甘油醛-3-磷酸對羊肉色澤穩(wěn)定性和高鐵肌紅蛋白還原的影響

辛建增，李 錚，李 欣，李桂霞，任 馳，張德權(quán),*

色澤是消費(fèi)者購買生鮮肉時的重要評價指標(biāo)[1]，而生肉色澤劣變通常會被認(rèn)為是其營養(yǎng)品質(zhì)發(fā)生了劣變[2-3]，這會引起銷售困難，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。在充分放血的鮮肉中，肉色主要是由肌肉中的肌紅蛋白含量及不同狀態(tài)占比所決定的[3]。Ledward等[6]研究指出，高鐵肌紅蛋白還原可能是宰后維持肉色穩(wěn)定最重要的因素，還原型輔酶I（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）是高鐵肌紅蛋白還原（包括酶促反應(yīng)和非酶促反應(yīng)）時必要的還原當(dāng)量[7]，它能夠在高鐵肌紅蛋白還原酶的作用下將高鐵肌紅蛋白還原為脫氧肌紅蛋白，脫氧肌紅蛋白與氧氣結(jié)合后生成亮紅色的氧合肌紅蛋白，是消費(fèi)者認(rèn)可的亮紅色[8]。

研究表明糖代謝過程中的中間產(chǎn)物乳酸、丙酮酸、谷氨酸、琥珀酸等添加到肉中，均能夠起到穩(wěn)定肉色的作用，這是由于添加的底物在肌肉中相關(guān)脫氫酶作用下，生成NADH，發(fā)揮穩(wěn)定肉色的作用[9-12]。此外，添加的底物還具有抑制脂肪氧化的作用，間接發(fā)揮穩(wěn)定肉色的作用[10,13]。甘油醛-3-磷酸（3-phosphoglyceraldehyde，GAP）是糖酵解過程中的中間代謝產(chǎn)物，其在甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的催化下能夠生成NADH和1,3-二磷酸甘油酸[14-15]。Saleh等[16]的研究表明將能夠產(chǎn)生GAP的底物添加到牛肉糜中，能降低樣品中高鐵肌紅蛋白的含量，但是并未對這種現(xiàn)象進(jìn)行深入分析。本研究擬采用原位模型及離體模型驗證GAPDH催化底物GAP產(chǎn)生的NADH能否直接用于高鐵肌紅蛋白還原。原位模型中，向羊肉糜中添加GAPDH的底物GAP，探究其對肉色穩(wěn)定性的影響。離體模型中，將GAPDH、GAP與線粒體和高鐵肌紅蛋白的溶液共同孵育，測定高鐵肌紅蛋白的占比以及在孵育過程中氧氣的消耗，基于此，確證GAPDH催化底物GAP產(chǎn)生的NADH能否直接被用于高鐵肌紅蛋白的還原，明確GAPDH活性調(diào)控肉色穩(wěn)定性的作用途徑，以期為調(diào)控宰后肉色提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所用材料為小尾寒羊與本地羊的雜交公羊（8 月齡，未去勢），胴體質(zhì)量（21.45±1.23）kg，采樣地點(diǎn)為北京市海淀區(qū)陽坊西貫惠茹牛羊肉屠宰廠。

馬骨骼肌肌紅蛋白（M0630-250MG）、GAP（G5251-100MG）、GAPDH（G0763）、乙醇脫氫酶（E1.1.1.1） 美國Sigma公司；SM0020-100T型線粒體提取試劑盒、G1570型詹納斯綠B染液（0.2%） 北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

OXYGRAPH型Clark液相氧電極 漢莎科學(xué)儀器有限公司；UV-2401型紫外-可見分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司；Minolta CM-400d型色差值 日本大阪柯尼卡美能達(dá)傳感器股份有限公司；FCR1000-UF-E型除熱源型EDI超純水機(jī) 青島富勒姆科技有限公司；FE-20型實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-4型恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 方法

本研究分為兩部分進(jìn)行，第1部分為原位模型，將GAPDH的底物GAP添加到羊肉糜中，測定其對肉色穩(wěn)定性的影響，并測定NADH含量。第2部分為離體模型，提取羊心肌線粒體將其作為高鐵肌紅蛋白還原酶，將線粒體、GAPDH及其底物GAP等分別與高鐵肌紅蛋白共同孵育，在pH5.6和pH7.4兩個緩沖體系中，驗證GAPDH催化底物GAP產(chǎn)生的NADH能否直接用于高鐵肌紅蛋白的還原。

