轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)通路抑制劑對(duì)胚胎干細(xì)胞定向分化的影響

劉 浩 趙 燕 張 曉 張念平

(濟(jì)南市第三人民醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250032)

胚胎干細(xì)胞(ESCs)具有很強(qiáng)的自我更新能力和增殖分化能力，是細(xì)胞移植治療神經(jīng)退行性疾病和脊髓損傷比較理想的細(xì)胞來(lái)源〔1，2〕。對(duì)神經(jīng)細(xì)胞移植來(lái)說(shuō)，應(yīng)盡可能獲得足夠數(shù)量的、均一的神經(jīng)細(xì)胞亞型，避免雜細(xì)胞污染。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多關(guān)鍵細(xì)胞因子〔如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(MCT)8、音猬因子(SHH)和空通氣孔同源框(EMX)2等〕與ESCs的神經(jīng)分化相關(guān)〔3〕，但目前的誘導(dǎo)方法仍不能使所有的ESCs分化為神經(jīng)類細(xì)胞〔4，5〕。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β通過(guò)控制一系列細(xì)胞生理進(jìn)程(如細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等)來(lái)影響生物體穩(wěn)態(tài)平衡及多個(gè)器官和系統(tǒng)的發(fā)育〔6〕。近年來(lái)有大量文獻(xiàn)報(bào)道TGF-β信號(hào)通路在ESCs的多能性維持、自我更新能力維持及細(xì)胞命運(yùn)決定等方面發(fā)揮重要作用〔7～9〕。本實(shí)驗(yàn)在文獻(xiàn)報(bào)道的神經(jīng)誘導(dǎo)方法的基礎(chǔ)上，聯(lián)合使用兩種TGF-β抑制劑對(duì)ESCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化，探討TGF-β信號(hào)通路在ESCs向神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)分化過(guò)程中的作用，并觀察ESCs來(lái)源的NSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的能力。

1 材料和方法

1.1小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)制備 取妊娠13.5 d的小鼠，脫臼處死后置于75%酒精中浸泡5 min。剖腹后取出子宮，用含1%雙抗的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次。取出胎鼠并去除頭尾、四肢和內(nèi)臟，將剩余組織用PBS洗3次。以剪刀剪碎組織，加入0.25%的胰酶(碧云天公司，中國(guó))消化3～5 min，MEF培養(yǎng)基終止消化。1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入MEF培養(yǎng)基吹打均勻后移入10 cm培養(yǎng)皿，2～3 d傳代一次。取第3～4代細(xì)胞，以10 μg/ml的絲裂霉素C(Sigma-Aldrich公司，美國(guó))處理備用。MEF培養(yǎng)基：89%達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)高糖(Gibco公司，美國(guó))、10%胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，中國(guó))、1%雙抗(碧云天公司，中國(guó))。

1.2ESCs培養(yǎng) 將經(jīng)絲裂霉素C處理的MEF細(xì)胞按3×104/cm2密度接種至0.1%明膠包被的培養(yǎng)皿上，使用MEF培養(yǎng)基培養(yǎng)，24 h后細(xì)胞完全貼壁鋪展開(kāi)。將小鼠ESCs細(xì)胞(R1)接種在MEF細(xì)胞上，以ESCs培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天換液。每2～3 d將ESCs細(xì)胞連同MEF細(xì)胞以0.05%的胰酶消化，再以1.5×104/cm2的密度接種至新的MEF細(xì)胞上。ESCs培養(yǎng)基：82%DMEM高糖、15%胎牛血清(FBS，Serana公司，德國(guó))、1% 非必需氨基酸(Gibco公司，美國(guó))、0.1 mmol/L 2-巰基乙醇(廣東翁江化學(xué)試劑有限公司，中國(guó))、2 mmol/L L-谷氨酰胺(Gibco公司，美國(guó))、1 000 U/ml LIF(leukemia inhibitory Factor，PeproTech公司，美國(guó))、1% 雙抗(碧云天公司，中國(guó))。

