MAPK/ERK信號通路在大鼠視神經(jīng)損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞活化中的作用及機(jī)制研究

陳賓

視神經(jīng)損傷可明顯影響患者視力甚至致盲而嚴(yán)重影響其生存質(zhì)量[1-2]。小膠質(zhì)細(xì)胞為分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的一類固有免疫效應(yīng)細(xì)胞，在缺血缺氧時(shí)一方面可分泌營養(yǎng)因子和吞噬病原體等而對機(jī)體起到保護(hù)作用，而另一方面亦可通過分泌炎性細(xì)胞因子、趨化因子等發(fā)揮損傷作用[3-5]。絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)是與小膠質(zhì)細(xì)胞密切相關(guān)通路，其中ERK1/2通路是其中通路之一[6-7]。因此，明確ERK1/2通路在大鼠視神經(jīng)損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞活化中的作用及機(jī)制有助于通過對ERK1/2通路進(jìn)行調(diào)控達(dá)到控制小膠質(zhì)細(xì)胞活化以及治療視神經(jīng)損傷的目的，然而目前關(guān)于此方面研究仍較少，需進(jìn)一步研究證實(shí)。因此，本研究通過制作大鼠視神經(jīng)損傷模型，并探討ERK1/2通路在大鼠視神經(jīng)損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞活化中的作用及機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 100只清潔級健康成年雄性SD大鼠(沈陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號：SCXK(遼)2015-0001)，體重160～242 g，平均體重(202.44±20.28)g，所有大鼠均經(jīng)常規(guī)外眼檢查和眼底檢查確定無相關(guān)疾病，喂養(yǎng)在醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，喂養(yǎng)條件為干燥、通風(fēng)、大鼠均可自由攝取食物和水，喂養(yǎng)食物為常規(guī)大鼠飼料。將入選的大鼠進(jìn)行編號并按隨機(jī)數(shù)字表分為實(shí)驗(yàn)組50只和對照組50只。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)組 采用熒光金雙側(cè)上丘逆行標(biāo)記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞并在培養(yǎng)7d后制作視神經(jīng)損傷模型，在術(shù)前3 d每天給予左氧佛沙星滴眼液4滴滴眼，對照組不予處理；實(shí)驗(yàn)組均選取右眼制作視神經(jīng)損傷模型，腹腔注射麻醉后常規(guī)進(jìn)行眼周消毒、開瞼、沿角膜邊緣剪開，剪斷外直肌后拉伸眼球，暴露視神經(jīng)，在球后視神經(jīng)2 mm處夾閉損傷后確定視網(wǎng)膜仍可見血流，清潔創(chuàng)口并縫合球結(jié)膜，結(jié)膜囊內(nèi)涂抹氧佛沙星眼膏，麻醉蘇醒后確認(rèn)無明顯異常后放回原飼養(yǎng)處飼養(yǎng)，術(shù)后3 d連續(xù)在結(jié)膜囊內(nèi)涂抹氧佛沙星眼膏，完成造模；造模成功后3d取右眼球，分離部分視網(wǎng)膜并將獲得的視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層朝上，常規(guī)制作視網(wǎng)膜鋪片，并熒光顯微鏡下觀察2組視網(wǎng)膜鋪片小膠質(zhì)細(xì)胞存活情況，并采用Image-Pro Plus 6.0軟件對視網(wǎng)膜中的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.2 應(yīng)用蛋白免疫印記法檢測2組MAPK通路的ERK蛋白表達(dá)水平及磷酸化蛋白水平

