜0.01），BC對(duì)Y的影響顯著（P＜0.05）。

2.2.2 因素間的交互影響

圖5 酶質(zhì)量濃度、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)與pH值交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig. 5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of tannase concentration, glutaraldehyde concentration and pH on the recovery of enzyme activity

圖5綜合反映了各變量與響應(yīng)值之間、變量與變量之間的關(guān)系。根據(jù)表3可知，各影響因素對(duì)酶活力回收率的影響均不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。且從等高線圖可知其交互能力的強(qiáng)弱，橢圓形說(shuō)明兩個(gè)因素間交互程度顯著，而圓形則不顯著。酶質(zhì)量濃度與戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)的交互作用較顯著，而其他因素間的交互作用較小。根據(jù)回歸模型通過(guò)Design-Expert軟件分析得出最佳工藝參數(shù)為酶質(zhì)量濃度0.03 mg/mL、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.10%、pH 5.42，酶活力回收率預(yù)測(cè)值為71.05%。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

優(yōu)化響應(yīng)面分析得到的最佳條件為酶質(zhì)量濃度0.03 mg/mL、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.10%、pH 5.4，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，酶活力回收率實(shí)測(cè)值為71.78%，與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為1.02%，而此時(shí)酶的比活力為724.72 U/mg。表明模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，該結(jié)果可適用于單寧微球固定化單寧酶的工藝條件。

2.3 酶固定化前后的表征結(jié)果

2.3.1 SEM結(jié)果

圖6 固定化前后單寧酶SEM圖Fig. 6 SEM images of tannase before and after immobilization

由圖6可知，固定化前單寧酶經(jīng)分離純化后的球形結(jié)構(gòu)較為規(guī)整、表面較致密光滑，粒徑分布較均勻；制備的單寧微球?yàn)闂U狀結(jié)構(gòu)，形狀不規(guī)則、組織致密，表面較粗糙；經(jīng)單寧微球固定的單寧酶由最初的致密轉(zhuǎn)為疏松，表面比較粗糙，結(jié)構(gòu)由球形變?yōu)闂U和球的交聯(lián)狀態(tài)，且其表面含有部分的絮狀物，這可能由于單寧微球有較強(qiáng)的結(jié)合能力，結(jié)合過(guò)程中高分子鏈?zhǔn)軉螌幟傅慕j(luò)合作用重新聚集的結(jié)果。

2.3.2 FTIR結(jié)果

單寧酶及單寧微球有不同基團(tuán)，紅外吸收因而具有差異，固定化單寧酶是游離單寧酶和單寧微球的結(jié)合，紅外吸收具有相同的特性，三者FTIR如圖7所示。

游離單寧酶的FTIR圖譜中在3 437 cm-1處出現(xiàn)較強(qiáng)的吸收，是單寧酶上有氨基伸縮振動(dòng)引起的吸收峰，2 923 cm-1處的吸收峰為亞甲基的伸縮振動(dòng)峰，1 630 cm-1處吸收峰為C—O的伸縮振動(dòng)峰。而歸屬分子間氫鍵O—H的伸縮振動(dòng)吸收峰由單寧微球的3 458 cm-1略低移至固定化單寧酶的3 456 cm-1，且固定化單寧酶在此的峰變強(qiáng)變寬，說(shuō)明分子間含有較強(qiáng)的氫鍵。在單寧微球和固定化單寧酶上均出現(xiàn)了單寧酶在2 923 cm-1處的特征吸收峰，表明吸收峰的細(xì)微變化是可信的。同時(shí)，單寧微球和固定化單寧酶都在1 694 cm-1處出現(xiàn)羧酸的C=O伸縮振動(dòng)峰，在1 523 cm-1處的吸收峰為C=C伸縮振動(dòng)峰；單寧微球在1 620 cm-1處因與戊二醛發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)生成Schiff堿使C=N伸縮振動(dòng)得以加強(qiáng)，而在固定化單寧酶中，由于單寧酶中的氨基與戊二醛中的一個(gè)醛基發(fā)生反應(yīng)，所有在1 621 cm-1處的吸收峰減弱，這都表明單寧酶很好地固定在單寧微球上。而1 630 cm-1處的吸收峰沒(méi)有在固定化酶中出現(xiàn)，可能是由于該峰是粗單寧酶雜質(zhì)的吸收峰，并沒(méi)有被單寧微球載體所吸附，故固定化單寧酶上沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)的吸收峰。

圖7 單寧微球、單寧酶和固定化單寧酶的FTIRFig. 7 FTIR spectra of tannin microspheres, tannase and immobilized tannase

2.4 鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

鞣花酸質(zhì)量濃度與其357 nm波長(zhǎng)下的吸光度成正比，隨著鞣花酸質(zhì)量濃度的升高，其吸光度也逐漸升高。其線性回歸方程為y=0.024x＋0.036 6，R2=0.993 7。其中，x為所測(cè)溶液中鞣花酸質(zhì)量濃度/（mg/L），y為所測(cè)定的吸光度A。

