乳腺癌組織中ALDH1及BCRP的表達狀況與乳腺癌病理特征的相關(guān)性分析

梁法清 杜正貴 何陽君

[摘要] 目的 探討乳腺癌患者癌組織及腋窩淋巴結(jié)中乙醛脫氫酶1（ALDH1）以及乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）的表達狀況與乳腺癌病理特征的關(guān)系。 方法 選取2013年1月～2016年3月在四川大學(xué)華西醫(yī)院治療的乳腺癌患者共84例，同時選取距腫瘤邊緣大于1 cm正常乳腺組織（癌旁正常組織）作為對照，采用免疫組化法檢測ALDH1和BCRP蛋白的表達。 結(jié)果 乳腺癌組織中ALDH1和BCRP蛋白表達率明顯高于癌旁正常組織（P < 0.01）；腋窩淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移患者癌組織中ALDH1和BCRP蛋白表達陽性率明顯高于無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P < 0.05）；雌激素受體（ER）陽性患者乳腺癌組織中BCRP蛋白表達陽性率明顯高于ER陰性患者（P < 0.05）；而乳腺癌組織中ALDH1和BCRP蛋白表達與患者年齡、絕經(jīng)情況、腫瘤大小、組織分級、TNM分期和孕激素受體（PR）均無相關(guān)性（P > 0.05）；乳腺癌患者ALDH1和BCRP蛋白的表達也無相關(guān)性（rs=-0.092，P > 0.05）。 結(jié)論 ALDH1和BCRP蛋白在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中有一定作用，可能參與了腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等過程。

[關(guān)鍵詞] 乙醛脫氫酶1；乳腺癌耐藥蛋白；乳腺癌；病理特征

[中圖分類號] R737.9 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）05（b）-0076-04

The relationship between the expressions of aldehyde dehydrogenase 1， breast cancer resistance protein in breast cancer tissues and pathological features of breast cancer

LIANG Faqing1 DU Zhenggui1 HE Yangjun2

1.Department of Breast Surgery， West China Hospital of Sichuan University， Sichuan Province， Chengdu 610041， China； 2.Department of Surgery， Chengdu Seventh People′s Hospital， Sichuan Province， Chengdu 610041， China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between aldehyde dehydrogenase 1 （ALDH1）， breast cancer resistance protein （BCRP） expressions in tumor tissues and pathological features of breast cancer. Methods From January 2013 to March 2016， 84 patients with breast cancer in West China Hospital of Sichuan University and the normal breast tissues （adjacent tissues） which was used for control group is defined as the edge of cancer tissueedge greater than 1 cm were selected. The expression of ALDH1 and BCRP protein was detected by immunohistochemistry. Results The expression rates of ALDH1 and BCRP protein in breast cancer tissues were significantly higher than those in adjacent tissues （P < 0.01）. The positive rates of ALDH1 and BCRP protein expression in patients with axillary lymph node metastasis were significantly higher than those in patients without axillary lymph node metastasis （P < 0.05）. The positive rate of BCRP protein expression in estrogen receptor （ER） positive patients was significantly higher than that in ER negative patients （P < 0.05）. The expression of ALDH1 and BCRP protein was not correlated with age， menopause， tumor size， histological grade， TNM stage and progesterone receptor （PR） （P > 0.05）. There was no correlation between the expression of ALDH1 and BCRP protein in breast cancer （rs=-0.092， P > 0.05）. Conclusion ALDH1 and BCRP may play an important role in the development of breast cancer， which may be involved in the tumor invasion， metastasis etc.

[Key words] Aldehyde dehydrogenase 1； Breast cancer resistance protein； Breast cancer； Pathological characteristics

