血清microRNAs作為生物標志物用于子宮腺肌病分子診斷中的可行性

徐愛云 桂濤 黃美華 朱利 萬貴平

[摘要] 目的 探討血清microRNAs作為生物標志物用于子宮腺肌病分子診斷的可行性。 方法 選擇2015年3月～2018年3月在江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院（以下簡稱“我院”）經(jīng)病理學(xué)確診的子宮腺肌病患者78例作為研究組，同時收集我院健康體檢中心年齡、性別與子宮腺肌病組基本匹配的78名健康體檢者作為對照組。利用高通量測序技術(shù)對兩組血清中的所有miRNAs進行篩選和驗證。 結(jié)果 研究組血清中microRNAs的表達水平與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。上調(diào)的miRNA個數(shù)為316個，下調(diào)的個數(shù)為24個。進一步篩選驗證后發(fā)現(xiàn)3個miRNA包括miR-22-3p、miR-103a-3p、miR-182-5p的AUC分別是0.900（95%CI：0.839～0.961）、0.828（95%CI：0.747～0.909）、0.844（95%CI：0.766～0.921）。結(jié)論 血清microRNAs有可能成為診斷子宮腺肌病的生物標志物。

[關(guān)鍵詞] 血清microRNAs；子宮腺肌?。簧飿酥疚?；分子診斷

[中圖分類號] R711.4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）05（b）-0008-04

The feasibility of serum microRNAs as biomarkers for molecular diagnosis of adenomyosis

XU Aiyun1 GUI Tao2 HUANG Meihua2 ZHU Li2 WAN Guiping2

1.The Third Clinical Medical College， Nanjing University of Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing 210023， China； 2.Department of Obstetrics and Gynecology， Jiangsu Provincial Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Nanjing University of Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing 210028， China

[Abstract] Objective To explore the feasibility of using serum microRNAs as biomarkers for the molecular diagnosis of adenomyosis. Methods Seventy-eight patients with adenomyosis confirmed by the pathological diagnosis from March 2015 to March 2018 in Jiangsu Provincial Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine （here in after referred to as "our hospital"） were selected as the study group. At the same time， 78 healthy subjects in our hospital physical examination center whose age， gender basically matched with the adenomyosis group were collected as the control group. All miRNAs in the serum of both groups were screened and validated using high-throughput sequencing technology. Results The expression level of microRNAs in the serum of the study group was significantly different from that in the control group （P < 0.05）. There were 316 up-regulated miRNAs and 24 down-regulated miRNAs. After further screening and verification， 3 miRNAs were found to include miR-22-3p， miR-103a-3p， and miR-182-5p， and AUC were 0.900 （95% CI： 0.839-0.961） and 0.828 （95% CI： 0.747-0.909）， 0.844 （95% CI： 0.766-0.921） respectively. Conclusion Serum microRNAs may be biomarkers for the diagnosis of adenomyosis.

[Key words] Serum microRNAs； Adenomyosis； Biomarkers； Molecular diagnosis

子宮腺肌?。╝denomyosis，AM）是子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)侵入子宮肌層，形成局部或彌漫性病灶的一種雌激素依賴性疾病[1]，好發(fā)于35～50歲的育齡女性[2]。子宮腺肌病的臨床癥狀主要表現(xiàn)為經(jīng)量過多、痛經(jīng)甚至不孕，部分患者無明顯癥狀[3]。由于超聲、MRI、CT等影像學(xué)檢查方法具有操作快捷等特點，仍是目前診斷子宮腺肌病的主要手段。然而，上述幾種影像學(xué)診斷方法都各有所缺，經(jīng)腹彩超檢查使用的探頭頻率較低，經(jīng)陰道彩超對操作者的技術(shù)要求較高，超聲造影所使用的造影劑具有一定的副作用，MRI費用昂貴使其很難在臨床上推廣應(yīng)用等等[4-7]。此外，子宮腺肌病誤診率較高，常被誤診為子宮肌瘤[8-9]。目前術(shù)后的病理學(xué)診斷仍是診斷子宮腺肌病的金標準[10]，但病理診斷通常在子宮全切術(shù)后進行，不適用于臨床的常規(guī)檢查。我們?nèi)孕枰獙ふ乙环N早期、特異性高、敏感性高的新標志物。血清miRNA的發(fā)現(xiàn)為這一問題解決提供了可能。

