大菱鲆受精卵顯微注射技術(shù)的建立*

崔忠凱 王 倩 劉新富 孟 振 陳松林

?

大菱鲆受精卵顯微注射技術(shù)的建立*

崔忠凱1,2#王 倩1#劉新富1孟 振1陳松林1①

（1. 青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071； 2. 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院 上海 201306；）

本研究將100~300 pg含有肌肉特異表達啟動子和綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)基因的重組質(zhì)粒(:)顯微注射到大菱鲆()受精卵動物極細胞中，通過細心培育，成功孵化出魚苗約120尾。統(tǒng)計分析顯示，顯微注射后,大菱鲆胚胎存活率為4.8%。利用熒光顯微鏡觀察大菱鲆胚胎及仔魚，只在注射:質(zhì)粒的胚胎及仔魚的肌肉中發(fā)現(xiàn)有綠色熒光。通過進一步PCR擴增檢測，在注射的大菱鲆胚胎及仔魚DNA中擴增出了GFP特異片段，大小約為340 bp。研究表明，本研究成功建立了大菱鲆顯微注射技術(shù)，可為大菱鲆基因功能研究和遺傳育種奠定基礎(chǔ)。

大菱鲆；受精卵；顯微注射；GFP

近年來，由于育種成本、時間和操作等因素的影響，相比淡水魚類，海水養(yǎng)殖魚類遺傳改良研究進展緩慢。隨著越來越多海水養(yǎng)殖魚類全基因組測序的完成(Chen, 2014; Shao, 2016)，許多與重要經(jīng)濟性狀相關(guān)的基因亟需被發(fā)掘、解析甚至改良。目前，通過顯微注射介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因和基因組編輯技術(shù)已經(jīng)在淡水養(yǎng)殖魚類遺傳育種和基因功能研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用(朱作言等, 1999; Dunham, 2009; Li, 2013; Qin, 2016)。但海水養(yǎng)殖魚類相關(guān)研究報道卻較少，原因是建立海水養(yǎng)殖魚類相應(yīng)的顯微注射技術(shù)難度較大。

顯微注射技術(shù)是一種通過顯微操作儀在解剖鏡或顯微鏡下將外源物質(zhì)、細胞核或細胞注入到受體中的生物微操作技術(shù)(沙珍霞等, 2005)，此技術(shù)具有應(yīng)用廣泛、可靠性強、效果較好的特點(Rembold, 2006; Grabher, 2008)。顯微注射技術(shù)在魚類中的應(yīng)用相對較早，童第周等(1963)率先建立了魚類細胞核移植的顯微注射技術(shù)。20世紀80年代，Zhu等(1985)通過顯微注射技術(shù)創(chuàng)制了世界上第1尾轉(zhuǎn)基因魚。目前，顯微注射技術(shù)廣泛應(yīng)用于淡水魚類中。由于海水魚類的受精卵屬于浮性卵，卵膜緊貼胚胎，不易剝落(劉洋等, 2004)，孵化培育困難等等，因此，建立顯微注射技術(shù)難度較大。僅見花鱸() (劉洋等, 2004)、真鯛() (Kato, 2007)、太平洋藍鰭金槍魚() (Otani, 2008)、箕作黃姑魚() (Yoji, 2011)、半滑舌鰨() (Cui, 2017)等有成功報道。

大菱鲆()屬于鲆科(Bothidae)、菱鲆屬()，自1992年首次引進以來，已成為我國北方沿海重要的養(yǎng)殖魚類之一(雷霽霖等, 2003)。近年來，大菱鲆養(yǎng)殖面臨種質(zhì)退化和病害頻發(fā)問題，其雌性個體比雄性個體大20%~60%。本研究以GFP基因為報告基因，建立大菱鲆顯微注射技術(shù)，不僅為大菱鲆性別決定機制、抗病基因篩選及良種培育等研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)，也將豐富海水魚類基因功能分析和遺傳育種研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受精卵 大菱鲆親魚于2017年4月18日取自山東青島市通用水產(chǎn)有限公司。選取性腺發(fā)育良好的個體作為親魚，親魚雌魚經(jīng)過強化培育達到性腺隆起明顯時，進行人工催產(chǎn)。將成熟卵子和精子人工擠出，采用干法授精，加海水激活后，挑選質(zhì)量好的受精卵(近似球狀、透明)作為顯微注射的實驗材料。

