大鼠急性一氧化碳中毒后c-fos蛋白的表達(dá)研究

黃衛(wèi)巍,陳 陽

（皖南醫(yī)學(xué)院：1法醫(yī)病理學(xué)專業(yè)2016級；2法醫(yī)學(xué)院病理教研室，安徽蕪湖241002）

一氧化碳中毒是法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中十分常見的死亡原因之一。關(guān)于一氧化碳中毒死亡的鑒定主要是依據(jù)碳氧血紅蛋白致死飽和度、尸體現(xiàn)象(血液及組織呈現(xiàn)櫻桃紅色）及案發(fā)現(xiàn)場的勘察等,然而在實(shí)際檢案中卻經(jīng)常遇到特征性尸體現(xiàn)象不明顯、血液中HbCO遠(yuǎn)低于致死飽和度（50%以下）等問題，給CO中毒死亡的判定帶來一定困難，并引發(fā)很多爭議[1]。c-fos蛋白屬于原癌基因家族，具有即時(shí)、快速反應(yīng)的功能[2]。在正常的生理情況下，c-fos基因及蛋白僅有少量微弱的表達(dá)，當(dāng)腦組織受到一系列的病理或生理的刺激后，c-fos蛋白將大量的表達(dá)。已有研究證實(shí)了c-fos基因及蛋白在腦挫傷、電流損傷等方面的表達(dá)[3-4]，而鮮見有關(guān)c-fos蛋白在急性一氧化碳中毒早期的研究報(bào)告。本研究采用靜態(tài)吸入染毒法建立大鼠急性一氧化碳中毒模型，運(yùn)用Western blot?ting法檢測c-fos蛋白在一氧化碳中毒大鼠腦組織中早期的變化規(guī)律，免疫組織化學(xué)法觀察c-fos蛋白的表達(dá)部位，以期為法醫(yī)學(xué)推斷急性一氧化碳中毒死亡及死亡時(shí)間提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠，25只，體重280～300 g(南京青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。隨機(jī)分為急性一氧化碳中毒組及實(shí)驗(yàn)對照組，一氧化碳中毒組按中毒后不同時(shí)間點(diǎn)分為3 h、6 h、12 h、24 h組，每一時(shí)間組5只大鼠，實(shí)驗(yàn)對照組5只，共25只大鼠。飼養(yǎng)期間保持空氣流通，及時(shí)更換墊料，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，自由飲食，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

一抗c-fos抗體（ABCam，美國）,內(nèi)參β-Tubulin抗體(abclona,美國),預(yù)染蛋白 Marker(Fermentas，美國),二抗羊抗兔IgG-HRP、山羊抗小鼠IgG-HRP、凝膠配制試劑盒(博士德有限公司),SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液5X（博奧森有限公司),RIPA裂解液、PMSF(碧云天生物技術(shù)有限公司），即用型SABC-POD試劑盒、增強(qiáng)型DAB顯色劑（天根有限公司）。60 L的染毒缸（皖南醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院提供），99.9%的一氧化碳?xì)怏w（蕪湖市永泰特種氣體有限公司），一氧化碳檢測管（上海豫東電子科技有限公司）。

1.3 模型制作

中毒組參照Thom SR方法[5]制做大鼠一氧化碳中毒模型并加以改進(jìn)。將清醒大鼠放入體積為60 L的染毒罐內(nèi)，然后向罐內(nèi)注入濃度為99.9%的一氧化碳?xì)怏w。大鼠在罐內(nèi)靜式吸入3 000～4 000 ppm一氧化碳?xì)怏w30～40 min。在此期間用一氧化碳快速檢測管監(jiān)測染毒缸內(nèi)CO氣體濃度，使氣體濃度保持恒定。實(shí)驗(yàn)對照組將大鼠放入染毒缸內(nèi)30～40 min，不通入一氧化碳?xì)怏w。

1.4 組織處理

在設(shè)定的不同時(shí)間點(diǎn)將大鼠斷頭處死，取左側(cè)大腦經(jīng)預(yù)冷的生理鹽水清洗后，迅速放入-80℃冰箱冷凍備用，右側(cè)大腦放入10%的甲醛中進(jìn)行固定，以用做HE染色及免疫組織化學(xué)染色。

取出凍存?zhèn)溆玫哪X組織加入RIPA裂解液及PMSF經(jīng)勻漿、離心后，將提取的蛋白用NANOProp 2000檢測蛋白濃度確定上樣量，加入上樣緩沖液將蛋白100℃煮10 min變性，經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)后，將膠片進(jìn)行掃描，測定各組灰度值，計(jì)算其與內(nèi)參β-tubulin的比值以用做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 HE染色

將包埋好的組織蠟塊，制成5 μm厚的石蠟切片，在進(jìn)行常規(guī)的脫蠟及水化后采用蘇木素-伊紅染色制成病理切片，采用光學(xué)顯微鏡觀察病理變化。

