β-catenin和Dkk-3在SD大鼠頰黏膜癌變過程中的表達

段麗君，李 秀，余 麗，陳雨荷，邱燕玲，劉旭倩

(1四川省遂寧市射洪縣人民醫(yī)院口腔科，四川遂寧 629200；2西南醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院)

Dkk家族是近幾年發(fā)現(xiàn)的一類編碼分泌性糖蛋白的抑癌基因，人Dkk家族相關成員包括Dkk-1，Dkk-2，Dkk-3，Dkk-4以及被稱為Soggy的Dkk-3相關蛋白[1]。研究表明，Dkk-3在人類多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到抑制作用[2-7]。而β-catenin是一種能與20多種蛋白結合發(fā)揮多重調節(jié)功能的蛋白，它不僅是經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號途徑的核心蛋白和整條信號傳導通路的關鍵樞紐分子[8]，而且還具有介導細胞與細胞間黏附的重要功能[9]。在正常細胞膜上的β-catenin、E-鈣粘素和細胞膜上的骨架蛋白結合形成復合體，介導細胞間的粘附，當β-catenin由胞膜向胞漿或胞核轉移時，上述復合體減少，使細胞間的粘附作用降低而易脫落，使腫瘤呈現(xiàn)浸潤式生長方式。本實驗采用4-硝基喹啉-1-氧化物（4-introquinoline-1-oxide，4 NQO)誘發(fā)構建SD大鼠頰黏膜癌變模型，運用免疫組化法檢測Dkk-3和β-catenin蛋白在大鼠頰黏膜癌變過程中的表達，以探討Dkk-3與β-catenin蛋白在口腔黏膜癌變發(fā)生過程中的作用及相關關系。

1 材料和方法

1.1 材料

兔抗鼠Dkk-3多克隆抗體（美國R﹠D）；兔抗鼠β-catenin多克隆抗體（美國Abzoom）；免疫組化試劑盒SP-9000（北京中杉金橋）；HE染色試劑盒（北京諾博萊特）；即用型DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋）。

1.2 方法

1.2.1 組織標本

收集西南醫(yī)科大學口頜面修復重建和再生實驗室提供的4 NQO誘發(fā)SD大鼠口腔黏膜癌變所獲頰部病損組織。其中正常頰黏膜16例，輕度上皮異常增生11例，中度上皮異常增生12例，重度上皮異常增生10例，頰癌9例。PBS代替一抗作陰性對照。

1.2.2 標本的處理

所有蠟塊連續(xù)性切片，常規(guī)脫蠟至水，一部分進行HE染色作為組織診斷學用，另一部分進行免疫組織化學染色：①枸櫞酸鈉緩沖液加熱至96℃15 min，對組織抗原進行修復，PBS沖洗3次；②3%H2O2室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次；③切片分別滴加一抗 Dkk-3（1∶100）和β-catenin（1∶100），37 ℃濕盒內孵育1.5 h，PBS沖洗3次；④每張切片滴加1滴生物素標記的二抗（工作濃度），37℃下孵育20 min，PBS沖洗3次；⑤滴加鏈霉菌抗生物素－過氧化酶溶液，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次；⑥DAB顯色5 min左右，水洗以終止顯色反應；⑦蘇木素復染；酒精梯度上行脫水；二甲苯透明；中性樹膠封片。

1.2.3 結果判定與統(tǒng)計

Dkk-3的表達以正常上皮細胞的胞漿和胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。光鏡下，每例樣本隨機選擇10個高倍視野，Motic Medical數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)進行分析，取平均值，排除非特異性染色和邊緣效應，著色強度記分標準：無染色=0分；輕度染色=1分；中等染色=2分；重度染色=3分。陽性率（陽性率是指每例樣本Dkk-3表達的染色強度得分和陽性細胞數(shù)得分的乘積≥6的樣本數(shù)占每組總樣本數(shù)的百分率）評分標準：陽性細胞數(shù)＜10%（0分）；11%～25%（1分）；26%～49%（2分）；≥50%（3分）。染色強度與陽性率乘積為Dkk-3最后得分≥6分為陽性；＜6分判定為陰性。β-catenin以正常上皮細胞的胞膜上出現(xiàn)黃色或棕黃色的染色為陽性，如≥70%胞膜陽性表達者稱為正常表達，反之為表達減弱或缺失；≥10%胞漿或胞核陽性表達者稱為異位表達；胞膜表達減弱或缺失和異位表達統(tǒng)稱為異常表達。

1.2.4 統(tǒng)計學分析

用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，在χ2檢驗有統(tǒng)計學意義的前提下再進行兩者的Pearson相關性分析，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 病理資料分析