1.1.2:質(zhì)粒 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所水產(chǎn)生物技術(shù)與基因組研究室保存的:質(zhì)粒是由5.3 kb肌肉特異啟動子與GFP基因連接構(gòu)建的(Du, 2006)。將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌() TOP 10菌株中擴大培養(yǎng)，使用質(zhì)粒提取試劑盒(Omega)提取質(zhì)粒。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒，并用NanoVue plus超微量紫外-可見光分光光度計測定質(zhì)粒的濃度，將濃度調(diào)整為50 ng/μl，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 顯微注射針和凹槽板 參考半滑舌鰨顯微注射技術(shù)(Cui, 2017)，使用Sutter公司的水平拉針儀制備注射大菱鲆胚胎用的玻璃微量注射針(圖1)。使用磨針儀打磨注射針的針尖。制備一個帶有凹槽(凹槽寬度為0.95 mm±0.05 mm, 深度為1.00 mm±0.05 mm)的濃度為2%的瓊脂糖平板(圖2)。

圖1 大菱鲆和斑馬魚胚胎顯微注射玻璃針的比較

圖2 大菱鲆受精卵顯微注射用凝膠凹槽板

1.2 實驗方法

1.2.1 受精卵前期培育 將大菱鲆受精卵用13℃~ 14℃的海水進行漂洗，然后放入相同溫度的無菌海水中培育約2 h，達到Ⅰ細胞期(雷霽霖等, 2003)開始進行顯微注射，直至到Ⅳ細胞期為止。期間及時清除注射后的死卵。

1.2.2 顯微注射 取少量受精卵在解剖鏡下觀察，至大部分受精卵動物極隆起后，開始準備進行顯微注射，注射時的室溫為11℃~16℃。將發(fā)育正常的Ⅰ~Ⅳ細胞期的受精卵用撥卵針整齊排列在瓊脂糖膠板的凹槽中，吸除掉大部分海水，使胚胎落到凹槽上。用撥卵針將受精卵輕輕壓進凹槽里，旋轉(zhuǎn)受精卵使動物極朝上。凹槽里的受精卵數(shù)量不宜過多，根據(jù)操作速度來定，避免受精卵長時間脫離海水并承受擠壓導(dǎo)致破碎。

使用Eppendorf的微量上樣針將:質(zhì)粒裝入注射針中，注射針安裝到WPI公司的PV820顯微注射儀上，注射針與凹槽平板呈45°；將100~300 pg的:質(zhì)粒注入受精卵的動物極，為避免注射過程中細胞質(zhì)逆流，設(shè)置顯微注射儀的保持壓為0.1~3 psi (Pounds per square inch)，注射過的受精卵在凹槽內(nèi)停留時間不宜超過4 min，以防受精卵破裂。及時將受精卵撥離凹槽，轉(zhuǎn)移到無菌海水中。

1.2.3 受精卵的孵化 轉(zhuǎn)入:質(zhì)粒的受精卵和未注射受精卵各1000粒，分別放入裝有13℃~ 14℃的無菌海水的500 ml燒杯中進行培養(yǎng)，注射多余的受精卵放入另1個燒杯培養(yǎng)，燒杯進行水浴，溫度為13℃。向無菌海水中加入亞甲基藍溶液，每100 ml無菌海水中加入2 μl 10000′的1%亞甲基藍溶液。每隔3~5 h換1次燒杯中加入亞甲基藍溶液的無菌海水，并清除沉到杯底的死卵。在燒杯中培養(yǎng)約108 h后，將胚胎轉(zhuǎn)移到體積為30~50 L的玻璃鋼水槽中培養(yǎng)，水槽中海水體積為20~30 L，水溫為13℃~14℃。