2.5 固定化酶在藍(lán)靛果果汁中的水解

表4 酶在藍(lán)靛果果汁中水解后鞣花酸含量的變化Table 4 Changes in ellagic acid content after enzymatic hydrolysis of Lonicera edulis juice

由表4可知，在藍(lán)靛果果汁中分別添加游離單寧酶和固定化單寧酶水解后，果汁中鞣花酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別明顯提高了5.57%和29.12%，這表明果汁中加入單寧酶后水解轉(zhuǎn)化成鞣花酸這一過(guò)程成功，能有效增加鞣花酸的含量，且固定化酶的水解程度明顯高于游離酶，所以根據(jù)固定化酶的水解能力、穩(wěn)定性、貯藏性和重復(fù)使用性等性質(zhì)可完全替代游離酶在果汁飲料等工業(yè)生產(chǎn)中進(jìn)行使用。

2.6 固定化酶添加量對(duì)色差的影響

表5 固定化酶添加量對(duì)色差的影響Table 5 Effect of immobilized tannase dosage on color difference

由表5可知，隨著固定化酶添加量的增加，ΔE*ab值逐漸降低，表明色差下降。當(dāng)固定化酶添加量小于4 mg時(shí)，ΔL*、Δa*、Δb*三個(gè)值表明整體果汁偏亮深紅色，ΔE*ab值大于3.83；當(dāng)固定化酶添加量為4 mg時(shí)，果汁顏色偏亮深紅藍(lán)色，ΔE*ab值為3.49，與原果汁色差值相差較大；當(dāng)添加量為4.5 mg時(shí)，果汁顏色偏亮紅色，且ΔE*ab值不變。根據(jù)色差值的變化說(shuō)明了較原果汁相比，固定化酶的添加對(duì)顏色變化起到一定的作用。

2.7 顯微鏡分析

圖8 豬舌黏膜染色前后顯微鏡圖Fig. 8 SEM images of tongue mucous membrane before and after staining with L. edulis juice with immobilized tannase added

由圖8所示，豬舌黏膜經(jīng)染色前后變化明顯，實(shí)際上經(jīng)過(guò)原果汁染色后與再經(jīng)人工唾液浸泡后（圖8C）一樣，沒(méi)有明顯變化，所以原果汁對(duì)豬舌黏膜的著色能力強(qiáng)，色素幾乎完全沉著在舌頭表層黏膜上。而經(jīng)過(guò)加入固定化單寧酶的藍(lán)靛果果汁染色（圖8B）后，對(duì)豬舌黏膜的著色現(xiàn)象明顯低于圖8C的著色現(xiàn)象，這說(shuō)明固定化酶的添加對(duì)舌頭黏膜的著色能力大為降低。加入固定化酶的果汁染色后再經(jīng)唾液浸泡（圖8D）后，其顏色較圖8B明顯變淺，較8C圖顏色相差巨大，與8A圖相比顏色僅較深些，這是因?yàn)榧佑泄潭ɑ傅墓构械膯螌幩鉃轺坊ㄋ?，提高水解能力從而降低著色能力，且此果汁?jīng)唾液的浸泡或浸入，使得色素、沉淀被從豬舌表層黏膜上脫落下溶解到唾液中，從而對(duì)舌頭黏膜的著色現(xiàn)象有所減弱。

3 結(jié) 論

以單寧微球?yàn)楣潭ɑ篙d體，固定化單寧酶的研究，得到的單寧酶固定化最佳工藝條件為酶質(zhì)量濃度0.03 mg/mL、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.10%、pH 5.4、固定化時(shí)間40 min，此條件下的酶活力回收率為71.78%，比活力為724.72 U/mg；SEM顯示游離酶球形結(jié)構(gòu)表面較致密光滑，單寧微球?yàn)闂U狀結(jié)構(gòu)，表面較粗糙，而酶固定化后結(jié)構(gòu)疏松，表面較粗糙，結(jié)構(gòu)由球形變?yōu)闂U和球的交聯(lián)狀態(tài)，表明酶已固定到載體上；FTIR圖譜顯示單寧酶很好地固定在單寧微球上。

此外，通過(guò)對(duì)固定化酶在藍(lán)靛果果汁水解中應(yīng)用的研究表明，在果汁中添加固定化單寧酶水解后，果汁中鞣花酸含量明顯提高了29.12%。固定化酶添加量為4 mg時(shí)ΔE*ab值為3.49；著色能力明顯減弱。顯微鏡觀察表明經(jīng)過(guò)固定化酶處理后的果汁能明顯降低對(duì)舌頭黏膜的著色能力。