百香果果汁對衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶、抗氧化的影響及其機(jī)制

韋家河 馮 霞 吳開慧 馮 潔 農(nóng)生斌 韋玲林 韋 妮 焦 雯 黃彥峰

(右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000)

我國老齡人口眾多，抗衰老的研究尤為重視。百香果是西番蓮科多年生木質(zhì)藤本植物果實(shí)的通稱，食用和藥用價值兼?zhèn)?，主要用于制備果汁，大量食用也不易引起毒性反?yīng)，有較高的安全邊際〔1〕。有研究表明，百香果中富含有機(jī)酸、不飽和脂肪酸和人體必需脂肪酸等，具有鎮(zhèn)靜、抗癲癇、降血糖、降血脂和抗氧化等功效〔2～5〕。本實(shí)驗(yàn)擬分析百香果果汁對衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶、抗氧化能力的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1一般資料 昆明種健康小鼠，雌雄各半，體重(25±3)g，右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供(動物生產(chǎn)許可證號：SCXK桂2012-0003)。百香果(廣西百色市售)；D-半乳糖(美國Amresco公司)；維生素C(遂成藥業(yè)股份有限公司國藥準(zhǔn)字 H4103317)?？捡R斯亮藍(lán)蛋白、一氧化氮(NO)、NO合酶(NOS)、乙酰膽堿酯酶(AChE)、丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽(GSH)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒均為南京建成生物工程研究所提供。離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；FSH-2A可調(diào)高速電動勻漿機(jī)(金壇市金南儀器廠)；電子天平〔梅特勒-托利儀器(上海)有限公司〕；電熱恒溫水溫箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)； 722 型分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；BA-6小鼠測試避暗儀、DT-6小鼠跳臺測試儀(均為成都泰盟科技有限公司生產(chǎn))。

1.2百香果汁的制備 取鮮果去皮后榨汁，再用4層紗布過濾，濾出的原汁為高濃度劑量組，用蒸餾水將原汁稀釋一倍為中濃度劑量組，再將中濃度的果汁稀釋一倍為低濃度劑量組，冰箱冷藏，用時恢復(fù)至室溫。

1.3動物分組及喂養(yǎng) 小鼠48只，雌雄各半，同室分籠喂養(yǎng)。適應(yīng)喂養(yǎng)5 d按體重隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性組、百香果高、中、低劑量組。每天下午加滿料塊及飲水，并于次日早上檢查，補(bǔ)充料塊及飲水。溫度18～22℃，相對濕度50%～70%。

1.4模型復(fù)制及給藥 臨用前將D-半乳糖配制成10%生理鹽水溶液，正常組每日腹腔注射等體積0.9%NaCl溶液，其余各組每日均按100 mg/kg腹腔注射D-半乳糖，1次/d，連續(xù)42 d。腹腔注射的同時，百香果治療組分別按高、中、低劑量，陽性組按100 mg/kg灌胃維生素C，正常組和模型組灌胃等量生理鹽水。

1.5學(xué)習(xí)記憶能力的測試

1.5.1跳臺實(shí)驗(yàn) 給藥第40天進(jìn)行跳臺實(shí)驗(yàn)，打開小鼠跳臺測試箱,把小鼠放入跳臺儀中,再通 36 V 交流電,動物受到電擊,其逃避反應(yīng)即為跳上平臺。多數(shù)動物會再次或多次跳至銅柵上,受電擊后又迅速跳回平臺,訓(xùn)練5 min,記錄每只小鼠受電擊的次數(shù)作為學(xué)習(xí)成績(EN1)。第41天,在通電下,直接將小鼠置于平臺上,記錄從小鼠放上平臺到第1次跳下的時間為潛伏期(LT);小鼠受電擊后會逃避性的跳上平臺,然后記錄5 min內(nèi)小鼠再次跳下的次數(shù)(EN2)為錯誤次數(shù)，LT和EN2共同作為記憶成績。

1.5.2避暗反應(yīng)實(shí)驗(yàn) 避暗儀暗室底部銅柵通36 V、50 Hz交流電，先把小鼠放入避暗儀反應(yīng)箱中訓(xùn)練3 min，小鼠受電擊逃往明室。測試開始時，將小鼠頭部背對洞口放入明室，進(jìn)入暗室則受到電擊，避暗儀自動記錄5 min 內(nèi)小鼠進(jìn)入暗室的次數(shù)，即為錯誤次數(shù)，首次進(jìn)入暗室的時間為避暗LT。采用多次測試法：第40天上午9∶00 開始訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)，當(dāng)日下午15∶00，次日上午9∶00 和第42天上午9∶00(訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)48 h后)分別測試3次，取平均值記錄5 min內(nèi)小鼠避暗LT和錯誤次數(shù)，以此反映小鼠的記憶能力。

1.6各臟器指數(shù)測定 各組灌胃給藥結(jié)束且完成行為學(xué)測試后，頸椎脫臼處死小鼠，在冰面上取腦、胸腺、心、肝、腎和脾，冰生理鹽水沖洗干凈后濾紙吸干，分析天平準(zhǔn)確稱量其濕重，各臟器指數(shù)=臟器濕重(mg)/體重(g)。

