凡納濱對(duì)蝦感染蝦肝腸胞蟲(chóng)的群體及組織間差異性分析*

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凡納濱對(duì)蝦感染蝦肝腸胞蟲(chóng)的群體及組織間差異性分析*

程?hào)|遠(yuǎn)1,2邱 亮1,2宋增磊1,2萬(wàn)曉媛1董 宣1謝國(guó)駟1黃 倢1,2①

(1. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306)

對(duì)來(lái)自河北黃驊(HH)、山東平度(PD)、江蘇吳江(WJ)和山東日照(RZ)的4個(gè)凡納濱對(duì)蝦()群體進(jìn)行了對(duì)蝦生長(zhǎng)參數(shù)測(cè)量，用TaqMan qPCR檢測(cè)了凡納濱對(duì)蝦各群體的肝胰腺組織中和RZ群體多種組織中的蝦肝腸胞蟲(chóng)數(shù)量(Amount of, EHP)。結(jié)果顯示，在主要生長(zhǎng)相關(guān)參數(shù)中，RZ群體最優(yōu)，該群體EHP載量也最低。不同群體的樣本數(shù)EHP對(duì)數(shù)直方圖的模式存在差異，HH和PD群體的EHP對(duì)數(shù)呈雙峰分布，而WJ和RZ群體的EHP對(duì)數(shù)呈單峰分布，代表EHP在不同群體中可能存在不同的傳播模式。EHP對(duì)數(shù)呈單峰分布的群體或從多峰分布的群體中分離出的高EHP對(duì)數(shù)子群體的對(duì)蝦體長(zhǎng)或體重與EHP對(duì)數(shù)呈顯著的負(fù)相關(guān)。RZ群體中，各個(gè)體不同組織中EHP從高到低的順序依次是肝胰腺>中腸>血淋巴>鰓>肌肉。肝胰腺、中腸和鰓3個(gè)組織中EHP對(duì)數(shù)相互間的相關(guān)性為99.9%的極顯著水平(<0.001)；除了中腸與血淋巴和肝胰腺與血淋巴以外，其余組織間EHP對(duì)數(shù)的相關(guān)性也達(dá)到極顯著(<0.01)或顯著(<0.05)水平。用DIG標(biāo)記的EHP探針對(duì)肝胰腺、肌肉、鰓、腸道組織的原位雜交顯示，肝胰腺是主要的EHP感染組織，其他組織中雜交信號(hào)較弱，但各組織中有少數(shù)細(xì)胞的EHP易感。

凡納濱對(duì)蝦；蝦肝腸胞蟲(chóng)；生長(zhǎng)參數(shù)；原位雜交

蝦肝腸胞蟲(chóng)(, EHP)是泰國(guó)Tourtip等(2009)描述的微孢子蟲(chóng)新種，屬于真菌界(Fungi)、微孢子蟲(chóng)門(mén)(Microsporidia)、單倍期綱(Haplophasea)、壺孢目(Chytridiopsida)、腸胞蟲(chóng)科(Enterocytozoonidae)、腸胞蟲(chóng)屬() (魯興萌等, 1999; Samtom, 2001; Tang, 2015)，嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生(Lom, 2002; Phelps, 2007)。自2003年以來(lái)，泰國(guó)養(yǎng)殖斑節(jié)對(duì)蝦()出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢綜合征(MSGS)，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(Chayaburakul, 2004)。Tourtip等(2009)在生長(zhǎng)緩慢的斑節(jié)對(duì)蝦肝胰腺中檢測(cè)到EHP，但感染EHP在組織病理學(xué)上難以診斷，重度感染的對(duì)蝦肝胰腺在常規(guī)的蘇木精-伊紅染色下，很難觀察到特征性的病理變化，而通過(guò)原位雜交則能顯示凡納濱對(duì)蝦()感染EHP后，其肝胰腺小管上皮細(xì)胞中存在明顯雜交信號(hào)(Tang, 2015)。感染EHP的凡納濱對(duì)蝦肝胰腺、糞便及養(yǎng)殖對(duì)蝦水體能經(jīng)PCR檢測(cè)檢出EHP陽(yáng)性(Han, 2016; Tang, 2016; Rajendran, 2016)，其肝胰腺、鰓、血淋巴、腸、心臟、肌肉組織也均可檢測(cè)到EHP陽(yáng)性(Han, 2016; Santhoshkumar, 2016; 駱云慧等, 2016)，但不同組織中EHP載量的差異及相互關(guān)系還不明確。