將獲得的視網(wǎng)膜標(biāo)本進(jìn)行液氮速凍后放置在-80 ℃低溫冰箱保存待測，檢測采用100 g組織加入1 mL細(xì)胞裂解液和10 μL的苯甲基磺酰氟的比例提取蛋白質(zhì)，采用考馬斯亮藍(lán)法測定各蛋白相應(yīng)水平，將組織加熱變性后進(jìn)行電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上采用5%的脫脂牛奶封閉120 min，添加各待測指標(biāo)一抗以及β-actin并在4 ℃恒溫箱中孵育過夜，添加辣根過氧化物標(biāo)記的各待測指標(biāo)二抗后在室溫下孵育60 min，配置顯色液覆蓋PVDF膜，1 min后采用Image-lab軟件進(jìn)行目的條帶灰度分析，并計(jì)算其與β-actin的比值。

1.2.3 應(yīng)用免疫組化法檢測2組視網(wǎng)膜白介素10(IL-10)和腫瘤壞死因子(TNF-α)等表達(dá)水平

將獲得的眼球組織常規(guī)進(jìn)行石蠟包埋并切出厚度為5 μm的視網(wǎng)膜連續(xù)切片至少3張；將獲得的視網(wǎng)膜切片常規(guī)進(jìn)行二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，滴加3%雙氧水、滴加EDTA抗原修復(fù)液并進(jìn)行微波修復(fù)等措施后滴加IL-10和TNF-α兔抗人多克隆抗體(北京中杉金橋公司提供)，室溫孵育60 min后進(jìn)行DAB染色，顯微鏡下觀察染色滿意后以蒸餾水清洗，梯度酒精脫水并采用中性樹膠封片觀察， IL-10和TNF-α均主要表達(dá)于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，以出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性，檢測樣本的IL-10和TNF-α陽性率。

1.2.4 向?qū)嶒?yàn)組視網(wǎng)膜鋪片添加ERK1/2通路阻斷劑PD98059，6 h后再次檢測其IL-10和TNF-α等表達(dá)水平及小膠質(zhì)細(xì)胞存活情況，方法同1.2.1和1.2.3。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)組和對照組ERK蛋白表達(dá)水平及磷酸化蛋白水平、視網(wǎng)膜鋪片小膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)、IL-10陽性率和TNF-α陽性率比較

與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組ERK蛋白表達(dá)水平及磷酸化蛋白水平降低，視網(wǎng)膜鋪片小膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，IL-10陽性率和TNF-α陽性率升高(P<0.05)(表1)。

表1 實(shí)驗(yàn)組和對照組ERK蛋白表達(dá)水平及磷酸化蛋白水平、視網(wǎng)膜鋪片小膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)、IL-10陽性率和TNF-α陽性率比較

注：與對照組比較，*P<0.05

2.2 實(shí)驗(yàn)組ERK1/2通路阻斷劑PD98059阻斷前后的視網(wǎng)膜鋪片小膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)、IL-10陽性率和TNF-α陽性率比較

與阻斷前比較，實(shí)驗(yàn)組阻斷后6h的IL-10和TNF-α等表達(dá)水平升高，小膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)降低(P<0.05)(表2)。

表2 實(shí)驗(yàn)組ERK1/2通路阻斷劑PD98059阻斷前后的視網(wǎng)膜鋪片小膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)、IL-10陽性率和TNF-α陽性率比較

注：與阻斷前比較，*P<0.05

3 討 論

外傷、缺血、缺氧、炎癥、代謝性疾病、中毒、腫瘤等均可造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷[8-9]。而近年來交通傷、墜落傷、各類炎癥反應(yīng)和代謝疾病以及腫瘤均可導(dǎo)致顱神經(jīng)損傷，已成為嚴(yán)重影響患者健康乃至生存質(zhì)量的重要疾病。在顱神經(jīng)損傷中視神經(jīng)損傷為其常見類型之一，視神經(jīng)作為顱神經(jīng)的一部分，其生理性特殊，其直接和間接性損傷均可影響視力甚至導(dǎo)致眼盲的發(fā)生，且其臨床治療困難，無有效治療手段，療效欠佳[10-12]。改善視神經(jīng)損傷治療效果對改善其患者生存質(zhì)量具有重要意義。