乳腺癌是臨床上較為常見的惡性腫瘤，且近年來呈現(xiàn)出了明顯的上升趨勢，美國癌癥協(xié)會報道中乳腺癌在女性新發(fā)病歷中居于首位[1]。由此可見乳腺癌在人群中的疾病負(fù)擔(dān)較重，因此對乳腺癌的發(fā)病機制的研究極為重要，是我們對乳腺癌預(yù)防、診斷、治療的基石。對于乳腺癌發(fā)病及侵襲機制的研究，可以為臨床上乳腺癌患者的靶向治療提供新的靶點，并可以為乳腺癌患者的臨床預(yù)后評估提供可靠的實驗室指標(biāo)。我們知道，一些腫瘤生物學(xué)指標(biāo)可以促進癌細胞的增殖與分化，進而參與到癌癥的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移等過程。有基礎(chǔ)研究報道，乙醛脫氫酶1（aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1）以及乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）可以通過誘導(dǎo)癌細胞細胞周期調(diào)控異常，提高癌組織對于抗癌藥物的耐受能力，進而促進乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[2-4]。然而，在臨床研究中，ALDH1以及BCRP是否與乳腺癌的發(fā)生及疾病進展有關(guān)尚未見報道，因此，本研究將選取在四川大學(xué)華西醫(yī)院（以下簡稱“我院”）治療的乳腺癌患者84例，重點探討了ALDH1和BCRP在乳腺癌患者中的異常表達，并分析其與乳腺癌患者臨床病理特征間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月～2016年3月在我院治療的乳腺癌患者84例，均為女性患者，年齡29～65歲，中位年齡50歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均接受乳腺全切手術(shù)的乳腺癌患者，術(shù)后均經(jīng)病理證實為浸潤性導(dǎo)管癌；②術(shù)前未接受放化療等治療；③患者及家屬知情同意并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床病理資料欠缺；②術(shù)前接受放化療等治療；③選取的對照組標(biāo)本中有腫瘤累及病例。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 染色及檢測方法

1.2.1 染色方法 ①組織固定及保存：采取組織后，4%多聚甲醛中4℃固定過夜，置于70%酒精中4℃保存。②組織的包埋：將保存于4℃、70%酒精中的組織分別置于80%酒精15 min、95%酒精15 min，100%酒精15 min×2次，1/2酒精1/2透明劑60 min，透明劑60 min×2次，1/2透明劑1/2石蠟90 min，石蠟120 min×2次，將組織放入盛有石蠟的模具中，擺好位置，于石蠟包埋機的冷臺上冷卻。③切片及貼片：將包埋好的組織置于切片機上，切片厚度為3～5 μm，放于展片機中展開，將組織切片撈于多聚賴氨酸載玻片上，編號，60℃烤干1 h，貼片后60℃烤片2～3 h，后置于4℃保存。④脫蠟及脫水：先后使用使用等體積二甲苯及無水乙醇充分混合備用，脫蠟脫水時依次使用如下溶液及時間進行沖洗：二甲苯（5 min×2次）→二甲苯-無水乙醇溶液（5 min）→無水乙醇（5 min×2次）→95%乙醇（5 min）→70%乙醇（5 min）→50%乙醇（5 min）→自來水沖洗（5 min）。⑤抗原修復(fù)：將切片置入盛有10 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液的容器內(nèi)在微波爐內(nèi)煮沸，后在亞沸騰溫度下孵育10 min后流水沖洗5 min。⑥室溫下使用5%山羊血清封閉切片30 min。⑦將ALDH1及BCRP抗體（鼠來源，南京碧云天生物科技有限公司）分別稀釋200倍，分別采用滴染法小心添加一抗，確保待染組織被一抗染液完全包被，在室溫下孵育1.5 h后轉(zhuǎn)入濕盒內(nèi)放入4℃冰箱內(nèi)孵育過夜。⑧室溫下孵育二抗1 h，酶法檢測。⑨流水沖洗，脫水并封片，顯微鏡下放大400倍觀察。OLIPICS電子顯微鏡購自上海精密儀器有限公司，配套試劑購自南京泰康生物科技有限公司。

1.2.2 判讀標(biāo)準(zhǔn) 按切片中細胞有無顯色及顯色深淺進行評分，無顯色為0分，淺棕色為1分，深棕色為2分。按顯色細胞比例進行評分：0%～10%記0分，10%～<30%記1分，30%～<70%記2分，≥70%記3分。以上2項評分之和作為積分，按積分高低判讀表達水平，0分為陰性，1～2分為低表達，3～5分為高表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALDH1和BCRP在乳腺癌和癌旁組織中的表達情況

乳腺癌組織ALDH1和BCRP蛋白表達率分別為70.24%和72.62%，明顯高于癌旁正常組織（P < 0.01）。見表1、圖1（封四）。

2.2 ALDH1、BCRP表達與病理特征關(guān)系

腋窩淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移患者ALDH1和BCRP蛋白表達陽性率明顯高于無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；ER陽性患者BCRP蛋白表達陽性率明顯高于ER陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；ALDH1和BCRP蛋白表達與患者年齡、絕經(jīng)情況、腫瘤大小、組織分級、TNM分期和PR無關(guān)（P > 0.05）。見表2。