中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所海水養(yǎng)殖生物疾病控制與分子病理學(xué)研究室檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在我國(guó)養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦中，自2013年起有很高的EHP陽(yáng)性率，劉珍等(2016)建立了EHP的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法。對(duì)3批凡納濱對(duì)蝦樣品檢測(cè)表明，EHP與對(duì)蝦生長(zhǎng)率呈一定的負(fù)相關(guān)關(guān)系，肝胰腺中EHP在103copies/ng DNA以上可能代表較高的風(fēng)險(xiǎn)。而EHP載量較低時(shí)，則EHP感染與對(duì)蝦生長(zhǎng)的相關(guān)性尚不明確。目前，對(duì)EHP的檢測(cè)多以肝胰腺為目標(biāo)組織，其他組織EHP檢測(cè)有效性不明。因此，本研究對(duì)不同自然感染的凡納濱對(duì)蝦群體的EHP與生長(zhǎng)相關(guān)性開(kāi)展進(jìn)一步研究，并對(duì)不同組織EHP載量的差異進(jìn)行定量檢測(cè)和原位雜交驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源

于2016年6月26日、7月20日、9月14日和9月20日自河北黃驊(HH)、山東平度(PD)、江蘇吳江(WJ)和山東日照(RZ) 4個(gè)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)分別采集放苗養(yǎng)殖40~80 d的凡納濱對(duì)蝦樣品共274尾(表1)。其中，HH群體養(yǎng)殖時(shí)間為54 d，PD群體養(yǎng)殖時(shí)間為60 d，WJ群體養(yǎng)殖時(shí)間為40 d，3個(gè)群體均表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢，個(gè)體差異較大；RZ群體養(yǎng)殖時(shí)間為80 d，在4個(gè)群體中養(yǎng)殖期最長(zhǎng)，生長(zhǎng)接近正常。

上述HH、PD和WJ群體樣品為現(xiàn)場(chǎng)取樣，保存于3倍體積的95%乙醇中，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行體長(zhǎng)()和體重()測(cè)量。RZ群體凡納濱對(duì)蝦裝于塑料袋中，充純氧后運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)暫養(yǎng)后，抽取對(duì)蝦血淋巴至1.5 ml離心管中，置于–80℃冰箱中保存。將對(duì)蝦沿中線剖為兩半，一半用置于Davideson’s AFA固定液(Bell, 1998)中固定24 h，再保存于70%乙醇中；另一半分別取凡納濱對(duì)蝦的整個(gè)肝胰腺、中腸、第1腹節(jié)肌肉、鰓絲，置于1.5 ml離心管中，于–80 ℃冰箱保存。

1.2 群體生長(zhǎng)相關(guān)參數(shù)計(jì)算方法

為了對(duì)不同放苗時(shí)間的各群體進(jìn)行生長(zhǎng)比較，根據(jù)各群體放苗后的養(yǎng)殖天數(shù)()，假定放苗時(shí)平均體長(zhǎng)(L)為1 cm，并用體重指數(shù)=×–3的關(guān)系估計(jì)放苗時(shí)平均體重(W)，推算各群體的體長(zhǎng)日增長(zhǎng)率(Daily growth rate of length, DGL, %/d)和體重的日增長(zhǎng)率(Daily growth rate of weight, DGW, %/d)。公式如下：

DGL = (–L)/(L′)×100%

DGW = (–W)/(W′)×100%

1.3 樣品核酸提取

將乙醇保存的樣品倒去乙醇，用無(wú)RNase水沖洗后充分研磨；–80℃冰箱保存的樣品置于冰上融化后充分研磨。取30 mg研磨勻漿液，用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司, 北京)提取DNA。用核酸分析儀(Nanodrop 2000c, Thermo Scientific)進(jìn)行濃度測(cè)定，于–20℃冰箱保存。

1.4 EHP定量標(biāo)準(zhǔn)制備

取實(shí)驗(yàn)室制備的EHP標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒菌株(Liu, 2017)，接種到1 ml LB液體培養(yǎng)基中(含氨芐青霉素100 μg/ml)，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4~5 h，再按1%的量接種到5 ml LB培養(yǎng)基。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，200 r/min揺瓶培養(yǎng)約12 h。取4 ml培養(yǎng)液，用Mini BEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0(TaKaRa, 大連)質(zhì)粒小提試劑盒按說(shuō)明書(shū)方法提取質(zhì)粒，所提取質(zhì)粒溶解在50 μl Elution Buffer中。用核酸分析儀(Nanodrop 2000c, Thermo)測(cè)定提取質(zhì)粒樣品的核酸濃度，計(jì)算質(zhì)粒拷貝數(shù)。按10倍梯度稀釋成108~ 100copies/μl的梯度作為Man qPCR標(biāo)準(zhǔn)品。