1.3ESCs的定向分化 ESCs向NSCs誘導(dǎo)分化參考Ying等〔10〕的單層分化方法：將ESCs連同MEF消化后，差速貼壁兩次(每次30 min)，以去除MEF細(xì)胞。收集未貼壁的ESCs細(xì)胞，以(0.5～1.5)×104/cm2的密度種到0.1%明膠包被的培養(yǎng)皿中，使用N2B27培養(yǎng)基培養(yǎng)。其中實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中加TGF-β抑制劑：1 μmol/L的A83-01(MedChemExpress公司，美國(guó))和100 μg/L的Noggin(R&D Systems公司，美國(guó))，對(duì)照組不加。每2 d換液一次，培養(yǎng)9 d即可獲得NSCs。ESCs來(lái)源的NSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化：將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組來(lái)源的NSCs以(2～3)×104/cm2的密度種到多聚-D-賴氨酸包被的培養(yǎng)皿中，以分化培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d。ESCs來(lái)源的NSCs向多巴胺(DA)能神經(jīng)元誘導(dǎo)分化參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法〔4，10〕。N2B27培養(yǎng)基：DMEM/F12培養(yǎng)基中加入0.5%的N2和1%的B27(Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó))。分化培養(yǎng)基：N2B27培養(yǎng)基中加入0.2 mmol/L的L-抗壞血酸(Sigma-Aldrich公司，美國(guó))，20 ng/ml的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF，R&D Systems公司，美國(guó))與1 μmol/L的環(huán)磷酸腺苷(南京奧多福尼生物科技有限公司，中國(guó))。

1.4免疫熒光染色 吸棄培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，PBS洗一次。4%的多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次，每次5 min。吸棄上清，加5%～10%的牛血清白蛋白(BSA)封閉30 min。吸棄BSA后直接加一抗4℃過(guò)夜。第2天取出，室溫孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min。加入熒光二抗(博士德公司，中國(guó))，室溫孵育1～2 h，PBS洗3次，每次5 min。加4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)染色15 min，PBS洗3次，每次5 min。以甘油緩沖液封片，在熒光顯微鏡下觀察。一抗分別為Nestin(Santa Cruz公司，美國(guó))、β-tubulinⅢ(CST公司，美國(guó))、微管相關(guān)蛋白(MAP)2(Abcam公司，英國(guó))、酪氨酸羥化酶(TH)(CST公司，美國(guó))。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR) 以Trizol法提取總RNA，測(cè)OD值定量RNA濃度，純度和質(zhì)量好的RNA樣品OD260/OD280比值應(yīng)在1.9～2.1。將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，選β-actin為內(nèi)參基因，用熒光定量試劑盒(大連TakaRa公司，中國(guó))在ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)(相關(guān)引物見(jiàn)表1)。結(jié)果分析使用比較閾值法來(lái)檢測(cè)目的基因的相對(duì)表達(dá)量，相對(duì)表達(dá)量計(jì)算公式：RQ=2-△△CT，其中 △△CT=(CT實(shí)驗(yàn)組目的基因-CT實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因)-(CT對(duì)照組目的基因-CT對(duì)照組內(nèi)參基因)。

表1 qRT-PCR所需引物及其序列

1.6細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和計(jì)數(shù) 熒光染色以后，從至少3次獨(dú)立的分化實(shí)驗(yàn)中隨機(jī)選擇10個(gè)視野，分別對(duì)各個(gè)熒光下的細(xì)胞進(jìn)行拍照，雙標(biāo)的需要用Image-pro plus6.0軟件對(duì)圖像進(jìn)行疊加處理。DAPI核染色陽(yáng)性為總細(xì)胞數(shù)，根據(jù)熒光顏色計(jì)單標(biāo)、雙標(biāo)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。陽(yáng)性細(xì)胞率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，使用軟件SPSS18.0進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1TGF-β抑制劑對(duì)ESCs向NSCs分化的影響 ESCs經(jīng)N2B27培養(yǎng)基誘導(dǎo)9 d后，進(jìn)行NSCs標(biāo)志物Nestin的免疫熒光染色(見(jiàn)圖1)。Nestin陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色，細(xì)胞細(xì)長(zhǎng)，部分細(xì)胞呈放射狀排列。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均可見(jiàn)明顯的神經(jīng)上皮細(xì)胞形成的典型結(jié)構(gòu)──神經(jīng)花環(huán)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，對(duì)照組Nestin陽(yáng)性率(60.100%±2.900%)顯著低于實(shí)驗(yàn)組(69.600%±0.780%，P<0.01)。qRT-PCR結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組中Nestin基因的表達(dá)水平(1.803±0.296)明顯高于對(duì)照組(1.000±0.076，P<0.05)。