血清miRNA是一類涉及癌癥發(fā)展和進展的小型非編碼性內(nèi)源性RNA[11]。最早由Lee等[12]于1993年研究線蟲發(fā)育時發(fā)現(xiàn)。2008年Lawrie等首先報道了人血清中含有miRNA[13]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA廣泛存在于人體血清及組織中，且具有較高的穩(wěn)定性，miRNA通過多種途徑參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，并且腫瘤類型不同，miRNA的表達譜亦發(fā)生特異性變化[14-16]。因此，根據(jù)這些表達譜的特征性改變能夠?qū)δ承┘膊〉纳聿±憩F(xiàn)象進行分析從而進行診斷。提示miRNA在分子診斷中作為一類新的生物標志物，具有診斷子宮腺肌病的潛力。

本研究首先利用高通量測序技術(shù)對子宮腺肌病患者和正常對照的血清中的全部miRNAs進行篩選，選出與正常人相比患者血清中表達顯著變化的miRNAs，然后運用實時熒光定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）驗證初篩的miRNAs，檢測正常對照和患者血清中miRNAs的表達水平，最后利用ROC曲線分析和評價其診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

78例女性患者均為2015年3月～2018年3月在江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院的初診患者，年齡35～50歲，入選標準為患者在入院之前均未經(jīng)任何手術(shù)、藥物等治療?；颊呔腥訉m切除術(shù)且經(jīng)組織病理學(xué)確診。同時收集江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院健康體檢中心年齡、性別與患者基本匹配的78名健康人血清作為對照。

1.2 觀察指標及檢測方法

1.2.1 樣本收集及樣本資料

樣本收集均嚴格按照如下步驟進行：使用3 mL惰性分離膠促凝管收集患者和正常人全血，在室溫下4000 g離心10 min去除血細胞并收集血清，然后將收集的血清在4℃條件下，16 000 g離心3 min，進一步去除殘留的血細胞，離心后收集血清置于-80℃冰箱保存。隨后運用qRT-PCR技術(shù)在剩余樣本中對初篩miRNA分兩個階段進行復(fù)篩。運用高通量測序技術(shù)對血清miRNA進行初篩（包括30例子宮腺肌病患者，30例正常對照），隨后運用qRT-PCR技術(shù)在剩余樣本中對初篩miRNA進行驗證（包括48例子宮腺肌病組，48名正常對照組）。見表1、2。

1.2.2 儀器與試劑

1.2.2.1 實驗使用儀器 低速離心機（TD5，湖南赫西儀器裝備有限公司）、高速冷凍離心機（5424R，Eppendorf）、超速離心機（BE-6100，海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、渦旋儀（KB3，海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、PCR儀（2720，Applied Biosystems）、qRT-PCR儀（7300，Applied Biosystems）。

1.2.2.2 實驗試劑 氯仿（Simga）、異丙醇（南京化學(xué)試劑有限公司）、無水乙醇（南京化學(xué)試劑有限公司）、DEPC水（Simga）、醋酸鈉（Ambion）、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Applied Biosystems）、Taqman@MixⅡ（Applied Biosy？鄄stems）、miRNA反轉(zhuǎn)錄引物及探針（Applied Biosystems）。

1.2.3 高通量測序

總RNA樣本檢測合格后，首先對總RNA進行片段選擇，通過膠分離技術(shù)收集18～30 nt或15～35 nt的RNA片段；在分離得到的RNA片段的兩端分別連接上接頭，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行PCR擴增建立測序文庫；最后，對檢驗合格的測序文庫進行Illumina HiSeq高通量測序，采用SE50測序策略。

1.2.4 血清miRNA提取方法

將100 μL樣品加入到300 μL水中，充分混勻后加入200 μL（pH = 4.7～5.5）酸性酚，劇烈震蕩混勻后加入200 μL氯仿，再次充分震蕩后16 000 g室溫離心15 min。小心吸取上清液（約400 μL）加入到800 μL異丙醇中，再加入pH = 5.2，3 mol/L醋酸鈉40 μL，充分混勻后-20℃靜置1 h后，16 000 g，4℃離心20 min。充分棄上清后，加入75%乙醇1 mL，輕柔顛倒數(shù)次，16 000 g，4℃離心20 min。充分棄上清，室溫干燥后，加入20 μL DEPC水溶解沉淀，-80℃低溫冰箱保存。

1.2.5 RT-qPCR檢測miRNA的表達

1.2.5.1 制備RT-PCR反應(yīng)體系 100 mmol/L dNTPs 0.15 μL，Multi Scribetm RT 1.00 μL，10×TR 1.5 μL，RNA Inhibitor 0.19 μL，H2O 7.16 μL，RNA 2 μL，共計15 μL。反應(yīng)條件：30 min，16℃；30 min，42℃；5 min，85℃。