1.2.4 存活率 每24 h統(tǒng)計注射胚胎和未注射胚胎存活率。計算公式：

1.2.5 GFP表達觀察 從受精后60 h開始至胚胎出膜后24 h為止，取樣觀察。在Nikon熒光顯微鏡(Nikon Eclipse 80i)下，使用藍色濾光片，觀察GFP表達情況并拍攝記錄。

1.2.6 胚胎DNA的提取 胚胎發(fā)育到肌節(jié)期時(受精后約65 h)取樣，每組取10尾，共3組；出膜24 h后，取3尾有GFP熒光的仔魚，用95%乙醇固定。用海洋動物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技)提取基因組DNA。

1.2.7 PCR檢測 根據(jù):質(zhì)粒中GFP基因序列設(shè)計特異引物。上游引物為5￠-TTAATTTTATT-TGCACTACTGG-3￠；下游引物為5￠-TTCTTTGGTTT-GTCTCCC-3￠，預(yù)擴增片段為346 bp。反應(yīng)體系：25 μl,加1 μl DNA (~50 ng/μl) 作為模板，3 μl 10′Buffer (MgCl2+)，2 μl dNTPs，0.25 μlDNA 聚合酶(TaKaRa)，引物各0.75 μl (10 μmol/L)，18.25 μl ddH2O。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；每個循環(huán)95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共25個循環(huán)；72℃延伸10 min。濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，Gel-100凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad)檢測。切膠后用凝膠回收試劑盒(康為世紀)回收，然后與pMD-18T載體(TaKaRa)連接，轉(zhuǎn)化到Top 10感受態(tài)細胞，涂平板培養(yǎng)挑單克隆后，送睿博興科生物技術(shù)公司測序，測序結(jié)果與:質(zhì)粒序列用BioEdit Sequence Alignment Editor軟件比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯微注射對胚胎存活率的影響

本研究將:質(zhì)粒顯微注射到大菱鲆受精約2 h后的Ⅰ~Ⅳ細胞的受精卵里。共注射了2批，每批約1250粒。將大約2500粒顯微注射的胚胎和1000粒未注射胚胎，分別放到13℃~14℃的無菌海水中孵化，每24 h統(tǒng)計胚胎存活率(圖3)。從圖3可以看出，隨著胚胎的發(fā)育，有大量胚胎死亡，48 h時死亡率最高，只有19.0%左右的注射胚胎存活，之后存活率緩慢地下降。受精后120 h左右，大菱鲆孵化出膜，注射組的仔魚存活率約為4.8%(約120尾)。而對照組的胚胎存活率隨著發(fā)育的進行也呈現(xiàn)下降的趨勢，魚苗出膜時統(tǒng)計存活率為19.0%左右(約190尾)。

2.2 GFP表達的檢測

受精后約60 h，在熒光顯微鏡下觀察到GFP在大菱鲆胚胎中開始表達(圖4A)，隨著發(fā)育的進行，表達量逐漸升高(圖4E、圖4G)。由于體色變深的原因，出膜后24 h觀察表達量有所減弱(圖4G)。GFP的表達呈現(xiàn)出嵌合性，并且只在胚胎的肌肉組織中表達。觀察初孵仔魚時發(fā)現(xiàn)，大約56%(28/50)的仔魚在骨骼肌中可觀察到GFP熒光信號(圖4)，表明GFP基因已經(jīng)在仔魚肌肉中表達，從而說明大菱鲆受精卵的顯微注射技術(shù)已經(jīng)成功建立。

圖3 大菱鲆胚胎和初孵仔魚的存活曲線

2.3 PCR產(chǎn)物檢測

分別提取胚胎和仔魚的基因組DNA，進行PCR擴增。凝膠成像結(jié)果顯示，注射GFP質(zhì)粒的實驗組都有約340 bp的PCR特異片段，而對照組沒有相關(guān)片段(圖5)。由于10粒胚胎中存在沒有表達GFP的胚胎，并且胚胎比仔魚的細胞量少，所含的GFP量少，所以PCR擴增后，凝膠成像結(jié)果中胚胎的PCR條帶比仔魚的弱(圖5)。PCR擴增產(chǎn)物單克隆測序結(jié)果顯示，PCR擴增片段確為注射質(zhì)粒中的GFP片段(圖6)。