2.3 相關(guān)性分析

乳腺癌患者ALDH1和BCRP蛋白表達無相關(guān)性（rs=-0.092，P > 0.05）。

3 討論

在年齡大于35歲的育齡期女性中，乳腺癌的發(fā)病率較高，可較普通對照人群上升3～4倍[5]。特別是在具有遺傳易感因素[6]、吸煙[7]及BRC1[8]基因突變等人群中，乳腺癌的發(fā)病率更高。一項臨床回顧性分析研究顯示，乳腺癌的5年生存率為80.60%[9]，病死率較高[1]，而通過對于乳腺癌發(fā)病過程中相關(guān)腫瘤生物學(xué)機制的研究，可以為臨床上早期干預(yù)提供依據(jù)，從而改善遠期生存預(yù)后。

ALDH1可以通過影響到乳清酸脫氫酶的活性，進而參與到糖代謝、三羧酸循環(huán)及氧化呼吸鏈傳遞等生理過程中，ALDH1的異常表達可以影響癌細胞葡萄糖代謝、能量利用等，進而促進癌細胞的異常分化[10-12]?；A(chǔ)生物學(xué)機制研究也顯示，ALDH1對于下游癌基因轉(zhuǎn)錄蛋白的磷酸化修飾，可以提高細胞周期中G1/G0期比例，促進癌細胞快速跨越G0期，進而促進癌細胞的增殖異常[13-14]。乳腺癌耐藥蛋白BCRP的表達異常，可以促進癌細胞膜內(nèi)的抗癌藥物的排出，導(dǎo)致抗癌藥物生物活性的下降，進而促進癌細胞對于藥物的耐受。同時，BCRP可以增強細胞膜上ATP依賴性的轉(zhuǎn)運蛋白的活性，進而促進細胞膜內(nèi)抗癌藥物經(jīng)過轉(zhuǎn)運蛋白的外排，提高其耐藥能力。已有的研究探討了BCRP及ALDH1在乳腺癌組織中的異常表達[15-17]，但缺乏對于二者與乳腺癌臨床病理特征間的關(guān)系研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中的BCRP及ALDH1的陽性表達率均可達50%以上，陽性表達率較高，明顯高于癌旁正常對照，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），提示BCRP及ALDH1可能參與到乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中。BCRP及ALDH1的異常表達，可以通過影響到癌細胞侵襲能力、對于臨近正常組織的浸潤及遠處器官的轉(zhuǎn)移等，進而促進乳腺癌患者病情的進展。王瑾等[18-19]研究者通過回顧性分析研究了82例樣本量的臨床資料，發(fā)現(xiàn)乳腺導(dǎo)管細胞癌組織中的BCRP及ALDH1表達陽性率可較正常對照組織上升25%以上，且患者的病情越為嚴(yán)重、臨床預(yù)后越差，BCRP及ALDH1的表達陽性率越高，這與本研究的結(jié)論較為一致。在具有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，BCRP及ALDH1的表達陽性率較高，高于陰性表達組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，從生物學(xué)機制上考慮，BCRP及ALDH1的異常表達與乳腺癌關(guān)系主要可能與以下原因有關(guān)：①BCRP及ALDH1的高表達，在促進細胞線粒體氧化應(yīng)激損傷、促進癌細胞細胞周期調(diào)控異常的同時，可以促進其對于淋巴結(jié)內(nèi)皮細胞的浸潤，促進癌細胞通過淋巴管進行轉(zhuǎn)移；②BCRP及ALDH1的異常表達，可以通過新生的微淋巴結(jié)及淋巴液引流等途徑，進而導(dǎo)致腋窩淋巴結(jié)的陽性表現(xiàn)。同時，本研究發(fā)現(xiàn)ER陽性患者BCRP蛋白表達陽性率為87.50%，提示BCRP的表達與雌激素受體信號通路的異常激活可能存在一定的相關(guān)性，BCRP的異常表達可以加劇ER激活導(dǎo)致的細胞內(nèi)第二信使的上調(diào)，提高三磷酸腺苷或者鈣離子的濃度，進而導(dǎo)致信號傳導(dǎo)異?；蛘甙┘毎惓Ｔ鲋车陌l(fā)生[20]。但本研究并未發(fā)現(xiàn)組織分級、TNM分期和PR與相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)的關(guān)系，同時BCRP及ALDH1二者并不相關(guān)。

綜上所述，ALDH1和BCRP在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中有一定作用，可能參與了腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等。但本研究對于ALDH1和BCRP與乳腺癌患者的5年生存率或者中位生存時間等的關(guān)系研究不足，存在一定的局限性。

[參考文獻]

[1] Siegel RL，Miller KD，Jemal A，et al. Cancer Statistics [J]. CA Cancer J Clin，2016，66（1）：7-30.