表1 對(duì)蝦群體樣品采集信息

Tab.1 The sampling information of shrimp populations

1.5 EHP的TaqMan qPCR檢測(cè)

采用Liu等(2017)建立的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法進(jìn)行EHP定量檢測(cè)。定量所用引物和探針序列分別為F168 (5￠-AGT AAA CTA TGC CGA CAA-3￠)、R168 (5￠- GCG TTG AGT TAA ATT AAG C -3￠)和TaqMan探針(5￠-FAM-TCC TGG TAG TGT CCT TCC GT-TAMRA-3￠)。引物和探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)體系為20 μl包含10 μl 2× Premix Ex? Probe qPCR體系(TaKaRa, 大連)，0.8 μl 10 μmol/L引物F186，0.8 μl 10 μmol/L引物R186，0.4 μl 10 μmol/LMan探針，7 μl無(wú)RNase水，1 μl模板DNA。擴(kuò)增反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(CFX96, BIO-Rad)中進(jìn)行，反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 30 s預(yù)變性后，95℃ 5 s和60℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)后終止反應(yīng)。

1.6 EHP原位雜交用DIG探針制備

根據(jù)GenBank中的EHP SSU rDNA (KF362129)序列，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)了原位雜交探針合成引物，Probe-F (5￠-AGC CAT TGA GTT TGT TGA-3￠)和Probe-R (5￠-TTT CGC CTC CGT TG-3￠)，引物序列送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物為144 bp。在50 μl反應(yīng)體系中，包含0.25 μl Exversion 2.0 (TaKaRa, 大連)，5 μl 10×Buffer (TaKaRa，大連)，3 μl 20 mmol/L MgCl2, 5 μl DIG-dNTP Mix (Roche, 上海)，2 μl 10 μmol/L引物Probe-F，2 μl 10 μmol/L引物Probe-R，31.75 μl無(wú)RNase水，1 μl DNA模板。反應(yīng)在94℃預(yù)變性2 min后，于94℃ 30 s，47℃ 30 s，72℃ 30 s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃ 2 min延伸。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 原位雜交

原位雜交基本按照Bruce等(1993)的方法進(jìn)行。Davidson’s AFA固定后的組織樣品經(jīng)脫水、透明和石蠟包埋，制備4 μm石蠟切片，于65℃烘片4 h，切片復(fù)水處理，經(jīng)10 μg/ml蛋白酶K于37℃消化30 min，再經(jīng)0.4%預(yù)冷的甲醛固定5 min。于42℃進(jìn)行預(yù)雜交30 min，與DIG標(biāo)記探針于42℃雜交12 h，經(jīng)漂洗和封閉后，用1∶1000堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗DIG抗體(Roche，上海)于37℃反應(yīng)30 min，再經(jīng)漂洗后，用NBT/BCIP避光顯色2~3 h，終止后用0.5% Bismarck Brown Y復(fù)染，經(jīng)脫水、透明和封片，在顯微鏡下觀察。

1.8 數(shù)據(jù)分析

相關(guān)性分析采用Microsoft Excel的數(shù)據(jù)分析加載項(xiàng)計(jì)算數(shù)據(jù)間相關(guān)系數(shù)()，根據(jù)不同樣本數(shù)和不同顯著性水平的相關(guān)系數(shù)臨界值，判斷相關(guān)性的顯著性水平。未特別注明的，以<0.05為顯著差異水平，以<0.01為差異極顯著水平。

2 結(jié)果

2.1 凡納濱對(duì)蝦群體生長(zhǎng)特征

對(duì)各群體進(jìn)行體長(zhǎng)和體重測(cè)量(表2)。4個(gè)群體體長(zhǎng)差異從大到小依次為PD>HH>RZ>WJ，體長(zhǎng)日增長(zhǎng)率從小到大依次為WJ0.05)。從體重測(cè)量數(shù)據(jù)來(lái)看，4個(gè)群體體重差異從大到小依次為RZ>PD>HH>WJ，體重日增長(zhǎng)率從小到大依次為WJPD>HH> RZ。

表2 對(duì)蝦群體樣品生物學(xué)信息

Tab.2 The biological information of samples from shrimp populations

注：標(biāo)注不同小寫(xiě)字母表示顯著差異（<0.05）

Note: Data in the same line marked with different lowercases means significant difference (<0.05)

2.2 不同群體中EHP的TaqMan qPCR檢測(cè)