1.3.1 原位模型的構(gòu)建

選取5 只飼養(yǎng)環(huán)境相同的8 月齡小尾寒羊與本地羊雜交公羊，在宰后30 min取兩側(cè)背最長肌，經(jīng)4 ℃成熟24 h后，剔除筋膜及可見脂肪。將每只羊的背最長肌絞制成肉糜，并稱取100 g三份：分別添加0.05%、0.01% GAP為T1、T2實驗組，以添加0.05%蒸餾水為對照組（C）。將稱量好的肉糜置于9 cm直徑的培養(yǎng)皿中，肉糜厚度約為1.5 cm。將培養(yǎng)皿放置在4 ℃冰箱中，避光。在2 h、1 d、2 d、3 d、4 d、6 d分別測定色差值，并將測定生化指標(biāo)的樣品采用液氮速凍，于－80 ℃冰箱保存。

1.3.1.1 色差值的測定

羊肉色差值采用CIE-L*a*b*法測定，肉排表面覆蓋上透明的PVC膜，使用便攜式色差計測定表面的亮度值（L*）、紅度值（a*）、黃度值（b*），色差計選擇A光源，直徑2.54 cm光圈和10°觀測器，在使用前用白板進(jìn)行校準(zhǔn)。對每一肉樣平行測定5 次取平均值。

1.3.1.2 NADH含量的測定

NADH的提取參照Klingenberg等[17]方法進(jìn)行。稱取2 g羊肉樣品添加到16 mL冷的乙醇-KOH溶液中，采用勻漿機(jī)在冰上勻漿30 s后，采用振蕩器振蕩30 s，然后在90 ℃的水浴鍋中水浴5 min，迅速置于冰浴中5 min。經(jīng)冰浴冷卻的混合物添加約12 mL混合溶液（0.5 mol/L三乙醇胺鹽酸鹽、0.4 mol/L磷酸二氫鉀、0.1 mol/L磷酸氫二鉀）并調(diào)節(jié)pH值至7.8。在室溫下靜置10 min，使變性的蛋白質(zhì)沉淀，然后用冷凍高速離心機(jī)4 ℃、25 000×g離心10 min。

NADH含量的測定參考Kim等[18]的方法進(jìn)行，將0.1 mL提取液添加到反應(yīng)測定體系中，反應(yīng)體系：2.5 mL 17.5 μg/mL的二氯酚靛酚溶液，0.5 mL 0.1 mol/L的磷酸鈉緩沖液（pH 7.4），0.5 mL 1 mg/mL的吩嗪硫酸二甲酯溶液，0.1 mL的99%乙醇溶液，0.05 mL乙醇脫氫酶。將反應(yīng)體系所有的溶液混合后，置于分光光度計反應(yīng)20 min，每2 min測定600 nm波長處吸光度，然后按照制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算NADH含量。

1.3.2 離體模型的構(gòu)建

選取3 只飼養(yǎng)環(huán)境相同的8 月齡小尾寒羊與本地羊雜交公羊，在宰后30 min取心臟用于提取線粒體。將得到的線粒體用于離體模型實驗，實驗組分組如下：高鐵肌紅蛋白；線粒體＋高鐵肌紅蛋白；氧化型輔酶I（diphosphopyridine nucleotide，NAD）＋線粒體＋高鐵肌紅蛋白；GAPDH＋GAP＋NAD＋線粒體＋高鐵肌紅蛋白；GAP＋線粒體＋高鐵肌紅蛋白。樣品在25 ℃孵育3 h，在反應(yīng)的0、1、2、3 h時取樣測定高鐵肌紅蛋白含量。設(shè)置pH5.6和pH7.4兩組反應(yīng)體系進(jìn)行實驗，反應(yīng)體系的配制參考Ramanathan等[2]的方法。

1.3.2.1 高鐵肌紅蛋白溶液的制備

馬骨骼肌肌紅蛋白溶解到一定體積的磷酸鹽緩沖液（2.0 mmol/L，pH 5.5）中，25 ℃、10 000×g離心10 min，25 ℃自然氧化28 h，用磷酸鹽緩沖液（2.0 mmol/L，pH 7.0）將其濃度調(diào)到0.75 mmol/L。取少量氧化后的肌紅蛋白溶液再稀釋5～10 倍，測量氧化后溶液中高鐵肌紅蛋白的相對含量，確認(rèn)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于95%，分裝后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 線粒體的提取

采用SM0020-100T型線粒體提取試劑盒進(jìn)行提取線粒體，按照說明書采用差速離心法提取羊心肌線粒體。將得到的線粒體提取液采用透射電子顯微鏡和油鏡觀察。

1.3.2.3 透射電子顯微鏡負(fù)染

先將樣品懸浮液滴在干燥的載玻片上，再把帶有支持膜的銅網(wǎng)放在懸浮液的液珠上漂浮以沾取樣品；然后用濾紙吸干銅網(wǎng)上的多余懸液，再將銅網(wǎng)在染液滴珠上漂浮，時間1～2 min，最后再用濾紙將染液吸干即可觀察。