小膠質(zhì)細(xì)胞為靜駐在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的免疫反應(yīng)細(xì)胞，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境的變化敏感，同時(shí)在神經(jīng)元突觸連接以及神經(jīng)元營養(yǎng)等多個(gè)方面具有重要作用，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)環(huán)境被打破，小膠質(zhì)細(xì)胞可迅速激活并發(fā)生形態(tài)的改變，同時(shí)可分泌大量促炎因子和毒性因子，亦可分泌營養(yǎng)因子和吞噬病原體等而對機(jī)體起到保護(hù)作用[13-15]。絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)是與小膠質(zhì)細(xì)胞密切相關(guān)通路，作為細(xì)胞外重要傳遞介質(zhì)，可參與小膠質(zhì)細(xì)胞的生長、凋亡、分化、信號傳導(dǎo)等，與小膠質(zhì)細(xì)胞功能密切相關(guān)[16-18]，而細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)通路是MAPK三大通路(ERK1/2、應(yīng)激激活蛋白激酶和氨基末端激酶)之一，可調(diào)控細(xì)胞生長因子和營養(yǎng)性因子的釋放而介導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)作用，但亦可通過控制炎癥免疫因子的釋放而介導(dǎo)細(xì)胞損傷作用[19-20]。因此，ERK1/2通路與視神經(jīng)損傷的小膠質(zhì)細(xì)胞變化亦可能相關(guān)，明確其與大鼠視神經(jīng)損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞活化中的關(guān)系具有重要意義。

因此，本研究制作大鼠視神經(jīng)損傷模型，探討其ERK1/2通路在大鼠視神經(jīng)損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞活化中的作用，并分析了其對視網(wǎng)膜白介素10(IL-10)和腫瘤壞死因子(TNF-α)等炎癥相關(guān)因子表達(dá)的影響，本研究結(jié)果顯示相對于無視神經(jīng)損傷大鼠，存在視神經(jīng)損傷大鼠的ERK蛋白表達(dá)水平及磷酸化蛋白水平降低，視網(wǎng)膜鋪片小膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，IL-10陽性率和TNF-α陽性率升高，提示ERK、IL-10和TNF-α均可能參與視神經(jīng)損傷，而視神經(jīng)損傷可對其小膠質(zhì)細(xì)胞造成明顯的影響。向有視神經(jīng)損傷大鼠的視網(wǎng)膜鋪片添加ERK1/2通路阻斷劑PD98059進(jìn)行ERK1/2通路阻斷后6 h大鼠的IL-10和TNF-α等表達(dá)水平出現(xiàn)升高而小膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，提示ERK1/2通路可能通過調(diào)控大鼠IL-10和TNF-α等炎癥免疫相關(guān)因子的表達(dá)而參與其神經(jīng)損傷和小膠質(zhì)細(xì)胞活化調(diào)控，從而控制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，并可通過ERK1/2通路相關(guān)藥物達(dá)到調(diào)控ERK1/2通路，控制小膠質(zhì)細(xì)胞活化以及治療視神經(jīng)損傷的目的。本研究均采取了雄性成年大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，保證了研究不受年齡以及性別等因素的影響，同時(shí)亦導(dǎo)致了研究無法體現(xiàn)雌性視神經(jīng)損傷大鼠以及不同年齡視神經(jīng)損傷大鼠的ERK1/2通路狀態(tài)及其小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)，而研究中的相關(guān)檢測操作亦可能受到檢測者操作熟練技術(shù)的影響，因此需進(jìn)一步全面研究克服研究缺陷，確定MAPK/ERK信號通路在大鼠視神經(jīng)損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞活化中的作用及機(jī)制。

綜上所述，MAPK/ERK信號通路可能通過抑制炎癥因子IL-10和TNF-α等表達(dá)而減少其視神經(jīng)損傷并促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，這一機(jī)制的發(fā)現(xiàn)可能為視神經(jīng)損傷治療藥物的開發(fā)提供方向。