對(duì)4個(gè)凡納濱對(duì)蝦群體樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)。結(jié)果顯示，4個(gè)凡納濱對(duì)蝦群體樣品肝胰腺中EHP載量和陽(yáng)性率各不相同(表3)。HH群體陽(yáng)性檢出率為77.8%，考慮到qPCR的靈敏度，將陰性樣品的EHP對(duì)數(shù)值歸零，得4個(gè)群體中陽(yáng)性率從高到低順序分別為WJ>RZ>PD>HH，總平均EHP對(duì)數(shù)從高到低的順序是PD~WJ>HH~RZ，其中，PD與WJ無(wú)顯著差異，HH和RZ無(wú)顯著差異，PD、WJ群體與HH、RZ群間差異顯著。

2.3 各群體EHP的分布特征

對(duì)4個(gè)群體EHP對(duì)數(shù)的分布進(jìn)行分析(圖1)。結(jié)果顯示，HH群體的EHP對(duì)數(shù)分布為0.11~3.42，呈近正態(tài)分布，但在分布中的值為2.0~2.4范圍內(nèi)的數(shù)量降低，其分布呈2個(gè)有所重疊的雙峰狀態(tài)(圖1a)；PD群體的陽(yáng)性樣本的EHP對(duì)數(shù)分布為0.88~5.88，但分布峰值為0.8~2.8和3.2~6.0 2個(gè)完全分離的區(qū)域 (圖1b)；WJ群體的陽(yáng)性樣本的EHP對(duì)數(shù)分布在0.52~ 4.40范圍，為標(biāo)準(zhǔn)的正態(tài)分布，在2.8~3.2位置呈單峰值(圖1c)；RZ群體陽(yáng)性樣本的EHP對(duì)數(shù)分布為0.19~ 2.62，呈類(lèi)泊松分布，峰值位于0.4~0.8位置(圖1d)。從主要樣本的EHP分布范圍的寬度來(lái)看，PD>HH> RZ>WJ，WJ和RZ群體中，各個(gè)體的EHP感染水平較為接近，而PD和HH群體中，各個(gè)體的EHP感染水平差異大。

表3 4個(gè)養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦群體中肝胰腺EHP檢出情況

Tab.3 EHP detection in hepatopancreas from 4 populations of farmed L. vannamei

EHP指每ng組織總DNA中EHP SSU rDNA拷貝數(shù)，下表同

EHP means copies of EHP SSU rDNA per ng tissue total DNA, the same as below

圖1 各群體感染EHP水平的分布

a：黃驊群體；b：平度群體；c：吳江群體；d：日照群體。

EHP指每ng組織總DNA中EHP SSU rDNA拷貝數(shù)?；疑綁K為實(shí)際樣本數(shù)統(tǒng)計(jì)，黑色虛線為分布趨勢(shì) a: HH; b: PD; c: WJ; d: RZ.

EHP means copies of EHP SSU rDNA per ng tissue total DNA, the same as below. Gray blocks are based on actual statistics, while dotted black lines show distribution trends

2.4 不同群體EHP與生長(zhǎng)參數(shù)的相關(guān)性

分別對(duì)4個(gè)群體凡納濱對(duì)蝦肝胰腺EHP對(duì)數(shù)與對(duì)蝦的體長(zhǎng)、體重和體重指數(shù)等生長(zhǎng)參數(shù)進(jìn)行線性相關(guān)性分析(表4)。

HH群體樣品數(shù)量=54，顯著相關(guān)0.05=±0.268，EHP對(duì)數(shù)與體長(zhǎng)、體重和體重指數(shù)的相關(guān)性均無(wú)95%的顯著性意義，其中，EHP對(duì)數(shù)與體重指數(shù)=0.2155，介于0.2=0.177和0.1=0.226之間，達(dá)到80%顯著性水平。根據(jù)該群體EHP雙峰分布，將其分為EHP低的子群HH1 (=32)和EHP高的子群HH2 (=22)，HH2的EHP對(duì)數(shù)與體長(zhǎng)和體重的相關(guān)系數(shù)分別為-0.452和-0.517，均達(dá)到了顯著相關(guān)水平(0.05=0.423，<0.05) (圖2a和圖2b)。