1.2.5.2 制備RT-qPCR反應(yīng)體系 TaqMan@Small RNA Assay（20×）1.0 μL，Product from RT reaction 2.0 μL，TaqMan@Unibersal PCR Master MixⅡ（2×）10 μL，H2O 7 μL，cDNA 2 μL，共計20 μL。反應(yīng)條件：2 min，50℃；95 min，10℃；15 min，95℃；60 min，60℃。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；ROC曲線下面積和選定的cut off值進行計算計算miRNA的特異性和靈敏性。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 高通量測序

統(tǒng)計本次項目全部樣本的差異表達miRNA上下調(diào)的個數(shù)，得到如下統(tǒng)計結(jié)果：在子宮腺肌病和正常對照血清中，上調(diào)的miRNA個數(shù)為316個，下調(diào)的個數(shù)為24個。

2.2 根據(jù)高通量測序結(jié)果挑選的microRNA

在AM組或者NC組中拷貝數(shù)至少大于200，兩組比較時變化倍數(shù)大于等于5倍的miRNA被挑選出來。根據(jù)以上原則挑選了12個miRNAs進一步驗證。見表3。

2.3 qRT-PCR技術(shù)對高通量測序驗證結(jié)果

采用qRT-PCR技術(shù)在48例子宮腺肌病患者和48例對照組中對高通量測序顯示的部分上調(diào)miRNA進行了驗證。驗證結(jié)果顯示，有3種miRNA包括miR-22-3p、miR-182-5p、miR-103a-3p與高通量測序的變化趨勢一致，在子宮腺肌病患者血清中顯著性升高，結(jié)果見圖1。由圖1可知，miR-22-3p、miR-103a-3p、miR-182-5p在子宮腺肌病患者中表達量較對照組顯著升高，3個miRNAs的變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），為了分析血清miRNA對子宮腺肌病診斷的特異性和靈敏性，評估其臨床價值。分別繪制3種血清miRNA的ROC曲線，miR-22-3p的AUC值為0.900（95%CI：0.839～0.961），miR-103a-3p的AUC值為0.828（95%CI：0.747～0.909），miR-182-5p的AUC值為0.844（95%CI：0.766～0.921）。見圖2。

3 討論

目前國內(nèi)外學(xué)者對miRNAs與子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)系研究較多。子宮內(nèi)膜異位癥是指子宮內(nèi)膜組織異位生長在子宮腔以外的部位，且具有惡性生物學(xué)行為，如細胞增生、侵襲和轉(zhuǎn)移等[17]。研究發(fā)現(xiàn)[18-19]，子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展與miRNA的表達失調(diào)有關(guān)。盡管子宮內(nèi)膜異位癥與子宮腺肌病在病理、生理及疾病進展方面顯著不同，但二者在臨床表現(xiàn)、疾病發(fā)生機制等方面有相似之處。然而，miRNAs與子宮腺肌病研究關(guān)系的研究較少。因此，miRNA與子宮腺肌病的關(guān)系值得深入研究。

本實驗中，我們首先運用高通量測序技術(shù)對子宮腺肌病患者疾病發(fā)生發(fā)展過程中的全部血清miRNA表達譜進行了檢測，發(fā)現(xiàn)340種miRNA在子宮腺肌病患者與對照之間存在差異（316種上調(diào)，24種下調(diào)），這就提示，子宮腺肌病發(fā)生發(fā)展過程中血清miRNA表達譜的顯著不同提示血清miRNA可以作為子宮腺肌病發(fā)生發(fā)展進程的生物標志物。隨后我們運用實時熒光定量PCR技術(shù)對篩選出來的12個上調(diào)miRNA進行更多樣本的驗證，發(fā)現(xiàn)子宮腺肌病患者血清中有3種高表達miRNA，包括miR-22-3p、miR-103a-3p、miR-182-5p。ROC曲線分析顯示3個miRNAs的AUC的變化范圍0.844～0.900。miR-22-3p、miR-103a-3p、miR-182-5p的AUC分別是0.900（95%CI：0.839～0.961）、0.828（95%CI：0.747～0.909）、0.844（95%CI：0.766～0.921）。這些結(jié)果提示了這3個miRNAs具有診斷子宮腺肌病的潛力，具有作為子宮腺肌病分子診斷標志物的可行性。

盡管目前血清miRNA作為生物標志物潛能成為新的分子生物學(xué)研究熱點，但其來源尚不清楚。有研究證實[20]miRNA的主動分泌有兩種形式，一種是游離的miRNA直接被細胞分泌；另一種則是miRNA先被選擇性地包裝在外泌體、微小體等膜性結(jié)構(gòu)中，以包裹的形式從細胞分泌至胞外進入血循環(huán)。miRNA不同的分泌機制提示了這些miRNA很可能起源于細胞生長的不同階段，并且因此有不同的命運和功能，目前還沒有直接的證據(jù)表明，仍然需要進一步的研究。