3 討論

有關(guān)大菱鲆顯微注射技術(shù)的研究迄今為止尚未見報道。盡管斑馬魚()、青鳉()及一些淡水鯉科魚類的受精卵顯微注射技術(shù)已建立并效果良好(Hwang, 2013; Ansai, 2014; Li, 2013)，并且部分海水魚類也建立了顯微注射技術(shù)(劉洋等, 2004; Kato, 2007; Otani, 2008; Yoji, 2011)。對于海水鲆鰈魚類來說，受精卵顯微注射難度更大。這是因為海水鲆鰈魚除了具有海水魚受精卵共有的特點之外，還具有(1)卵膜很硬，很難將外源基因DNA、mRNA或蛋白質(zhì)顯微注射到受精卵的動物極；(2)仔魚具有變態(tài)的特點，在變態(tài)前后仔魚死亡率較高，通常需要有數(shù)千尾以上的仔魚才能培育長大，即使采用受精卵顯微注射技術(shù)獲得數(shù)百個顯微注射的胚胎，也很難培育長大為成魚。因此，有關(guān)海水鲆鰈類顯微注射技術(shù)研究迄今國內(nèi)外僅見半滑舌鰨(Cui, 2017)，這也成為限制基因組編輯技術(shù)在海水鲆鰈魚類基因功能分析和基因定點突變育種中成功應(yīng)用的瓶頸因子。因此，要想建立大菱鲆基因組編輯技術(shù)，首先要突破大菱鲆受精卵顯微注射技術(shù)。

約4.8%的大菱鲆注射胚胎最終孵化出膜，其比例低于未注射胚胎?？赡艿脑虬ㄗ⑸鋾r，細胞受到機械損傷、外源DNA對胚胎的毒性和注射劑量等。合適的顯微注射針不僅能夠?qū)ε咛サ臋C械損傷降到最低，而且還能夠提高操作效率。本研究中，根據(jù)海水鲆鰈類受精卵的特點，利用Sutter公司的水平拉針儀制備玻璃微量注射針，其與注射半滑舌鰨(Cui, 2017)的相似。注射方式和注射劑量的多少直接影響到胚胎存活率和轉(zhuǎn)基因的成功率(李智等, 1998)。王亞麗等(2017)分析了轉(zhuǎn)基因顯微注射的注射劑量對雞()胚胎孵化和轉(zhuǎn)基因效率的影響，研究表明，影響胚胎發(fā)育的主要因素是注射劑量的大小。沈延等(2013)對TALEN技術(shù)的研究表明，mRNA的注射量越大，TALEN的作用效率就越高，但斑馬魚胚胎的畸形率也隨之上升，而存活率就會下降。本研究根據(jù)半滑舌鰨、花鱸、斑馬魚的注射濃度及注射量(Cui, 2017; 劉洋等, 2004; Du, 2006)設(shè)定大菱鲆顯微注射濃度為50 ng/μl、注射量為100300 pg。

圖4 外源基因GFP在大菱鲆轉(zhuǎn)基因胚胎肌肉中的表達

A~B：受精后61 h的胚胎；C~D：A~B胚胎的放大照片；E~F：初孵仔魚；G~H：出膜后24 h的仔魚； A，C，E：藍色濾光片和白光下注射GFP的胚胎和仔魚；B，D，F(xiàn)：藍色濾光片和白光下未注射GFP的胚胎及仔魚； G：藍色濾光片下注射GFP的仔魚；H：藍色濾光片下未注射GFP的仔魚

A~B: 61 h post-fertilization embryos; C~D: Larger magnification of A and B; E~F: Newly hatched fry; G~H: 24h post-hatching fry; A, C, E: Embryos and fries injected with GFP in blue filter and white-light; B, D, F: Embryos and fries uninjected with GFP in blue filter and white-light; G: Fry injected with GFP in blue filter; H: Fry uninjected with GFP in blue filter