PD群體樣品數(shù)量=42，顯著相關(guān)0.05=±0.304，EHP對(duì)數(shù)與體長(zhǎng)、體重和體重指數(shù)均無(wú)顯著相關(guān)，其中，EHP對(duì)數(shù)與體長(zhǎng)和體重相關(guān)系數(shù)分別為–0.2174和–0.2280，介于0.1=–0.257和0.2=–0.202之間，負(fù)相關(guān)性具有80%顯著性水平(<0.01)。根據(jù)該群體EHP雙峰分布，將該群體分為EHP低的子群PD1 (=22)和EHP高的子群PD2 (=20)，PD2的EHP對(duì)數(shù)與體長(zhǎng)和體重的相關(guān)系數(shù)分別為–0.377和–0.467，體重相關(guān)性達(dá)到0.05=–0.444的95%顯著性水平(<0.05)，體長(zhǎng)相關(guān)性接近90%顯著性水平(圖2c和圖2d)。

WJ群體樣品數(shù)量=132，顯著相關(guān)0.05=±0.171，EHP對(duì)數(shù)與3個(gè)生長(zhǎng)指數(shù)的相關(guān)系數(shù)均未達(dá)到95%的顯著性水平(>0.05)，其中，EHP對(duì)數(shù)與體重的相關(guān)系數(shù)=–0.1635<0.1=–0.144，具有90%的顯著性水平(<0.01)(圖2e和圖2f)。

RZ群體樣品數(shù)量=48，顯著相關(guān)0.05=±0.285，其中，EHP對(duì)數(shù)與對(duì)蝦體長(zhǎng)=–0.2949，表明該群體的EHP與體長(zhǎng)存在顯著負(fù)相關(guān)性(<0.05)，EHP與體重的相關(guān)系數(shù)為=–0.2782<0.1=–0.240，負(fù)相關(guān)性具有90%的顯著性水平(<0.01)，EHP與體重指數(shù)的系數(shù)=–0.1909<0.2=–0.188，負(fù)相關(guān)性具有80%的顯著性水平(<0.2)(圖2g和圖2h)。

2.5 不同組織中EHP的TaqMan qPCR檢測(cè)

分別對(duì)RZ群體樣品的肝胰腺、腸道、肌肉、血淋巴和鰓5種組織進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，該群體5種組織中EHP載量各不相同，且5種組織中EHP陽(yáng)性率也有差異(表5)。其中，肝胰腺的EHP最高，陽(yáng)性率也最高；其次是中腸，EHP對(duì)數(shù)是肝胰腺的84.1%；再次是血淋巴，EHP對(duì)數(shù)是肝胰腺的76.2%；鰓EHP對(duì)數(shù)是肝胰腺的62.7%，其陽(yáng)性率最低；肌肉的EHP對(duì)數(shù)是肝胰腺的15.1%。

2.6 不同組織間EHP載量的關(guān)系

對(duì)RZ群體各個(gè)體的5種組織中的EHP對(duì)數(shù)進(jìn)行組織間的相關(guān)性分析(表6)。根據(jù)RZ群體的48個(gè)樣品，確定95.0%、99.0%、99.5%和99.9%的顯著性水平的相關(guān)系數(shù)0.05分別為0.285、0.368、0.399和0.460。相關(guān)性分析表明，不同組織之間的EHP均有正相關(guān)趨勢(shì)，從值大小來(lái)判斷，肝胰腺、中腸和鰓3種組織相互之間的EHP對(duì)數(shù)相關(guān)性最強(qiáng)，超過(guò)99.9%的顯著性水平，其他依次為腸道與肌肉、鰓與肌肉、肝胰腺與肌肉、肌肉與血淋巴、腸道與血淋巴等組織之間的EHP對(duì)數(shù)，這些均有極顯著相關(guān)性；肝胰腺與血淋巴和鰓與血淋巴的EHP對(duì)數(shù)的相關(guān)性沒(méi)有達(dá)到95.0%的顯著性水平。

表4 4個(gè)養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦群體中肝胰腺EHP與生長(zhǎng)指標(biāo)的相關(guān)性分析

Tab.4 Correlation analysis between EHP in hepatopancreas and growth indexes of 4 populations of farmed L. vannamei

注：標(biāo)注0.02的數(shù)據(jù)表示有98%的顯著相關(guān)性(<0.02)，標(biāo)注0.05的數(shù)據(jù)表示有95%的顯著相關(guān)性(<0.05)，標(biāo)注0.1的數(shù)據(jù)表示相關(guān)的顯著性水平達(dá)到90% (<0.1)，未標(biāo)注數(shù)據(jù)表示無(wú)顯著性差異(>0.1)

Note: Data marked with 0.02 means 98% significant relationship (>0.02); data marked with 0.05 means 95% significant relationship (>0.05); data marked with 0.1 means 90% significant relationship (<0.1); data without superscript means no significant relationship (>0.1)