對所選蠟塊進行常規(guī)HE染色，由三位病理科醫(yī)生復片，對58例標本進行分組：正常頰黏膜16例；輕度上皮異常增生11例；中度上皮異常增生12例；重度上皮異常增生10例；鱗狀細胞癌9例，見圖1。

2.2 β-catenin蛋白在SD大鼠頰黏膜癌變過程中的表達

正常組棘層以上細胞膜β-catenin陽性表達，呈棕黃色顆粒，基底層著色不明顯；輕度上皮異常增生組棘層以上細胞膜陽性表達減少，部分胞質中呈淺黃色弱陽性表達；中度上皮異常增生組中多數(shù)棘層以上細胞胞漿中出現(xiàn)黃色顆粒；重度上皮異常增生組中細胞層次紊亂，胞漿陽性表達開始減少但顏色變?yōu)樽攸S色，大量胞核呈陽性；鱗癌組大量胞核陽性表達，見圖2。

圖1 大鼠正常黏膜（HE染色，×200）

圖2 β-catenin蛋白在大鼠頰黏膜的表達（Polymer，×200）

在SD大鼠頰黏膜由正常至癌變過程中β-catenin異常表達的差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=22.493，P＜0.05）（表1）。β-catenin的異常表達與病理分級程度成正相關關系（rs=0.386,P＜0.05），即認為從正常到癌變β-catenin異常表達水平逐步增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

2.3 Dkk-3蛋白在SD大鼠頰黏膜癌變過程中的表達

正常組上皮基底層和棘細胞胞漿呈陽性表達，廣泛的棕黃色顆粒，近表層細胞的胞核中出現(xiàn)少量黃色顆粒；輕度上皮異常增生組上皮基底層和棘細胞的胞漿陽性表達減少，但胞核中棕黃色顆粒增加；中度上皮異常增生組上皮的胞漿陽性表達明顯降低，僅部分細胞胞漿有淺黃色顆粒，棘層以上的細胞胞核為陽性表達，著色細胞數(shù)明顯減少，基底層幾乎無著色；重度上皮異常增生組上皮僅見極少數(shù)細胞胞核淺黃色顆粒；鱗癌組上皮細胞Dkk-3陰性表達，見圖3。

表1 β-catenin在SD大鼠正常頰黏膜至癌變各階段組織中的異常表達比較

表2 β-catenin異常表達差異與頰黏膜病理分級的相關性分析

圖3 Dkk-3在大鼠頰黏膜中表達（Polymer，×200）

由表3可見，在SD大鼠頰黏膜由正常至癌變這一動態(tài)變化過程中Dkk-3陽性表達的差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=16.113,P＜0.05）。Dkk-3的陽性表達隨著病理分級程度呈負相關關系（rs=-0.521,P＜0.05），即認為從正常到癌變Dkk-3的陽性表達水平逐步降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4。

表3 Dkk-3在SD大鼠正常頰黏膜至癌變各階段組織中的表達比較

表4 Dkk-3陽性表達差異與頰黏膜病理分級的相關性分析

3 討 論

Wnt/β-catenin信號轉導通路是最經(jīng)典的信號通路之一[10]，當這條通路被異常激活時，可導致β-catenin在胞漿中大量聚集，激活下游的c-ymc、cyclin1等原癌基因，進而導致腫瘤的發(fā)生[11]。β-catenin作為Wnt/β-catenin信號通路關鍵細胞因子最早是被當做粘附因子而發(fā)現(xiàn)的，研究表明它還是一種胞內可溶性的多功能蛋白，在細胞內以兩種形式存在：①結合型：主要位于細胞-細胞鏈接側的細胞膜上，β-catenin和E-cadherin、細胞骨架蛋白結合形成復合體，介導細胞之間的粘附，維持正常上皮細胞的極性和完整性；②游離型：主要位于胞漿中，正常情況下它與APC、GSK-3β和Axin形成的“破壞復合物”結合后，被泛素化并由蛋白水解酶降解，從而胞漿始終維持在一個幾乎被檢測不到的水平，但是如果這個復合物被破壞后，就可導致β-catenin失磷酸化，在胞漿中大量聚集，進而進入胞核啟動下游的原癌基因，介導細胞增殖和分化。β-catenin以上兩種存在形式表明，其表達異常不僅可降低細胞間的粘附性，還受Wnt/β-catenin信號通路的開關閉狀態(tài)影響，它對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著雙重推進作用。研究證實，β-catenin在胞漿和胞核中表達量的增加與腫瘤的增殖、分化和轉移密切相關[12]。本實驗顯示，β-catenin異常表達與SD大鼠的頰黏膜病理惡性程度呈負相關關系，在頰黏膜癌變過程中β-catenin的異常表達數(shù)的差異在總體上是具有統(tǒng)計學意義的（P＜0.05），可能與β-catenin由胞漿向胞核轉移后啟動了細胞核內的癌基因有關；因β-catenin隨著病理分化程度的降低在細胞膜上的表達量也降低，使細胞之間的粘附性降低，導致細胞更易脫落和侵襲下層組織。這些結果與學者顧曉荔等[13]對β-catenin在宮頸鱗癌中的表達研究相一致，同時與胡冬玉等[14]研究的β-catenin在皮膚鱗癌及癌前病變中的表達變化相吻合，提示β-catenin可能在SD大鼠口腔頰黏膜癌變過程中起促進作用。