圖5 大菱鲆胚胎和仔魚基因組DNA PCR產(chǎn)物檢測

Sar：實驗組肌節(jié)期的胚胎；Lar：實驗組出膜后24 h的仔魚；Con1：對照組肌節(jié)期的胚胎； Con2：對照組出膜后24 h的仔魚；DL2000 Marker：2 kb分子量標準

Sar: Somite stage embryos of experimental group; Lar: 24 h post-hatching fries of experimental group; Con1: Somite stage embryos of control group; Con2: 24 h post-hatching fries of control group; DL2000 Marker: 2 kb DNA marker

圖6 GFP片段序列比對

外源DNA在被注射胚胎的發(fā)育過程中以多種形式存在，朱作言等(1989)和劉洋等(2004)研究發(fā)現(xiàn)，外源DNA與受體基因組從囊胚期開始整合，而且能夠瞬時表達。本研究注射質(zhì)粒的啟動子為肌肉特異啟動子，其在肌肉中特異表達質(zhì)粒(Du, 2006)，因此，在肌節(jié)期開始檢測熒光表達情況。隨著發(fā)育的進行，魚苗體內(nèi)的核酸酶能夠降解游離的外源DNA。因此，出膜后的仔魚中，游離的外源DNA存在的可能性很小，以此為模板，PCR擴增仍能得到特異性的片段，再者胚胎中的GFP表達量隨著發(fā)育的進行越來越多，到仔魚時，肌肉組織中熒光亮度遠大于胚胎，從而說明外源基因整合到了大菱鲆基因組中。

將外源基因、蛋白質(zhì)、mRNA或細胞導(dǎo)入到受體中的方法主要包括顯微注射、電脈沖、精子攜帶、脂質(zhì)體融合、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染和激光介導(dǎo)等(朱作言, 1999)。電脈沖轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法是直接將受精卵浸泡在溶液中，通過適合強度電脈沖處理將外源DNA、RNA或蛋白轉(zhuǎn)到受精卵動物極中。這個方法操作簡單，可同時處理大量的受精卵，但是效率很低(朱作言等, 1999; Heather, 2003)。精子攜帶方法對受精卵不會產(chǎn)生機械損傷，但需要電脈沖處理雄魚，對雄魚造成損傷。并在處理后，精子的受精能力會減弱，轉(zhuǎn)移效率也很低(朱作言等, 1999)。顯微注射技術(shù)可直接在分子和細胞水平上改變研究對象的特征。雖然，對實驗操作者的技術(shù)水平和熟練程度有一定的要求，但該技術(shù)目前廣泛應(yīng)用于生命科學各個研究領(lǐng)域。

本研究在海水養(yǎng)殖魚大菱鲆上建立了顯微注射技術(shù)，成功使:質(zhì)粒在大菱鲆魚苗肌肉組織中表達，為海水魚類基因組編輯技術(shù)的研究奠定基礎(chǔ)，對大菱鲆基因功能和遺傳育種等方面的研究具有重大意義和應(yīng)用價值。

Ansai S, Kinoshita M. Targeted mutagenesis using CRISPR/Cas system in medaka. Biology Open, 2014, 3(5): 362–371

Chen SL, Zhang G, Shao CW,. Whole-genome sequence of a flatfish provides insights into ZW sex chromosome evolution and adaptation to a benthic lifestyle. Nature Genetics, 2014, 46(3): 253–260

Cui ZK, Liu Y, Wang WW,. Genome editing revealsas an essential male sex-determining gene in Chinese tongue sole (). Scientific Reports, 2017, 7: 42213

Du SJ, Rotllant J, Tan XG. Muscle-specific expression of thegene is controlled by its 5.3-kb promoter and 5’-flanking sequence in zebrafish embryos. Developmental Dynamics, 2006, 235(12): 3306–3315

Dunham RA. Transgenic fish resistant to infectious diseases, their risk and prevention of escape into the environment and future candidate genes for disease transgene manipulation. Comparative Immunology Microbiology and Infectious Disease, 2009, 32(2): 139–161