1.3.2.4 詹納斯綠B染色

取新鮮提取的線粒體與0.5%詹納斯綠B染色液等量混合，染色2 min，置于油鏡下觀察。

1.3.2.5 氧氣消耗率（oxygen consumption rate，OCR）的測定

OCR測定按照高曉光[19]的方法進(jìn)行。樣品OCR利用Clark液相氧電極進(jìn)行測定。氧電極與電腦連接，并使用Oxygengraph TM軟件采集、分析數(shù)據(jù)。在25 ℃對Oxytherm液相氧電極進(jìn)行校正，用高濃度、現(xiàn)用現(xiàn)配的連二亞硫酸鈉校正零氧基線，然后用去離子水清洗反應(yīng)室6 次以上。再用反應(yīng)緩沖液沖洗幾次，向反應(yīng)室加入2 mL氧飽和的緩沖液，蓋好反應(yīng)室蓋子（保持密閉，以免外界氧氣進(jìn)入反應(yīng)室）。開啟轉(zhuǎn)子，開始記錄氧含量，等待2 min使氧含量平穩(wěn)。取提取的線粒體及反應(yīng)物質(zhì)加入反應(yīng)室，立即計時，記錄10 min內(nèi)的OCR，取平均值。測量溫度25 ℃。OCR值的計算如公式（1）[20]所示：

1.3.2.6 高鐵肌紅蛋白相對含量的測定

采用分光光度法[21]測定孵育體系反應(yīng)0、1、2、3 h后高鐵肌紅蛋白相對含量。將反應(yīng)后的樣品采用分光光度計進(jìn)行掃描，波長分別為503、525、557、582 nm。利用公式（2）計算高鐵肌紅蛋白的相對含量：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

色差值、NADH含量、高鐵肌紅蛋白相對含量、OCR的數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果表示為±s。平均值之間的比較采用ANOVA在0.05水平進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 原位模型中添加GAP對樣品理化性質(zhì)的影響結(jié)果

2.1.1 添加GAP對色差值的影響

由表1可知，向羊肉糜中添加GAP能夠改善肉色穩(wěn)定性，提高貯藏期間樣品的a*（紅度值），GAP添加量0.05%樣品的a*值在貯藏期間高于對照組和0.01%樣品組，除貯藏的第4天外，0.05% GAP添加組樣品a*值顯著高于對照組。3 組樣品L*值在貯藏早期，0.05% GAP添加組最高，隨著貯藏時間延長，0.01% GAP添加組樣品逐漸變高。0.05% GAP添加和對照組樣品b*值呈下降趨勢，然而在0.01% GAP添加組則呈上升趨勢。

表1 GAP對羊肉糜樣品色差值的影響Table 1 Effect of GAP on color difference of mutton

2.1.2 添加GAP對NADH含量的影響

圖1 樣品NADH含量在貯藏期間的變化Fig. 1 Change in NADH content of mutton sample during storage

由圖1可知，3 組樣品中的NADH含量隨時間的延長呈現(xiàn)降低的趨勢，0.05% GAP添加組樣品NADH含量在貯藏的1、2、3、4 d顯著高于對照組，0.01%底物添加組樣品在貯藏第2天時顯著高于對照組，其余時間點(diǎn)均差異不顯著。說明添加GAP后，通過樣品的GAPDH活性，催化GAP生成1,3-二磷酸甘油酸，同時生成了NADH，從而使該組樣品中的NADH含量顯著高于對照組。

2.2 離體模型中添加GAP對樣品生化指標(biāo)的影響

2.2.1 線粒體的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

圖2 線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)在透射電子顯微鏡下的結(jié)構(gòu)（A）和油鏡下的形態(tài)（B）Fig. 2 Microstructure of mitochondria under transmission electron microscope (A) and morphology under an oil immersion lens (B)

線粒體提取液經(jīng)負(fù)染后，采用透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察，如圖2所示，線粒體結(jié)構(gòu)（箭頭所示）比較完整，尤其是膜結(jié)構(gòu)比較明顯。線粒體提取液采用詹納斯綠B染色2 min后，采用油鏡觀察，可以看到視野中有許多的短桿狀結(jié)構(gòu)，說明提取到了線粒體，而且濃度較高，采用BSA法測定得到提取的線粒體蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL。

2.2.2 高鐵肌紅蛋白相對含量結(jié)果

圖3 體外添加GAPDH及其底物在不同pH值孵育3 h對高鐵肌紅蛋白占比的影響Fig. 3 Effects of GAP and GAP-GAPDH-NAD on mitochondriamediated metmyoglobin reduction after incubation for 3 h at 25 ℃ at pH 5.6 and 7.4