[2] 陳思穎，蔡江霞，張蔚鵬，等.紫杉醇誘導(dǎo)的乳腺癌耐藥細胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[J].中國藥學(xué)雜志，2014，22（10）：825-832.

[3] 岳玉函，曹海玲，袁靜，等.乳腺癌組織中耐藥蛋白的表達及化療耐藥性的相關(guān)性研究[J].內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)報，2014，25（3）：211-216.

[4] 任香，舒春貴.HIF-1α和BCRP在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中的表達及臨床意義[J].中國癌癥防治雜志，2014，32（3）：289-291.

[5] Sarika PR，Nirmala RJ. Curcumin loaded gum arabic aldehyde-gelatin nanogels for breast cancer therapy [J]. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2016，65（6）：331-337.

[6] 連臻強，王頎.遺傳性乳腺癌的易感基因檢測與咨詢策略[J].醫(yī)學(xué)與哲學(xué)，2016，37（18）：11-13.

[7] 湯靜.2013年杭州市歸因于吸煙的肺癌、胃癌、乳腺癌疾病負(fù)擔(dān)研究[D].杭州：杭州師范大學(xué)，2016.

[8] Asadi S，Nazirzadeh A. Genomic analysis of one allele of a gene HER2/NEU，ERBB1，BRCA1，BRC [J]. 2016.

[9] Nandekar PP，Khomane K，Chaudhary V，et al. Identification of leads for antiproliferative activity on MDA-MB-435 human breast cancer cells through pharmacophore and CYP1A1-mediated metabolism [J]. Eur J Med Chem，2016， 115：82-93.

[10] 韓明利，吳誠義，莫志強，等.外源性TGF-β1誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細胞的乙醛脫氫酶1 mRNA及蛋白表達[J].復(fù)旦學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2011，22（4）：340-342.

[11] 王征，張浩，李偉漢，等.乙醛脫氫酶1在浸潤性乳腺癌局部復(fù)發(fā)組織中的表達及意義[J].廣東醫(yī)學(xué)，2014，34（16）：2589-2591.

[12] 王興，姜真，孫長崗.乙醛脫氫酶1與乳腺癌耐藥蛋白在乳腺癌中的表達及相關(guān)性研究[J].中國癌癥雜志，2014， 25（3）：175-181.

[13] 蔡建英，吳誠義.乳腺癌中乙醛脫氫酶1與上皮性鈣黏蛋白、神經(jīng)性鈣黏蛋白關(guān)系的研究[J].中國醫(yī)藥生物術(shù)，2014，24（3）：231-233.

[14] 關(guān)欣，董毅，鄒亞斌，等.乙醛脫氫酶1在腫瘤細胞質(zhì)中表達和腫瘤細胞基質(zhì)中表達與乳腺癌患者預(yù)后關(guān)系的臨床研究[J].中國婦幼保健，2016，31（13）：2736-2738.

[15] Xu LI，Huang S，Gaili AN，et al. Clinical significance of ALDH1 expression in breast cancer：aMeta analysis [J]. Chinese Journal of Difficult & Complicated Cases，2016.

[16] Horimoto Y，Arakawa A，Sasahara N，et al. Combination of Cancer Stem Cell Markers CD44 and CD24 Is Superior to ALDH1 as a Prognostic Indicator in Breast Cancer Patients with Distant Metastases [J]. PLoS One，2016，11（10）：e0165253.

[17] Thomas ML，De Antueno R，Coyle KM，et al. Citral reduces breast tumor growth by inhibiting the cancer stem cell marker ALDH1A3 [J]. Molecular Oncology，2016，10（9）：1485-1496.

[18] 劉新麗，李偉東，劉芳芳，等.乳腺浸潤微乳頭狀癌中乙醛脫氫酶-1表型細胞的研究[J].中華內(nèi)分泌外科雜志，2014，25（2）：93-100.

[19] 王瑾.乙醛脫氫酶在乳腺癌中的研究進展[J].蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，37（7）：874-876.

[20] 侯亮，馮海利.腦膠質(zhì)瘤組織中P-gp、MRP、BCRP的表達及臨床意義[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2017，14（35）：12-15.

（收稿日期：2018-01-03 本文編輯：任 念）