Grabher C, Wittbrodt J. Recent advances in meganuclease-and transposon-mediated transgenesis of medaka and zebrafish. Methods Molecular Biology, 2008, 461: 521–539

Heather AH, Stephanie LP, William MM. High efficiency production of germ-line transgenic Japanese medaka () by electroporation with direct current- shifted radio frequency pulses. Transgenic Research, 2003, 12: 413–424

Hwang WY, Fu Y, Reyon D,. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology, 2013, 31(3): 227–229

Kato K, Takagi M, Tamaru Y,. Construction of an expression vector containing a β-actin promoter region for gene transfer by microinjection in red sea bream. Fisherues Science, 2007, 73(2): 440–445

Lei JL, Ma AJ, Liu XF,. Study on the development of embryo, larval and juvenile of turbotL. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2003, 34(1): 9–18 [雷霽霖, 馬愛軍, 劉新富, 等. 大菱鲆胚胎及仔稚幼魚發(fā)育研究. 海洋與湖沼, 2003, 34(1): 9–18]

Li MH, Yang HH, Li MR,. Antagonistic roles ofandin sex differentiation via estrogen production in tilapia as demonstrated by TALENs. Endocrinology, 2013, 154(12): 4814–4825

Liu Y, Sha ZX, Chen SL,. Expression of green fluorescent protein gene transferred into newly fertilized sea perch () embryos by microinjection. Journal of Fishery Sciences of China, 2004, 11(5): 385–390 [劉洋，沙珍霞，陳松林，等. 綠色熒光蛋白基因向花鱸胚胎的轉(zhuǎn)移及其表達. 中國水產(chǎn)科學, 2004, 11(5): 385–390]

Li Z, Yu S, Du TG,. Effect analysis of transgenic microinjection dose. Chinese Journal of Laboratory Animal Science,1998, 8(2): 65–69 [李智, 俞生, 都同功, 等. 轉(zhuǎn)基因顯微注射的劑量控制與效果分析. 中國實驗動物學雜志, 1998,8(2): 65–69]

Otani S, Ohara M, Miyashita S,. A method for the microinjection into naturally spawned eggs of marine fish, especially cultured Pacific bluefin tuna. Fisheries Science, 2008, 74(1): 208–210

Qin ZK, Li Y, Su BF,. Editing of the luteinizing hormone gene to sterilize channel catfish,, using a modified zinc finger nuclease technology with electroporation. Marine Biotechnology (NY), 2016, 18(2): 255–263

Rembold M, Lahiri K, Foulkes NS,. Transgenesis in fish: Efficient selection of transgenic fish by co-injection with a fluorescent reporter construct. Nature Protocols, 2006, 1(3): 1133–1139

Sha ZX, Chen SL, Liu Y,. Progress on the application of microinjection technique in fish cell transplantation and in transgenic marine fish. Marine Fisheries Research, 2005, 26(3): 86–90 [沙珍霞，陳松林，劉洋，等. 顯微注射技術(shù)在制備魚類嵌合體和轉(zhuǎn)基因海水魚上的應(yīng)用. 海洋水產(chǎn)研究, 2005, 26(3): 86–90]

Shao CW, Bao BL, Xie ZY,. The genome and transcriptome of Japanese flounder provide insights into flatfish asymmetry. Nature Genetics, 2016, 49(1): 119–124

Shen Y, Huang P, Zhang B. A protocol for TALEN contruction and gene targeting in zebrafish. Hereditas(Beijing), 2013, 35(4): 533–544 [沈延，黃鵬，張博. TALEN構(gòu)建與斑馬魚基因組定點突變的實驗方法與流程. 遺傳(北京), 2013, 35(4): 533–544]

Tong DZ, Wu SQ, Ye YF,. Migration of fish nuclei. Chinese Science Bulletin, 1963, 13(7): 60–61 [童第周, 吳尚懃, 葉毓芬, 等. 魚類細胞核的移植. 科學通報, 1963, 13(7): 60–61]