圖2 4個(gè)養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦群體中肝胰腺EHP與體長(zhǎng)和體重的相關(guān)性

a，b：HH群體；c，d：PD群體；e，f：WJ群體；g，h：RZ群體；標(biāo)注*為95%顯著相關(guān)性(<0.05)

a, b: Population HH; c, d: Population PD; e, f: Population WJ; g, h: Population RZ; Data marked with * means 95% significant correlation (<0.05)

表5 RZ群體凡納濱對(duì)蝦各組織中EHP載量和陽(yáng)性率

Tab.5 The detection of EHP from the tissuse of RZ population of L. vannanmei

表6 不同組織EHP對(duì)數(shù)間的相關(guān)性

Tab.6 Relationship of logarithmic EHP between different tissues

注：標(biāo)注0.001的數(shù)據(jù)表示有99.9%的極顯著相關(guān)性(<0.001)，標(biāo)注0.005的數(shù)據(jù)表示有99.5%的極顯著相關(guān)性(<0.005)，標(biāo)注0.01的數(shù)據(jù)表示有99.0%的極顯著相關(guān)性(<0.01)，標(biāo)注0.05的數(shù)據(jù)表示有95.0%的顯著相關(guān)性(<0.05)

Note: Data marked with 0.001 means 99.9% highly significant relationship (<0.001); data marked with 0.005 means 99.5% highly significant relationship (<0.005); data marked with 0.01 means 99.0% highly significant relationship (<0.01); data marked with 0.05 means 95.0% significant relationship (<0.05)

2.7 不同組織中EHP的感染情況

取RZ群體不同組織進(jìn)行原位雜交。結(jié)果顯示，EHP陰性樣品沒(méi)有雜交信號(hào)，EHP陽(yáng)性樣品表現(xiàn)出雜交信號(hào)，對(duì)照樣品沒(méi)有出現(xiàn)任何雜交信號(hào)，表明所用的EHP探針雜交特異性良好。肝胰腺、肌肉、鰓、中腸中均可觀察到雜交信號(hào)，在這些組織中，肝胰腺組織切片雜交信號(hào)最多且較強(qiáng)，視野中大約5%~10%的細(xì)胞呈現(xiàn)陽(yáng)性；肌肉和鰓組織中雜交信號(hào)較少且較弱；腸道中僅在中腸部位觀察到雜交信號(hào)，中腸內(nèi) 容物的雜交信號(hào)強(qiáng)，中腸上皮細(xì)胞內(nèi)的雜交信號(hào)弱(圖3)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)蝦肝腸胞蟲(chóng)與凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)的相關(guān)性已經(jīng)有相關(guān)研究。結(jié)果顯示，EHP在103copies/ng HPDNA以上時(shí)，表現(xiàn)出較高的風(fēng)險(xiǎn)水平，且與對(duì)蝦的生物學(xué)生長(zhǎng)呈現(xiàn)一定的負(fù)相關(guān)性，但在較低的差異范圍內(nèi)，EHP與凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)的相關(guān)性不顯著。本研究分別從河北黃驊、山東平度、江蘇吳江和山東日照采集到4個(gè)凡納濱對(duì)蝦群體，其中，在生長(zhǎng)相關(guān)各參數(shù)上RZ群體最優(yōu)。qPCR測(cè)定表明，RZ群體肝胰腺EHP也是最低的。對(duì)EHP對(duì)數(shù)的分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)表明，WJ、RZ群體的EHP對(duì)數(shù)分布為單峰，各個(gè)體的EHP載量接近；而HH、PD群體分布為雙峰，各個(gè)體的EHP載量差異大。這種分布可能提示W(wǎng)J、RZ群體主要是單一感染，而HH、PD群體可能存在群體內(nèi)2次或多次傳播。對(duì)群內(nèi)EHP與凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)參數(shù)的相關(guān)性分析表明，RZ群體的肝胰腺EHP對(duì)數(shù)與對(duì)蝦體長(zhǎng)呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)性(<0.05)，與對(duì)蝦體重也呈較顯著的負(fù)相關(guān)性(<0.1)，WJ群體的EHP對(duì)數(shù)與體重呈現(xiàn)較顯著的負(fù)相關(guān)性(<0.1)，而HH和PD群體整體上EHP對(duì)數(shù)與對(duì)蝦生長(zhǎng)參數(shù)的相關(guān)性均未達(dá)到顯著水平；但根據(jù)EHP對(duì)數(shù)的分布將HH和PD群體各分為EHP低和高的2個(gè)子群后，EHP高的子群中與對(duì)蝦體長(zhǎng)或體重間出現(xiàn)了顯著或較顯著的相關(guān)性。上述結(jié)果說(shuō)明，EHP對(duì)數(shù)與對(duì)蝦生長(zhǎng)參數(shù)的相關(guān)性與EHP感染的時(shí)間點(diǎn)有重要關(guān)系，這可以解釋前期研究中某些群體的EHP與對(duì)蝦生長(zhǎng)參數(shù)呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)性，但另一些群體中沒(méi)有明顯相關(guān)性的現(xiàn)象(劉珍等, 2016; 劉亞梅等, 2017; 劉寶彬等, 2017)，EHP感染主要發(fā)生在較相近的時(shí)間點(diǎn)時(shí)，這種負(fù)相關(guān)性才能較明顯；群體中存在2次傳播或感染在不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)，后續(xù)感染可能就擾亂了這種相關(guān)性。