2.2TGF-β抑制劑對(duì)ESCs向神經(jīng)元分化的影響 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的ESCs經(jīng)單層貼壁培養(yǎng)誘導(dǎo)為NSCs后，繼續(xù)以分化培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，然后進(jìn)行β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ，神經(jīng)元早期標(biāo)志物)免疫熒光染色(圖2)。熒光顯微鏡下見(jiàn)β-tubulinⅢ陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色，胞體較NSCs明顯增大，呈梭形或橢圓形，有1～2條細(xì)長(zhǎng)突起自胞體發(fā)出。對(duì)照組β-tubulinⅢ陽(yáng)性率(26.400%±1.442%)明顯低于實(shí)驗(yàn)組(42.900%±2.961%，P<0.001)。qRT-PCR結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組β-tubulinⅢ表達(dá)量比對(duì)照組提高47.1%(P<0.001)，對(duì)照組為1.000±0.032，實(shí)驗(yàn)組為1.471±0.062。

標(biāo)尺=100 μm；下圖同圖1 ESCs在N2B27培養(yǎng)基中培養(yǎng)9 d后，進(jìn)行Nestin免疫熒光染色)

圖2 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的NSCs經(jīng)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，進(jìn)行β-tubulinⅢ免疫熒光染色

2.3TGF-β抑制劑對(duì)ESCs向DA能神經(jīng)元分化的影響 將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組來(lái)源的NSCs向DA能神經(jīng)元誘導(dǎo)分化后，進(jìn)行MAP2(成熟神經(jīng)元標(biāo)志物)和TH(DA神經(jīng)元標(biāo)志物)染色。MAP2陽(yáng)性細(xì)胞為紅色，TH陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色，MAP2和TH均為陽(yáng)性的細(xì)胞，圖片經(jīng)疊加呈現(xiàn)黃色(見(jiàn)圖3)?？梢?jiàn)TH陽(yáng)性細(xì)胞均為MAP2陽(yáng)性，而MAP2陽(yáng)性細(xì)胞僅部分為T(mén)H陽(yáng)性，這表明分化終末的成熟神經(jīng)元中只有一部分細(xì)胞是DA能神經(jīng)元。TH+/MAP2+陽(yáng)性細(xì)胞輪廓清晰，胞體大而飽滿，呈類圓形或橢圓形，發(fā)出一個(gè)或兩個(gè)細(xì)長(zhǎng)突起，部分細(xì)胞也可見(jiàn)胞體發(fā)出分支較多的樹(shù)突。對(duì)照組TH+/MAP2+陽(yáng)性率為7.100%±0.768%，實(shí)驗(yàn)組為14.000%±1.550%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。qRT-PCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)志物TH(1.353±0.045)和成熟神經(jīng)元標(biāo)志物MAP2的表達(dá)量(1.252±0.031)分別比對(duì)照組(1.000±0.052、1.000±0.014)提高35.3%(P<0.01)，25.2%(P<0.05)。

圖3 將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的NSCs向DA能神經(jīng)元誘導(dǎo)后，進(jìn)行TH、MAP2免疫熒光染色