1.7生化指標(biāo)測定 稱重后的腦組織用冰凍生理鹽水按1∶9制備10%的組織勻漿，以3 500 r/min離心15 min后取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1百香果果汁對小鼠一般情況的影響 造模30 d后,百香果中濃度組毛色光滑,行動活躍，反應(yīng)靈敏與正常組相近，其余實(shí)驗(yàn)組毛色發(fā)黃,無光澤,皮膚松弛,行動緩慢,精神萎靡，容易抓取。

2.2各組體重比較 實(shí)驗(yàn)開始后各組體重都有所增長，但各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，第28天，模型組和百香果各濃度組較前1 w下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；第42天，模型組明顯低于正常組(P<0.01)，陽性組與百香果中濃度組明顯高于模型組(P<0.01,P<0.05)，見表1。

2.3各組臟器指數(shù)比較 與正常組比較，模型組腦、心、肝、胸腺、腎及脾指數(shù)明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，各組腦、胸腺、腎臟指數(shù)均保持較高水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，陽性組、百香果高、低濃度組心、肝指數(shù)也保持較高水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表1 各組體重比較

與模型組比較:1)P<0.01；2)P<0.05

表2 各組臟器指數(shù)比較

與正常組比較：1)P<0.01;與模型組比較：2)P<0.05,3)P<0.01

2.4各組學(xué)習(xí)記憶比較 與正常組比較，跳臺實(shí)驗(yàn)和避暗實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒MLT明顯縮短，錯誤次數(shù)明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，跳臺實(shí)驗(yàn)中百香果低濃度組LT差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，其余各組LT明顯增加，錯誤次數(shù)明顯減少(P<0.01)，避暗實(shí)驗(yàn)中，各組LT均明顯增加，錯誤次數(shù)明顯減少(均P<0.01)。見表3。

表3 各組學(xué)習(xí)記憶比較

與正常組比較:1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01

2.5各組腦組織生化指標(biāo)比較 與正常組比較，模型組CAT活力、GSH含量、SOD活性均顯著下降(P<0.01)，NO含量、NOS活力、MDA含量和AchE活性顯著上升(P<0.05，P<0.01)；與模型比較，陽性組、百香果中、低濃度組CAT活力、GSH含量和SOD活性均明顯升高(P<0.05，P<0.01)，NO含量、MDA含量和AchE活性明顯下降(P<0.05，P<0.01)，百香果高濃度組SOD 活性也顯著升高(P<0.01)，NOS活力、MDA含量和AchE活性明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表4。

表4 百香果果汁對小鼠腦組織生化指標(biāo)的影響

與正常組比較:1)P<0.05；2)P<0.01；與模型組比較:3)P<0.05；4)P<0.01

3 討 論

衰老是一種正常的生理現(xiàn)象，伴隨著一系列全身性、多方面的退行性變化。小鼠腹腔注射D-半乳糖造模方式簡便,周期較短，結(jié)果穩(wěn)定，節(jié)省時間及資金,是目前國內(nèi)應(yīng)用較多的衰老模型，被廣泛應(yīng)用于腦老化、抗衰老研究〔6，7〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與相關(guān)研究結(jié)果相近〔8，9〕。跳臺實(shí)驗(yàn)是用來評價實(shí)驗(yàn)動物學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典研究方法。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明百香果果汁對小鼠學(xué)習(xí)記憶有改善作用。

D-半乳糖致衰老模型主要通過氧化應(yīng)激積累積體內(nèi)MDA含量,降低SOD和GSH-Px的活性引起〔10〕。張常娥等〔11〕研究表明D-半乳糖致衰老的主要機(jī)制是氧自由基引起的過氧化損傷，其在體內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生超氧陰離子自由基和過氧化氫(H2O2)，對機(jī)體造成損傷。CAT、SOD和GSH都是體內(nèi)重要的抗氧化劑，可以有效降低機(jī)體活性氧類和過氧化物的生成，間接反映機(jī)體清除自由基、保護(hù)機(jī)體免受自由基損傷的能力，CAT和GSH可清除H2O2,MDA是脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物，反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化水平，代表組織氧化損傷程度〔12〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明百香果果汁夠提高機(jī)體內(nèi)各種抗氧化系統(tǒng)相關(guān)酶活性，減輕機(jī)體過氧化損傷程度從而延緩衰老。

NO是神經(jīng)傳導(dǎo)的逆信使，在學(xué)習(xí)記憶中發(fā)揮重要作用，NOS是NO產(chǎn)生的關(guān)鍵酶,兩者的水平呈正相關(guān)，NO產(chǎn)生過多則引起腦功能衰退,AchE是乙酰膽堿(Ach)的分解酶，其活力可間接反映Ach的含量和膽堿能神經(jīng)功能的情況，老年人體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的減少直接導(dǎo)致老年癡呆的形成〔13，14〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，百香果果汁能夠顯著降低腦AchE活性、NO和NOS水平，從而保護(hù)膽堿神經(jīng)功能，減輕NO對神經(jīng)細(xì)胞的毒性，起到改善小鼠學(xué)習(xí)、記憶能力的作用，其機(jī)制可能是抑制AchE活性，提高乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿M受體表達(dá)量，進(jìn)而維持腦內(nèi)乙酰膽堿水平穩(wěn)定。

綜上，百香果果汁可以改善衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，提高腦組織的抗氧化能力，有較好延緩衰老的作用，其機(jī)制可能與清除機(jī)體過多自由基、提高機(jī)體抗氧化能力、減輕NO對神經(jīng)細(xì)胞的毒性等有關(guān)。