本研究對(duì)凡納濱對(duì)蝦不同組織進(jìn)行EHP檢測(cè)，RZ群體是4個(gè)群體中EHP載量最低，但陽(yáng)性率較高的群體，個(gè)體間肝胰腺EHP載量比較接近，這可能是由于該群體受到較低水平EHP傳染源的感染所致，如經(jīng)水體傳播的EHP孢子的感染，該群體有利于對(duì)不同組織間的EHP進(jìn)行分析。qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，EHP從高到低的順序依次是肝胰腺>中腸>血淋巴> 鰓>肌肉；而檢出率高低順序在肌肉和鰓略有差異。經(jīng)相關(guān)性分析表明，各組織EHP對(duì)數(shù)總體上有正相關(guān)性，肝胰腺、腸道和鰓三者之間的相關(guān)性達(dá)到99.9%的極顯著水平(<0.001)，肌肉-鰓、肝胰腺-肌肉、肌肉-血淋巴、腸道-血淋巴等組織間也呈極顯著相關(guān)性(<0.01)。這顯示EHP主要感染的組織可能是肝胰腺和腸道，用血淋巴、鰓或肌肉進(jìn)行定量或定性檢測(cè)，能一定程度地反映肝胰腺中的EHP感染情況，但在感染水平較低時(shí)，可能存在較多的假陽(yáng)性比率。Santhoshkumar等(2016)、Salachan等(2017)研究表明，用常規(guī)PCR在對(duì)蝦肝胰腺、鰓、血淋巴、腸、心臟、肌肉組織均可檢測(cè)到EHP陽(yáng)性，但這些研究未揭示不同組織間EHP載量的關(guān)系及陽(yáng)性率的高低。

圖3 感染蝦肝腸胞蟲(chóng)凡納濱對(duì)蝦不同組織的原位雜交

a：肝胰腺；b：鰓；c：肌肉；d；中腸；e：肝胰腺陰性對(duì)照

a: Hepatopancreas; b: Gills; c: Muscle; d: Midgut; e: Negative control of hepatopancreas

前人在組織病理學(xué)觀察及原位雜交的研究表明，肝胰腺和腸道中能觀察到EHP的感染(Tang, 2015; Rajendran, 2016; Santhoshkumar, 2016)，但在其他組織上未觀察到感染的證據(jù)。為了說(shuō)明EHP在不同組織中的檢出是屬于污染還是組織內(nèi)的感染，作者對(duì)RZ群體的不同組織進(jìn)行了原位雜交檢測(cè)，結(jié)果顯示，RZ群體中較低的EHP感染水平下，對(duì)蝦肝胰腺中的雜交信號(hào)比以往報(bào)道中所看到的(Tang, 2015, Salachan, 2007)數(shù)量要少得多，大約5%~10%的細(xì)胞顯示為陽(yáng)性，但在所檢測(cè)的幾種組織中是最多的；中腸的原位雜交結(jié)果則顯示，腸腔內(nèi)容物中出現(xiàn)出較強(qiáng)的雜交信號(hào)，中腸上皮細(xì)胞中也出現(xiàn)較弱的雜交信號(hào)；此外，在鰓和肌肉細(xì)胞中也觀察到少量雜交信號(hào)，但信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)較弱。這說(shuō)明EHP可能造成肝胰腺以外的組織感染，但細(xì)胞感染率和感染強(qiáng)度低。