本次研究證實miR-22-3p、miR-103a-3p、miR-182-5p可以作為子宮腺肌病早期診斷標志物，但仍需大樣本、規(guī)范性的研究，以使研究結(jié)果更完善、更具有說服力。此外，這3個血清miRNA能否成為子宮腺肌病鑒別診斷的標志物，仍需要臨床經(jīng)驗的積累和研究探索。

[參考文獻]

[1] Seikkula J，Niinim？覿ki M，Suvitie P. Adenomyosis-diagnostic and therapeutic challenge [J]. Duodecim，2016，132（9）：836-843.

[2] Guy MM，Ying WZ，Yan WX，et al. Effectiveness of treatment for infertility using clinical investigation of laparoscopy cytoreductive surgery combined with gestrinone in adenomyosis [J]. Gynecol Surg，2016，13（4）：451-456.

[3] Struble J，Reid S，Bedaiwy MA. Adenomyosis：a clinical review of a challenging gynecologic condition [J]. J Minim Invasive Gynecol，2016，23（2）：164-185.

[4] 洛桑丹倫.分析比較經(jīng)腹彩超及經(jīng)陰道彩超診斷子宮肌瘤的臨床價值[J].影像研究與醫(yī)學(xué)應(yīng)用，2017，1（9）：102-103.

[5] 傅仲帶，盧葦，賴紅英，等.分析比較經(jīng)腹彩超及陰道彩超診斷子宮肌瘤的臨床價值[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2016，37（07）：914-915.

[6] 王晶，宮寧，文穎.超聲造影在常見婦產(chǎn)科相關(guān)疾病中的應(yīng)用探討[J].影像研究與醫(yī)學(xué)應(yīng)用，2018，2（3）：61-63.

[7] 徐愛云，桂濤，陶佳，等.子宮腺肌病影像學(xué)診斷進展及展望[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2018，27（2）：222-225.

[8] 王智彪，郎景和.高強度聚焦超聲消融與子宮腺肌病[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2016，51（9）：708-709.

[9] 馮濤，陳群英.腹部超聲與陰道超聲在子宮腺肌病中的診斷價值[J].中國臨床研究，2016，29（1）：115-117.

[10] 韓璐，李晴晴.宮腔鏡技術(shù)在子宮腺肌病診治中的應(yīng)用進展[J].婦產(chǎn)與遺傳：電子版，2017，7（1）：31-35.

[11] Li J，Li Q，Huang H，et al. Overexpression of miRNA-221 promotes cell proliferation by targeting the apoptotic protease activating factor-1 and indicates a poor prognosis in ovarian cancer [J]. Int J Oncology，1899，50（4）：1087-1096.

[12] Lee RC，F(xiàn)einbaum RL，Ambros V. The C. elegans heteroc？鄄hronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense com？鄄plementarity to lin-14 [J]. Cell，1993，75（5），843-854.

[13] Saydam O，Shen Y，Würdinger T，et al. Downregulated microRNA-200a in meningiomas promotes tumor growth by reducing E-cadherin and activating the Wnt/β-catenin signaling pathway [J]. Mol and Cell Biol，2009，29（21）：5923-5940.

[14] Gulino R，F(xiàn)orte S，Parenti R，et al. MicroRNA and pediatric tumors：Future perspectives [J]. Acta Histochem，2015， 117（4-5）：339-354.

[15] Shi J. Considering exosomal miR-21 as a biomarker for cancer [J]. J Clin Med，2016，5（4）：42.

[16] Gomes BC，Rueff J，Rodrigues AS. MicroRNAs and cancer drug resistance [J]. Methods Mol Biol，2016：137-162.

[17] Mavrelos D，Saridogan E. Treatment of endometriosis in women desiring fertility [J]. J Obstet Gynecol India，2015， 65（1）：11-16.

[18] Marí-Alexandre J，Sánchez-Izquierdo D，Gilabert-Estellés J，et al. miRNAs regulation and its role as biomarkers in endometriosis [J]. Int Mol Sci，2016，17（1）.pii：E93.doi：10.3390/ijms17010093.

[19] Cho SH，Mutlu L，Grechukhina O，et al. Circulating mic？鄄roRNAs as potential biomarkers for endometriosis [J]. Fertil Steril，2015，103（5）：1252-1260.

[20] Mateescu B，Batista L，Cardon M，et al. miR-141 and miR-200a act on ovarian tumorigenesis by controlling oxidative stress response [J]. Nat Med，2011，17（12）：1627.

（收稿日期：2018-03-26 本文編輯：任 念）