1.6 免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片在進(jìn)行常規(guī)的脫水、透明后，用3%過氧化氫封閉非特異性抗原，采用高溫高壓修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)（2 000 mL的0.01 moL/L枸櫞酸鈉緩沖液pH 6.0，高壓鍋煮沸，放入玻片，待高壓鍋噴氣后計(jì)時(shí)3 min），c-fos抗體1∶100作為一抗，按照試劑盒提供的說明書進(jìn)行操作。觀察c-fos蛋白的表達(dá)部位及強(qiáng)度變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)中所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用x±s（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANO?VA），兩兩比較LSD法，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠中毒后表現(xiàn)

大鼠染毒約5 min時(shí)出現(xiàn)躁動(dòng)、興奮，圍染毒缸壁打轉(zhuǎn)，呼吸心跳加快。約15 min時(shí)，部分大鼠出現(xiàn)角弓反張、抽搐及聚集現(xiàn)象，后肢肌力明顯減退，少動(dòng)但能對外界的刺激給予反應(yīng)，尾尖及耳廓呈現(xiàn)櫻桃紅色。30 min時(shí)對外來的刺激無反應(yīng)，有大小便失禁現(xiàn)象，呈昏迷狀態(tài)。將大鼠放置通風(fēng)處逐漸恢復(fù)意識。對中毒死亡大鼠進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟呈櫻桃紅色且有散在出血點(diǎn)，肝臟充血明顯，血液粘稠易凝固。實(shí)驗(yàn)對照組大鼠在染毒缸內(nèi)活動(dòng)正常，呼吸均勻，解剖未發(fā)現(xiàn)明顯異常。

2.2 大腦皮質(zhì)病理學(xué)觀察

在普通HE染色觀察大鼠實(shí)驗(yàn)對照組與一氧化碳中毒3 h、6 h、12 h各時(shí)間組的組織結(jié)構(gòu)大致相同，腦組織神經(jīng)元核膜核仁清晰可辨，細(xì)胞間隙未見明顯水腫。在一氧化碳中毒24 h組中，腦組織輕度水腫，見圖1。

圖1 兩組大鼠腦組織的病理變化（HE染色，×200）

2.3 Western blotting法檢測c-fos蛋白的表達(dá)情況

與一氧化碳組比較，c-fos蛋白在對照組中表達(dá)較少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在一氧化碳中毒各時(shí)間組中c-fos蛋白表達(dá)水平隨著時(shí)間的延長呈現(xiàn)一種“雙峰”趨勢，即3 h明顯升高后，6 h略為下降，12 h再次升高達(dá)高峰，24 h降低（P＜0.05），見表1，圖2。

表1 c-fos蛋白表達(dá)灰度值(x± s，n=5）

圖2 c-fos蛋白的表達(dá)條帶

2.4 免疫組織化學(xué)法檢測c-fos表達(dá)情況

c-fos蛋白免疫組織化學(xué)染色后呈黃褐色，主要定位于神經(jīng)細(xì)胞胞漿內(nèi)，胞核中亦見有少量的表達(dá)。在實(shí)驗(yàn)對照組中大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)內(nèi)見有少量的c-fos蛋白表達(dá)，而在一氧化碳中毒組則呈強(qiáng)陽性表達(dá)，見圖3。

3 討 論

一般情況下，一氧化碳中毒是由于吸入汽車廢氣、木炭、煤塊、燃?xì)庠睢⑷加偷炔煌耆紵?，或者是在火?zāi)等環(huán)境下發(fā)生的[6-8]。一氧化碳中毒的機(jī)制主要是CO進(jìn)入機(jī)體后與血紅蛋白結(jié)合，形成碳氧血紅蛋白（HbCO），碳氧血紅蛋白不易解離釋放氧氣，故造成機(jī)體缺氧，其病理特點(diǎn)主要是組織缺氧所致的各種器官功能障礙，重則危及生命。在法醫(yī)鑒定中，一氧化碳中毒主要依靠檢測碳氧血紅蛋白的濃度及尸體的特征性征象“櫻桃紅”來進(jìn)行判定。由于碳氧血紅蛋白濃度受自身疾病、飲酒情況及CO來源的不同影響較大，給鑒定也帶來了一定的困難[9-11]。所以尋找敏感可靠的生化指標(biāo)成為法醫(yī)學(xué)者努力探索的方向。