3 討 論

脊椎動(dòng)物TGF-β超家族根據(jù)配體不同可以劃分為兩個(gè)亞家族：①TGF-β/活化素(Activin)/Nodal亞家族；②骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)/生長(zhǎng)分化因子(GDF)/苗勒管抑制物(MIS)亞家族〔6〕。TGF-β信號(hào)通路的受體包括Ⅰ型受體(也叫ALK受體)和Ⅱ型受體。在進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)時(shí)，Ⅰ型受體和Ⅱ型受體組成的復(fù)合物與TGF-β超家族的配體結(jié)合，導(dǎo)致Ⅱ型受體首先被激活，激活的Ⅱ型受體隨后磷酸化Ⅰ型受體?；罨蘑裥褪荏w又進(jìn)一步激活受體活化型Smad蛋白(R-Smads)，R-Smads與共同通路型Smad 蛋白(Co-Smad4)結(jié)合并進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄〔11〕。TGF-β超家族在細(xì)胞生長(zhǎng)遷移、增殖分化、生存凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔12，13〕，文獻(xiàn)報(bào)道同時(shí)抑制TGF-β信號(hào)通路的兩個(gè)亞家族能促進(jìn)多能性干細(xì)胞向神經(jīng)譜系分化〔14〕。

TGF-β/Activin/Nodal亞家族能維持ESCs的多能性，抑制這些信號(hào)通路可觸發(fā)ESCs分化〔15〕。BMP信號(hào)通路是BMP/GDF/MIS亞家族的一個(gè)分支，它抑制ESCs的神經(jīng)分化〔16〕。BMP-4是BMP信號(hào)通路的一個(gè)重要成員，BMP-4除了能維持ESCs的自我更新能力外，還能抑制神經(jīng)分化而促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)與中胚層分化相關(guān)的標(biāo)志物〔16，17〕。A83-01通過(guò)選擇性抑制TGF-β的Ⅰ型受體ALK5、Activin/Nodal的Ⅰ型受體ALK4和Nodal的Ⅰ型受體ALK7來(lái)阻斷TGF-β/Activin/Nodal信號(hào)通路〔18〕。而Noggin能高親和力的結(jié)合BMP2、BMP4、BMP7，阻止它們與受體結(jié)合從而促使ESCs向神經(jīng)譜系分化〔15〕。需要值得注意的是，在Ying等〔10〕的單層貼壁培養(yǎng)神經(jīng)誘導(dǎo)方法中，ESCs在N2B27培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d，就有超過(guò)60%的細(xì)胞表達(dá)Sox1(一個(gè)重要的NSCs標(biāo)志物)，這說(shuō)明絕大多數(shù)ESCs的分化命運(yùn)在早期就已經(jīng)被決定。而TGF-β信號(hào)通路在早期胚胎的神經(jīng)誘導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，神經(jīng)發(fā)育的“默認(rèn)模式”(default model)理論認(rèn)為消除TGF-β信號(hào)可使胚胎細(xì)胞獲得向神經(jīng)元分化的命運(yùn)，這個(gè)過(guò)程無(wú)須伴隨形成中、內(nèi)胚層細(xì)胞〔8〕。

本文表明經(jīng)TGF-β抑制劑處理的ESCs更容易分化為DA能神經(jīng)元。在早期大腦發(fā)育過(guò)程中，中腦DA能神經(jīng)元起源于中腦腹側(cè)中線，它的發(fā)育依賴于兩個(gè)關(guān)鍵的腦部中心(底板、峽部)所產(chǎn)生的分化信號(hào)：SHH、FGF8和Wnt-1〔19〕，其中SHH和FGF8的共同作用是神經(jīng)管中不同位置的DA能神經(jīng)元形成的充分必要條件〔20〕。BMP來(lái)源于神經(jīng)管背側(cè)，能拮抗分泌自底板的SHH，削弱SHH信號(hào)通路的作用〔21〕。當(dāng)使用抑制劑阻斷了BMP的活性后，可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)SHH的反應(yīng)性〔22〕。這可能從一方面解釋了使用TGF-β抑制劑后ESCs向DA能神經(jīng)元分化增多的原因。

本研究表明TGF-β信號(hào)通路在調(diào)控ESCs神經(jīng)分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。然而，控制ESCs神經(jīng)分化的細(xì)胞因子和信號(hào)通路繁多且復(fù)雜，還可能與TGF-β信號(hào)通路發(fā)生串話(cross talking)作用，這需要進(jìn)一步的研究。