Wang YL, Wang SS, Zhang L,. Effect of microinjection dose of transgene on transgenic efficiency and embryo development of chicken. China Poultry, 2017, 39(4): 4–7 [王亞麗, 王賽賽, 張麗,等. 轉(zhuǎn)基因顯微注射劑量對雞胚轉(zhuǎn)基因效率和胚胎發(fā)育的影響. 中國家禽, 2017, 39(4): 4–7]

Yoji Y, Naoki K, Yutaka T,. Establishment of a stable transgenic strain in a pelagic egg spawning marine teleost, Nibe croaker. Aquaculture, 2011, 313(1–4): 42–49

Zhu Z, Li G, He L,. Novel gene transfer into the fertilized eggs of goldfish (L. 1758). Journal of Applied Ichthyology, 1985, 1(1): 31–34

Zhu ZY, Wang YP. Transgenic fish. Bulletin of Biology, 1999, 34(5): 1–3 [朱作言, 汪亞平. 轉(zhuǎn)基因魚. 生物學通報, 1999, 34(5): 1–3]

Zhu ZY, Xu KS, Xie YF,. A model of transgnic fish. Scientia Sinica (Ser B). 1989,19(2): 147–155 [朱作言，許克圣，謝岳峰，等. 轉(zhuǎn)基因模型魚的建立. 中國科學B輯, 1989, 19(2): 147–155]

(編輯 陳嚴)

Establishment of a Microinjection Technique in Zygote of Turbot ()

CUI Zhongkai1,2, WANG Qian1, LIU Xinfu1, MENG Zhen1, CHEN Songlin1①

(1. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306;)

Genome editing in fish has many potential applications in aquaculture and is important for gene functional analyses and genetic engineering breeding. Furthermore, genome editing in aquaculture animals is useful for cultivating new varieties and researching disease resistance and aquaculture growth. However, the difficulty of microinjection and cultivation in mariculture fish embryos seriously hampers the application of genome editing technology. Many methods are used to introduce DNA, RNA, and protein to fish genomes, such as pulsed electric, retroviral transfection, and laser-mediated technologies. Microinjection is the most widely used method. Turbot () is one of the most important mariculture fish in Chinese aquaculture. To our knowledge, there have been no reports on the success of the microinjection technique in turbots. In this study, the:plasmid (50 ng/μl) with green fluorescent protein (GFP) expression by a 5.3 kb muscle-specificpromoter fragment was successfully microinjected and expressed in the cytoplasm of newly zygote of turbot at the 1~4 cell stage. The effects of microinjection on the survival rate of turbot embryos were studied. The survival rate of microinjected embryos was lower than that of uninjected embryos. Overall, 120 microinjected fishes (4.8%) survived and 190 (19.0%) uninjected survived. The GFP expression in the embryos and larvae was observed using a fluorescence microscope (Nikon Eclipse 80i). In total, 56% (28/50) of microinjected fishes expressed GFP. A specific GFP-encoding segment (346 bp) was amplified from the DNA of microinjected embryos and larvae by polymerase chain reaction, showing that the GFP gene had been introduced into the turbot embryos and confirming successful microinjection technique of turbot.

; Zygote; Microinjection; GFP

CHEN Songlin, E-mail: chensl@ysfri.ac.cn

10.19663/j.issn2095-9869.20170601001

S962

A

2095-9869(2018)04-0030-07

*中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(20603022017003)和山東省泰山學者攀登計劃項目共同資助[This work was supported by the Scientific Institution Basal Research Fund, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences (20603022017003), and Taishan Scholar Climbing Project, Shandong]. 崔忠凱，E-mail: cuizk3@foxmail.com；王 倩，E-mail: wangqian2014@ysfri.ac.cn

# 共同第一作者

陳松林，研究員，E-mail: chensl@ysfri.ac.cn

2017-06-01,

2017-07-10

崔忠凱, 王倩, 劉新富, 孟振, 陳松林. 大菱鲆受精卵顯微注射技術(shù)的建立. 漁業(yè)科學進展, 2018, 39(4): 30–36

Cui ZK, Wang Q, Liu XF, Meng Z, Chen SL. Establishment of a microinjection technique in zygote of turbot (). Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(4): 30–36