本研究通過(guò)qPCR獲得了EHP在凡納濱對(duì)蝦不同群體和不同組織中感染量的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。群體內(nèi)EHP載量的分布特點(diǎn)表示，EHP在群體內(nèi)可能存在2次或多次傳播，群體中EHP感染發(fā)生在較相近的時(shí)間點(diǎn)時(shí)，其量與凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)參數(shù)呈顯著的負(fù)相關(guān)性。EHP能在多組織中檢出，各組織EHP載量有顯著相關(guān)性，其中，肝胰腺和中腸中分布最多，肝胰腺是EHP檢測(cè)的最靈敏組織；原位雜交顯示，EHP在其他組織中的存在是因?yàn)樵谄渌M織中存在一定水平的感染，中腸內(nèi)容物中存在原位雜交信號(hào)，表明EHP可能通過(guò)糞便進(jìn)行傳播，糞便也可作為檢測(cè)的樣品。EHP在對(duì)蝦群體和體內(nèi)的感染和分布情況能為該病的診斷和預(yù)防研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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(編輯 陳嚴(yán))

Differences Between Populations and Tissues ofInfected with

CHENG Dongyuan1,2, QIU Liang1,2, SONG Zenglei1,2, WAN Xiaoyuan1, DONG Xuan1, XIE Guosi1, HUANG Jie1,2①

(1. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao); Key Laboratory of Maricultural Organism Disease Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Qingdao Key Laboratory of Mariculture Epidemiology and Biosecurity; Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 2. College of Fisheries and Life Science,Shanghai Ocean University, Shanghai 201306)

Growth-related parameters of individuals from four populations offrom Huanghua of Heibei Province (HH), Pingdu of Shandong Province (PD), Wujiang of Jiangsu Province (WJ), and Rizhao of Shandong Province (RZ) were assessed. Amount of(EHP) in the hepatopancreas of individuals from all populations and EHP in multiple tissues of shrimp from the RZ population were assessed withMan-based quantitative PCR. The results showed that the RZ population possessed optimal growth-related parameters and the lowest EHP among the four populations. The histograms of case-logarithmic EHPs of the four populations presented different modes. The case distribution of logarithmic EHPs from the HH and PD populations showed double peaks, while those of the WJ and RZ populations showed a single peak. The different distribution modes may indicate a different EHP spread in the four populations. The population with a single peak mode or the higher logarithmic EHP subpopulation isolated from the population with a multiple peak mode showed a significant negative correlation with shrimp body length or body weight to logarithmic EHP. The EHP detected in different tissues of the RZ population followed the order (from highest to lowest), EHP in hepatopancreas > EHP in midgut > EHP in hemolymph > EHP in gills > EHP in muscle. The logarithmic EHP in the hepatopancreas–midgut, hepatopancreas–gills, and midgut–gills had a significant correlation level above 99.9% (<0.001), while the logarithmic EHP of the other two tissues had a significant correlation level above 99.0% (<0.01) or above 99.5% (<0.05), except for midgut–hemolymph and hepatopancreas–hemolymph.hybridization of a DIG-labeled EHP probe in the hepatopancreas, muscle, gills, and midgut showed that the hepatopancreas is the major target tissue of EHP infection in shrimp. Minor and weak hybridization signals were also observed in other tissues, which indicated that a few cells in those tissues were also susceptible to EHP infection in.

;; Growth parameters;hybridization

HUANG Jie, E-mail: huangjie@ysfri.ac.cn

10.19663/j.issn2095-9869.20170426001

S945

A

2095-9869(2018)04-0083-10

* 中國(guó)東盟海上合作基金項(xiàng)目(2016-2018)、青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室鰲山科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2015ASKJ02)、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-47)、948計(jì)劃(2016-X56)和山東省泰山學(xué)者建設(shè)工程專(zhuān)項(xiàng)共同資助 [This work was supported by China ASEAN Maritime Cooperation Fund Project (2016-2018), Project of the Aoshan Science and Technology Innovation Program of Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology (2015ASKJ02), China Agriculture Research System (CARS-47), 948 Program (2016-X56), and the Construction Programme for Distinguished Taishan Scholars of Shandong Province of China]. 程?hào)|遠(yuǎn)：E-mail: cheng_dong_yuan@163.com

黃 倢?zhuān)芯繂T，E-mail: huangjie@ysfri.ac.cn

2017-04-26,

2017-06-01

程?hào)|遠(yuǎn), 邱亮, 宋增磊, 萬(wàn)曉媛, 董宣, 謝國(guó)駟, 黃倢. 凡納濱對(duì)蝦感染蝦肝腸胞蟲(chóng)的群體及組織間差異性分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2018, 39(4): 83–92

Cheng DY, Qiu L, Song ZL, Wan XY, Dong X, Xie GS, Huang J. Differences between populations and tissues ofinfected with. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(4): 83–92