Dkk-3是近幾年發(fā)現(xiàn)的一類編碼分泌性糖蛋白的抑癌基因，定位于人類經(jīng)常缺失的染色體11p5.1的位點上，研究發(fā)現(xiàn)Dkk-3與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉移密切相關[15-18]。本實驗對Dkk-3在SD大鼠頰粘膜癌變過程中的表達變化進行探討，結果顯示Dkk-3在大鼠正常頰黏膜高表達，表達部位與童輝等[19]對Dkk-3蛋白在乳腺癌中表達研究結果相似。本實驗中Dkk-3的陽性表達率隨著頰黏膜病理分化程度的降低而降低，在重度上皮異常增生組中Dkk-3陽性表達率僅為20﹪，表達部位與牛云霞等[20]對Dkk-3在直腸癌組織中的免疫組化染色結果相同。Dkk-3在鱗癌組表達缺失，正常組和上皮異常增生組相比，它們之間的差異在總體上是具有明顯的統(tǒng)計學意義。關于Dkk-3在正常組織和腫瘤組織中表達部位的不同，目前鮮有報道，本研究推測是因為在正常組織中Dkk-3的陽性表達量本身就很高，使絕大多數(shù)Dkk-3主要聚集在胞質中，易于從胞質中游離出來和胞膜表面的Wnt輔助性受體LRP5/6結合，抑制Wnt受體復合物形成；隨著病理分化程度的降低，Dkk-3表達的部位主要出現(xiàn)在胞核中，但是陽性表達率是顯著降低的，兩者間的相關性分析顯示Dkk-3陽性表達的差異與頰黏膜病理惡性程度呈負相關關系。Dkk-3在大鼠頰黏膜癌變過程中表達量的變化與國內外學者在腫瘤方面的研究結果基本一致。本實驗也證實了Dkk-3作為抑癌基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起抑制作用，其表達量和病理分化程度成正相關關系。以上數(shù)據(jù)提示，Dkk-3在異常增生組織和癌組織中的表達并不是完全缺失，仍然有Dkk-3陽性表達的組織會發(fā)生癌變。

本實驗同時分析了Dkk-3和β-catenin在SD大鼠頰黏膜癌變過程中表達變化的相關關系，結果顯示，Dkk-3和β-catenin在大鼠頰粘膜癌變過程中呈負性相關關系。同時證明了Dkk-3對Wnt/β-catenin信號轉導通路具有抑制作用，Dkk-3與細胞膜上的輔助性受體LRP5/6相結合，阻止Wnt蛋白和受體Frizzled及輔助性受體LRP5/6結合形成受體復合物，使得胞質內Dsh蛋白不能被活化，未活化的Dsh蛋白不能抑制糖原合成酶激酶3β（GSK3β）的活性，從而使軸蛋白（Axin）、結腸腺瘤樣息肉（APC）蛋白和β-catenin等不能形成降解復合體，胞質內的酪蛋白激酶1（CK1）和GSK3β就不能對β-catenin進行磷酸化[21-22]。未被GSK3β磷酸化的β-catenin同時也避免了被泛素連接酶E3亞基β-轉導素重復蛋白（β-TrCP）的識別和被26S蛋白酶體降解,從而在胞質中逐漸積聚，當積聚到一定閾濃度后開始向胞核轉移,并與胞核內的轉錄因子Tcf/Lef相結合，招募共同轉錄起始因子激活一系列的下游靶基因,如c-myc、cyclin1、survivin等而導致細胞異常增殖和分化。正常細胞中的Dkk-3與LRP5/6結合，關閉經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路[23]，使得胞質中游離的β-catenin維持在較低的水平。同時，在正常細胞胞膜上的β-catenin大部分與胞膜粘附蛋白E-cat等結合形成復合體參與細胞骨架的調節(jié),調節(jié)細胞之間的粘附，防止細胞脫落[24]。

4 結 論

Dkk-3能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來調節(jié)β-catenin在胞質內的表達水平，使β-catenin的異常表達量始終處于較低水平，防止下游靶基因的轉錄從而降低細胞增殖、分化，通過降低細胞脫落率降低腫瘤的轉移和侵襲能力。