由圖3可知，高鐵肌紅蛋白相對含量在高鐵肌紅蛋白＋線粒體＋NAD組和高鐵肌紅蛋白＋線粒體＋NAD＋GAPDH＋GAP組均呈顯著下降的趨勢（P＜0.05），未添加NAD組樣品高鐵肌紅蛋白占比未產(chǎn)生顯著變化。在實驗期間，pH7.4的孵育體系的高鐵肌紅蛋白占比在孵育中低于pH5.6的孵育體系。這說明添加GAPDH及其底物在體外模型條件下能夠起到還原高鐵肌紅蛋白的作用，且pH值會影響高鐵肌紅蛋白的還原，接近生理pH值條件有利于高鐵肌紅蛋白的還原。

2.2.3 OCR結(jié)果

由圖4可知，在體外模型條件下，各實驗組樣品均有一定的OCR，添加了GAPDH和底物GAP組的樣品OCR在所有的實驗組中最高（P＜0.05），且在pH7.4時，OCR比pH5.6時高，結(jié)果表明添加GAPDH及底物GAP能夠增加線粒體的代謝作用，促進(jìn)NADH的產(chǎn)生，加速線粒體電子鏈的傳遞作用，促進(jìn)高鐵肌紅蛋白的還原。

圖4 不同處理組樣品在25 ℃環(huán)境下pH 7.4和pH 5.6時的OCRFig. 4 Oxygen consumption rate of myocardial mitochondria (MT) with either GAP or GAP-GADH-NAD as substrate at pH 5.6 and pH 7.4 at 25 ℃

3 討 論

NADH是高鐵肌紅蛋白還原酶催化高鐵肌紅蛋白還原所必需的還原當(dāng)量[11,22]。向羊肉樣品中添加GAP會顯著提高樣品的紅度值，這主要是由樣品中的GAPDH和高鐵肌紅蛋白還原酶活性決定的，添加的GAP在樣品中GAPDH活性的作用下再生成NADH，NADH在高鐵肌紅蛋白還原酶的作用下，能夠促進(jìn)高鐵肌紅蛋白的還原，使肌肉中肌紅蛋白保持還原狀態(tài)，所以其色澤穩(wěn)定性好[13,23]。這與Saleh等[16]的研究結(jié)果相似，其結(jié)果表明向牛肉糜中添加能夠生成GAP的底物，牛肉中的高鐵肌紅蛋白累積速度明顯下降，其在實驗過程中并沒向樣品中直接添加GAP，而是向其中添加能夠生成GAP的底物，本研究是向樣品中直接添加GAP，表明羊肉糜中添加GAP能夠顯著提高樣品的紅度值和NADH含量。離體實驗中，添加GAPDH和GAP組及NAD組樣品的高鐵肌紅蛋白占比顯著低于另外實驗組樣品，離體實驗結(jié)果表明GAPDH催化GAP產(chǎn)生的NADH能夠用于高鐵肌紅蛋白的還原，這與原位模型的結(jié)果相符合，原位模型的結(jié)果顯示添加GAP會升高羊肉樣品的紅度值。

NADH被用于高鐵肌紅蛋白還原時，需要線粒體上的高鐵肌紅蛋白還原酶發(fā)揮作用[24-25]，而且線粒體的電子傳遞鏈要保持完整，在此過程中會增加氧氣的消耗[22,26-27]。添加GAPDH和GAP組及NAD組樣品的OCR高于其他組樣品，是該兩組樣品中的NADH含量較高，高鐵肌紅蛋白還原活動比較劇烈的一個有力證據(jù)。

高鐵肌紅蛋白的還原在pH5.6的緩沖體系中低于pH7.4，并且OCR也低，這與Ramanathan等[27]的研究結(jié)果相似，接近于生理的pH值更有利于GAPDH催化底物產(chǎn)生NADH和高鐵肌紅蛋白還原酶發(fā)揮活性。偏酸性環(huán)境會加速肌紅蛋白的氧化，這主要是由于在酸性環(huán)境中肌紅蛋白的自氧化作用比較活躍[22,28-30]。

4 結(jié) 論

本研究通過原位模型結(jié)合離體模型證實，向宰后羊肉中添加GAP能夠提高樣品的色澤穩(wěn)定性，這主要是由于在GAPDH催化下生成的NADH能夠被用于高鐵肌紅蛋白的還原，降低了高鐵肌紅蛋白的占比。離體模型進(jìn)一步證實，GAPDH催化GAP產(chǎn)生的NADH能夠降低高鐵肌紅蛋白的占比，會增加OCR。因此，GAPDH通過催化底物GAP產(chǎn)生NADH作用于高鐵肌紅蛋白的還原影響肉色穩(wěn)定性。