圖3 各組腦組織免疫組織化學(xué)染色（SABC法，×400）

c-fos基因是一種參與多種細(xì)胞功能的原癌基因，也是即刻早基因家族（immediate early genes,IEG）之一，早在三十多年前就已成為研究腦組織中的早期基因，多項(xiàng)研究表明不同的刺激能誘導(dǎo)c-fos的表達(dá)[12]。c-fos基因與c-jun基因編碼的蛋白相結(jié)合，形成AP-1轉(zhuǎn)錄因子，此蛋白可作為第三信使進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而使外界刺激信號與基因表達(dá)偶聯(lián)，參與一系列的生理或病理活動(dòng)的調(diào)節(jié)[13-14]。在正常的人和大鼠的腦組織中，c-fos蛋白表達(dá)量較少，當(dāng)外界的刺激如缺氧缺血作用于大腦時(shí)，c-fos基因的表達(dá)量就會(huì)發(fā)生顯著且快速的改變[15-17]。

本實(shí)驗(yàn)在建立大鼠一氧化碳中毒模型的基礎(chǔ)上檢測c-fos蛋白在急性一氧化碳中毒后腦組織中的表達(dá)變化。一氧化碳中毒模型的建立主要有三種：靜態(tài)吸入染毒法、動(dòng)態(tài)吸入染毒法及腹腔注射染毒法。動(dòng)態(tài)吸入染毒法制備模型時(shí)吸入濃度穩(wěn)定且能較好的避免二氧化碳蓄積和缺氧的缺點(diǎn)，但其一氧化碳?xì)怏w消耗量大且不適宜小型動(dòng)物的模型制備。腹腔注射法雖能很好地控制氣體量，但與正常人體中毒方式不符，且中毒較深[18]。本實(shí)驗(yàn)采用靜態(tài)吸入染毒法制備大鼠一氧化碳中毒模型，采用一氧化碳檢測管監(jiān)測染毒缸內(nèi)一氧化碳的濃度，且染毒缸較大，可避免染毒過程中的二氧化碳蓄積及氧分壓降低對本實(shí)驗(yàn)的影響。能使大鼠在正常呼吸的情況下中毒，符合人體中毒方式。

本研究發(fā)現(xiàn)在急性一氧化碳中毒后早期腦組織病理學(xué)形態(tài)改變不明顯。在實(shí)驗(yàn)對照組c-fos蛋白有少量的表達(dá)，可能與處死時(shí)的刺激有關(guān)。而一氧化碳中毒組c-fos蛋白在腦組織表達(dá)迅速增加，3 h表達(dá)升高，6 h略為下降，12 h再次升高達(dá)高峰，24 h時(shí)下降。這可能是當(dāng)一氧化碳進(jìn)入機(jī)體，神經(jīng)系統(tǒng)缺氧而應(yīng)激性上調(diào)c-fos蛋白，從而達(dá)到對神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用。隨著時(shí)間的延長，c-fos蛋白逐漸下降，但仍高于對照組。而12 h再次升高，可能是神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)氧損傷所造成，也可能是c-fos蛋白的促凋亡作用引起的繼發(fā)性損害，有待進(jìn)一步研究。在本實(shí)驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)大鼠在輕度中毒后，后肢肌力即減退，隨著中毒程度的加深，肌力逐漸喪失，這也揭示了在中毒案件中，死者一旦中毒就很難逃離中毒現(xiàn)場，也是其死亡率高的原因。

本研究成功復(fù)制了大鼠一氧化碳中毒模型，通過模型研究證實(shí)了c-fos蛋白在一氧化碳中毒中的表達(dá)與Tang YP的研究結(jié)果一致[19]，且發(fā)現(xiàn)在一氧化碳中毒后腦組織病理未發(fā)生變化之前c-fos蛋白即開始表達(dá)并隨著時(shí)間的延長表現(xiàn)出一定的規(guī)律性,對防治一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病的發(fā)病有一定的臨床意義。c-fos蛋白表達(dá)呈現(xiàn)出較好的即時(shí)性以及時(shí)間的規(guī)律性，為急性一氧化碳中毒的法醫(yī)學(xué)鑒定和中毒時(shí)間的推斷提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。下一步研究重點(diǎn)應(yīng)著重探討c-fos蛋白在一氧化碳中毒腦損傷與其他類型的腦損傷在表達(dá)部位、強(qiáng)度及發(fā)生機(jī)制的差異性。

4 結(jié) 論

25只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)對照組及一氧化碳中毒組。Western blotting法檢測c-fos蛋白在腦組織的變化規(guī)律，免疫組織化學(xué)法觀察c-fos蛋白的表達(dá)部位。結(jié)果顯示：對照組大鼠腦組織內(nèi)有少量的c-fos蛋白表達(dá)，一氧化碳中毒組在3 h時(shí)即可觀察到c-fos蛋白的大量表達(dá)，6 h略為下降，12 h表達(dá)至高峰，之后逐漸下降，呈“雙峰”趨勢，且與實(shí)驗(yàn)對照組相比皆有差異性。提示c-fos蛋白的表達(dá)和一氧化碳中毒后經(jīng)過時(shí)間呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。